BCT 第四章 2

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4.2	蛋白質檢定方法	回目錄

4.2.1

蛋白質定量分析

Bradford 的 dye-binding method 是利用 Coomassie brilliant blue G-250 (CBG) 可與蛋白質結合而變色的特性來定量 (Bradford, 1976)；若試樣中的蛋白質量較多，則結合到蛋白質而變色的 CBG 也多，因而呈色較深。下例是以一組標準蛋白質為對象，製作一條蛋白質量與吸光度的標準校正線。

儀器用具：

ELISA 光度計 (Dynatech MRX) 可在一分鐘內測完一片滴定盤

微量滴定盤 (microtiter plate, Nunc F96 Maxisorb 442404)

Micro test tubes, 大頭針或噴火槍

藥品試劑：

(a) Buffer A-0

(b) BSA 標準品 (Bio-Rad, bovine serum albumin, 100 mg/mL)

(d) Dye Reagent (Bio-Rad 500-0006) 先以水稀釋四倍備用

u以染料 Coomassie brilliant blue G-250 配製的溶液，勿與膠體電泳染色用的 CBR-250 混淆，各有其使用上的特色，不要互用。

標準品及樣本：

標準品系列：

使用小試管準備一組 BSA (b) 標準品的系列稀釋：

Label	BSA (b)	Buffer A-0	Final Conc.
#5	500 mL	0 mL	100 mg/mL	混合均勻
#4	400 mL	100 mL	80 mg/mL	混合均勻
#3	300 mL	200 mL	60 mg/mL	混合均勻
#2	200 mL	300 mL	40 mg/mL	混合均勻
#1	100 mL	400 mL	20 mg/mL	混合均勻
#0	0 mL	500 mL	0 mg/mL	混合均勻

u配製一定要精準，否則校正直線不會很準確；各種試劑的添加，若自稀往濃取樣，則可以不用換吸管頭。

未知樣本：

再以上述 unknown BSA (c) 準備兩種未知樣本：

Label	未知樣本 (c)	Buffer A-0	Final Conc.
X1	500 mL	0 mL	2×
X2	250 mL	250 mL	1/2×

一般樣本：

1) 通常由色析法所收集到的各分劃樣本，都可以直接進行蛋白質定量分析；但若其中含有某些干擾因子 (如含有 Triton )，或樣本的濃度太濃，都必須將樣本稀釋後再測。

2) 同一樣本的若干不同稀釋濃度，所測出來的最終蛋白質濃度會有差異，通常是以稀釋度大者較為準確。

方法步驟：

1) 每槽先加好 50 mL 標準品 (#0, #1 .... #5) 或未知樣本 (X1, X2)，以二重複加入 96 孔滴定盤中，如圖 4.3 所示。

F4.3　

圖 4.3 微量滴定盤的使用

2) 每槽再加入200 mL Dye-Reagent (d)，在全部樣本槽加完前，不要中斷添加；同時小心避免氣泡產生。

u本步驟是實驗成敗的關鍵！

3) 輕拍滴定盤一側，使添加的各成份均勻混合，注意 Dye-Reagent 密度較大，很容易沉積在下方而分層。若還有小氣泡，小心以大頭針刺破，大量時可用噴火槍火燄燒破。

4) 靜置室溫 10 min。

5) 以 ELISA reader 測量 570 nm (或 595 nm) 的吸光值。

註解討論：

a. 在作圖紙上畫出標準品的校正線，並決定未知樣本的濃度 (如圖 4.4 )。

b. 請說明本分析方法的原理，並特別以蛋白質構造來說明。

c. 一般緩衝液或試劑中，何種添加物會影響 Bradford 法的呈色？

d. 請列出本分析方法的各操作步驟中，哪些會影響分析的準確度？

e. 還有哪些蛋白質的定量方法？並請比較其優劣點。

F4.4

圖 4.4 繪製標準品校正線

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4.2.2

酵素活性分析法

表現出來的酵素 GUS 可以水解其基質衍生物 pNPG，所產生的黃色生成物 p-nitrophenol，可供活性測定 (Jefferson et al, 1986)；催化反應如下式：

