蛋白質分析
其他連結
酵素活性分析
|
|
||||
|
|
蛋白質分析 |
其他連結 |
||
|
|
||||
|
酵素活性分析 |
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
蛋白質分析 |
|
|
|
酵素活性分析 |
|||
|
■ 酵素反應及偵測方法 |
||
|
圖 例 |
||
|
|
||
|
測定酵素活性的基本原則，以及分析生成物的方式。 |
||
|
通常酵素活性的測定，都要使用較大量的基質，以便把反應推向產生所要生成物的方向，以便測定生成物的多寡，推算酵素活性。可惜，並不是所有的生成物都可以用物理、化學或其他方法偵測得到，因此都要進一步行耦合反應 coupling reaction，把生成物再變成可以方便測得之物質。 |
||
| A2A1 | ||
|
■ 酵素活性的測定 |
||
|
圖 例 |
||
|
|
||
|
酵素活性測定的四個要點： SEPt |
||
|
當設計酵素的反應時，請考慮四個重要因素，可以用 SEPt 四個字母來代表： S (Substrate) 要使用大量基質，以便把反應推向右邊，通常是十倍的 Km。 E (Enzyme) 酵素量要適中，太高或太低都不好；但是通常酵素量都是待測值。 P (Product) 生成物要能夠方便偵測，否則要進行耦合反應，變成可測量的物質。 t (time) 反應的時間要恰當，並且固定下來；而酵素的反應速率 vo = P / t。 另外，要考慮反應溶液中的 pH 及溫度，不過這兩個因素通常也都固定。 |
||
| A2A2 | ||
|
■ GUS 酵素活性的測定 |
||
|
圖 例 |
||
|
|
||
|
GUS 可使用人造基質，生成物之中有黃色物質產生。 |
||
|
GUS 即 glucuronidase，可水解 glucuronic acid 在一號碳上面的衍生物；因此可對上面的 pNPG 人造基質，進行水解，產生 glucuronic acid 及黃色的 p-nitrophenol。 |
||
| A2A3 | ||
|
■ 澱粉磷解脢的催化反應 |
||
|
圖 例 |
||
|
|
||
|
澱粉磷解脢催化澱粉的可逆性磷解反應 |
||
|
澱粉磷解脢以澱粉為基質，可在澱粉的端點 (非還原端)，以磷解的方式 (加上磷酸並分解之)，切出磷酸葡萄糖單位 (Glc-1-P)；但此反應為可逆，澱粉磷解脢也可以在澱粉的非還原端，結合 Glc-1-P 加上一個葡萄糖。因此，分析澱粉磷解脢的催化活性，可以監視 Glc-1-P 或磷酸的消長 (生成或消失)。 |
||
| A2A4 |
▲ TOP |
|
|
■ 澱粉磷解脢活性分析的問題 |
||
|
圖 例 |
||
|
|
||
|
澱粉磷解脢的活性分析過程，有一些有趣但須注意的問題。 |
||
|
上述的澱粉磷解脢活性分析方法，會受到其他酵素的影響。例如，beta amylase (BA) 也是以澱粉為基質，可以快速水解澱粉，因此會強奪基質，使得澱粉磷解脢的活性看來好像被抑制。而澱粉磷解脢的另一個基質或產物，Glc-1-P 也可能會被磷酸脢 (Ph) 所水解，很容易造成活性的誤判 (上圖 B)。 很幸運的，澱粉磷解脢的合成方向反應，可以在電泳上進行，只要在原態電泳進行後，膠片浸入寡糖引子及 Glc-1-P，澱粉磷解脢色帶就會開始合成澱粉，並可以碘溶液使澱粉呈色 (上圖 A)。 |
||
| A2A5 |
▲ TOP |
|
▼
下一小節︰ 膠體電泳法
|
構 造 ． 純 化 ． 分 析 |
|
|
|
Protein/Analysis/A2 |
|
本網頁最近修訂日期： 2001/06/30 |
