蛋白質純化
其他連結
鹽溶及鹽析
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蛋白質純化 |
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鹽溶及鹽析 |
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蛋白質純化 |
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鹽溶及鹽析 |
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．鹽溶 |
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．鹽的影響 |
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．鹽析 |
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．水籠 |
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■ 酵素化學實驗 |
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圖 例 |
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本網頁內容是酵素化學實驗之一部份。 |
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| P1A1 |
▲ TOP |
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■ 酵素純化方法 |
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圖 例 |
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最基本的純化方法與純化策略。 |
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| P1A2 |
▲ TOP |
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■ 蛋白質的表面分布 |
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圖 例 |
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蛋白質分子表面的極性或非極性分布情形不一。 |
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每個蛋白質分子表面所裸露出來的胺基酸機團，會影響到整個蛋白質的性質，也會決定我們如何去純化此一蛋白質。通常，其表面上有極性區域，也有非極性區域；而極性區域又可能帶有正或負電荷，通常這些帶電性基團，對蛋白質的活性都有很大的重要性。 |
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| P1A3 | ||
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■ 質子的特性 |
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圖 例 |
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質子可以在各種極性基團之間遊走。 |
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質子 proton 是宇宙中的奇妙粒子，這是一顆光溜溜的帶正電粒子；當氫丟掉一個電子後，即可得到質子，因此寫作 H+。 質子可以隨時附著到一個帶有電子密度的基團 (如胺基)，使該基團多帶 了一個正電 (-NH3+)。質子也很容易由某一個基團脫出 (如羧基)，而使該基團成為帶負電 (-COO-)。 在水環境中，質子數量的多寡就是酸鹼度的指標 (pH)，會影響分子上各種基團的帶電性質。而巨分子上這些電荷性質的變化，就是生物化學裡許多反應機制的根本肇因。 |
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| P1A4 | ||
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■ 環境影響分子的帶電性質 |
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圖 例 |
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環境 pH 的變化會造成分子所帶淨電荷的改變。 |
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通常一個蛋白質分子上都會帶有電荷，有正電荷、也有副電荷，這些正、負電荷的淨值，即為此蛋白質所帶的 淨電荷；蛋白質的淨電荷可能為正、也可能為負，在某 pH 下蛋白質的淨電荷可能為零，則此 pH 稱為此蛋白質的『等電點』(isoelectric point, pI)，一個蛋白質的 pI 通常不會改變。 當環境的 pH 大於某蛋白質的的 pI (如上圖某蛋白質的 pI = 6，環境 pH = 9)，則此蛋白質的淨電荷為負；反之則為正值。另外，環境的 pH 離其 pI 越遠，則其所帶的淨電荷數目將會越大；越接近 pI 時，所帶淨電荷變小，最後在其 pI 處淨電荷為零。因此，蛋白質溶液的 pH 要很小心選擇，以便使該蛋白質帶有我們所需要的淨電荷，或者不帶有淨電荷。 |
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| P1A5 | ||
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■ 等電點下的分子容易凝聚 |
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圖 例 |
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蛋白質的 等電點 是決定其 帶電性質 的重要指標。 |