儀器用具：

ELISA 光度計 (Dynatech MRX)

微量滴定盤 (microtiter plate, Nunc F96 Maxisorb 442404)

藥品試劑：

基質溶液 (GUS reaction buffer)：

pNPG (p-nitrophenyl b-D-glucuronide)	(Sigma N-1627)	31.5	mg

溶於 Buffer A-0 100 mL

終止液 (stop buffer)： 2.5 M 2-amino-2-methyl propanediol (Sigma A-9754)

方法步驟：

1) 吸取 20 mL 的蛋白質樣本，小心注入微量滴定盤中，避免氣泡產生。

2) 每一樣品槽加入 200 mL 基質液，混合均勻；可用燒熱的接種環去除氣泡。

3) 靜置約 1~2 min，顏色開始加深，然後加入 30 mL 終止液。反應時間的長短，要以樣本中的酵素活性大小來做調整。因為我們只測定色析法各分劃的相對酵素活性，因此並不加終止液。

4) 以 ELISA 光度計測定波長 415 nm 之吸光值。

酵素活性單位的測定：

a. 以上步驟，只可測定 GUS 活性的相對大小，對色析法所得到的各個分劃進行偵測，相當方便，但並非酵素絕對活性單位的測定方法。

b. 若要測定酵素的絕對活性單位，要使用最適當的酵素用量，使酵素在反應一段固定的時間後，其生成物的呈色吸光度，落在光度計的可測範圍之內；然後計算此段時間內，每分鐘所產生的吸光度增加量，轉換成生成物的莫耳數，即可求得其真正的活性單位。

c. 因此酵素的活性單位定義為：每分鐘所能催化生成物之 mmole 數。

註解討論：

a. 實驗之前先規畫好各樣本在滴定盤上的分佈位置，並做好標示。

b. 以微量滴定盤進行活性測定時，能否使得每一槽的反應時間一致？

c. 化學反應最重要的操作要點之一，是要使所加入的各種成份均勻混合，在使用微量滴定盤時，你如何使所加的液體混合均勻？

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4.2.3

膠体電泳法

電泳的高解析力使其成為生化技術中最有效力的一門分析利器，以下簡略說明各種電泳的形式及其應用。

a. 不連續膠體電泳 (disc-PAGE) 是以原態蛋白質進行電泳，一般用作純度檢定或活性分析，SDS-膠體電泳 (SDS-PAGE) 則用為次體分子量之測定，梯度 (gradient) 電泳則可輔助原態蛋白質分子量之決定。結合 SDS 及梯度兩種特性的 SDS-梯度膠體電泳，其解析力最高。

b. 電泳形式早期使用圓柱狀膠體，演變成直立式的平板膠片 (16 × 18 cm)，最後改成迷你電泳膠片 (8 × 10 cm)，電泳時間只約一小時，而其解析力不變。現在柱狀膠體電泳只用在等電焦集法，以進行二次元電泳；而大型平板電泳則多用在製備式電泳，一般電泳大多以迷你膠片進行之。

c. 膠體材質的種類很多，但用在蛋白質者則以聚丙烯醯胺 (polyacrylamide) 為主；聚丙烯醯胺電泳是蛋白質應用最廣的電泳分析方式。也有少數使用洋菜膠體 (agarose gel)，多用在測定 pI 較廣的異構脢酵素群。

d. 泳動率：在 pH 8.8 的電泳條件下，大部分 pI 小於 8.8 的分子均能往正極泳動；蛋白質的泳動率與所帶電荷成正比，而與其分子量成反比；若分子量一樣，但形狀越不規則，或體積越鬆散者，泳動率越小。

e. SDS 電泳雖然分有原態的 disc- 及變性的 SDS-PAGE 兩種，但兩者除了 SDS-PAGE 在整個系統含有 0.1% SDS 之外，其餘完全相同，且其鑄膠及電泳方法均屬大同小異。

f. 原態 disc-PAGE 中的樣本蛋白質，因電泳系統中不含界面活性劑 SDS，其活性多能保持，可以在膠體上做活性染色。若目標酵素沒有方便的活性染色法，則可把膠體一片一片切下，做每一片膠體的活性測定。