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蛋白質的帶電性質決定於其環境的酸鹼度，當環境的 pH = 6 時，則某 pI = 5 的蛋白質將會帶負電，因為環境的 pH 高於其 pI。 這幾乎是蛋白質最重要的性質，將會影響其分子構形、酵素活性，以及很多實驗上的操作，如離子交換法、電泳、等電焦集法、鹽溶等。 若環境的 pH = pI，則此蛋白質的淨電荷將為零，因為沒有來自相同電荷的斥力，此種蛋白質間將會互相凝聚起來，漸漸沈澱下來。 因此，有些蛋白質可以在其自身的等電點下沈澱，也是一種純化的方法；但須注意，也有些蛋白質在其 pI 下沈澱之後，就不容易再溶解回來，也會因此而損失；蔗糖合成脢就是如此。 |
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| P1A6 | ||
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■ 提高鹽濃度增加蛋白質溶解度 |
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圖 例 |
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蛋白質的 溶解度，受到溶液中的 酸鹼度 及 離子濃度 影響很大。 |
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當溶液中的酸鹼度逐漸接近某蛋白質的 等電點 (例如 5.2) 時，此蛋白質的溶解度會漸漸下降，這是因為蛋白質分子上的淨電荷漸漸趨向零，蛋白質分子之間的 互斥力降低 所致； 此外，這個淨電荷為零的蛋白質分子上，事實上還是有數目相同的正負電荷，這些正負電荷對互相吸引也有貢獻。可以利用這種特性，來沈澱出某已知等電點的蛋白質。 但若溶液中的 鹽濃度 漸漸提高，則蛋白質的溶解度也會提高，這是因為鹽所解析出來的大量正負離子，會阻斷上述正負電荷間的相吸，因而使得蛋白質溶入水中。當然，越遠離此蛋白質的等電點，這種溶入現象越是顯著。 上面兩圖所說明的，都是這種鹽溶的性質，只是座標表現方式不同，所顯現出來的表達方式稍有不同。 |
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| P1A7 | ||
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■ 鹽溶 |
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圖 例 |
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提高鹽濃度 (NaCl) 會增加蛋白質的溶解度。 |
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蛋白質有時會以離子鍵吸引在一起，因而降低其溶解度；尤其當蛋白質溶在與其 pI 相當的 pH 中 (請見上面兩圖)。 但若提高鹽濃度，Na+ 或 Cl- 離子會把蛋白質間的離子鍵隔離開來，因而增加蛋白質的溶解度。 |
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| P1A8 | ||
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■ 鹽的影響 |
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圖 例 |
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鹽溶與鹽析的機制完全不相同，而且無關。 |
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從表面的現象看來，『鹽溶』是加鹽使蛋白質融入水中，『鹽析』是加鹽使蛋白質沈澱出來。兩者所加的鹽類不同，其作用機制也毫無關係。但這兩者是最簡單的蛋白質分離方法，不但經濟而且方便，可以應用在很多實驗。 |
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| P1A9 | ||
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■ 鹽析 |
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圖 例 |
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提高鹽濃度 (硫酸銨) 會降低蛋白質的溶解度。 |
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與鹽溶剛好相反，在蛋白質溶液中加入硫酸銨，會使得蛋白質的溶解度下降，因而沈澱出來。因為硫酸銨所解離的離子容很大，所帶的電子數也多 (NH4+, SO42-)，因此當其溶入水中時，會吸引大量水分子與這些離子水合。 蛋白質分子表面多少有一些較不具極性的區域，水分子會在這些非極性區的表面聚集，形成類似『水籠』的構造 (請見下圖)，以便把蛋白質溶入水中。一旦蛋白質溶液加入硫酸銨，後者吸引了大量水分子，使水籠無法有效隔離蛋白質的非極性區，造成這些非極性區之間的吸引，因而沈澱下來。 因此，分子表面上若有越多的非極性區域，就越容易用硫酸銨沉澱下來。 |
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| P1A10 | ||
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■ 水籠 |
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圖 例 |
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水分子會在非極性物質的外圍，形成一個像籠子一樣的包圍區。 |
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若非極性物質硬是要溶入水溶液中，則水分子會在這些非極性物質的表面，形成一層比較不活動的隔離層，把非極性物質隔離起來，稱為 clathrate (水籠)。通常水分子之間，也會以氫鍵互相連結，這些氫鍵會不斷斷裂，然後又很快形成。而水籠的水分子之間所形成的氫鍵，則較為固定，無法自由去除或生成。 |
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| P1A11 | ||
▼ 下一小節︰ 膠體過濾法
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構 造 ． 純 化 ． 分 析 |
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Protein/Purification/P1 |
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本網頁最近修訂日期： 2001/06/30 |