儀器用具：

迷你電泳槽 (Hoefer Mighty Small SE 250)

鑄膠器 (Hoefer SE 245 可鑄造兩片迷你膠片)

鑄膠三明治組合： (每一片膠片)

(1) 玻璃板	(8 × 10 cm)	小心易破裂 1 片
(2) 白色氧化鋁板		小心易破裂 1 片
(3) Spacer 間隔條	(0.75 mm)	小心易遺失 2 條
(4) Comb 樣本齒模	(0.75 mm)	小心易遺失 1 隻

電泳樣本專用微量吸管頭 (尖端較長且扁)

供電器 (可供應 200 V 電壓及 500 mA 電流者均可使用)

塑膠染色盒 (比膠片稍大且要能密蓋)

旋轉搖盪器 (rotary shaker)

看片箱 (light box)

護貝機及護貝膜 (可護貝如膠片大小者)

膠片乾燥組合：

(1) 玻璃板 (至少要比膠片大，約 12 × 15 cm，厚度約 3~4 mm)

(2) 玻璃紙 (Cellophane, 年糕紙，比上面玻璃板每邊多出 5 cm 以上)

以下聚丙烯醯胺膠體電泳所使用的試劑及方法乃根據 Laemmli (1970) 的方法。

藥品試劑：

由於鑄膠溶液非常重要且多樣，因此下面把所有電泳溶液的配置方法仔細列出，希望能在每一個實驗室成功進行電泳；但使用者一定要明白其配製的原理與各種濃度的算法，而不是只會依配方泡製而已。

A 液：丙烯醯胺液 (total 30%, cross-linking 2.6%)

丙烯醯胺	(acrylamide, Merck 10784)	29.2	gm
Bis 架橋劑	(Sigma M-7256)	0.8	gm

加純水溶解至 100 mL
u本步驟是 A 液也有商品已經配置好溶液者，本實驗課程採用 Ameresco 的 40% 溶液 (T40%, C2.6%)，配法有些變動，請特別注意。
uBis 是 N',N'-methylene-bis(acrylamide) 的簡稱，可看成是兩分子 acrylamide 連在一起，作為架橋物，以便成為立體的膠體。
u以 30℃ 加熱助溶，有不溶物質須過濾去除；若丙烯醯胺品質不佳或久貯，在溶成 100 mL 後，可加一些離子交換樹脂 Dowex MR-3 攪拌，放過夜並過濾後置 4℃ 保存。
u注意 acrylamide 溶液有神經毒性！不要直接接觸，凝膠後毒性消失，但膠體無法達到百分之百凝膠，因此也要小心處理膠片。

B 液：分離膠體緩衝液 (running 或 separation buffer)

Tris	(Tris base, 1.5 M)	90.8	gm
TEMED	(Sigma T-8133)	1.8	mL

溶入 300 mL 水，以 l M HCl 119 mL 調 pH 到 8.8 再加水至 500 mL
uTEMED (tetramethylenediamine) 可幫助自由基傳導，是催化劑。

C 液：焦集膠體緩衝液 (stacking buffer)

Tris	(Tris base, 0.5 M)	6.0	gm
TEMED	(Sigma T-8133)	0.4	mL

溶入 40 mL 水，加 l M HCl 47 mL 調 pH 至 6.8，加水至 100 mL

D 液：電泳緩衝液 (chamber buffer)，5× 溶液

Tris	(Tris base, 0.05 mM × 5)	30.3	gm
甘胺酸	(glycine, 0.38 M × 5)	142.6	gm

溶入 800 mL 水，pH 調到 8.3 後再加水至 1 L。使用時稀釋 5 倍。
u甘胺酸是電泳緩衝液的主要分子，是造成電泳樣本焦集的原因；近來多改用 boric acid (下面 F 液)，應自行試用何者為佳。

E 液： SDS-PAGE 樣品溶液，2× 溶液

Tris	(Tris base, 125 mM × 2)	3.0	gm
EDTA·2Na	(2 mM × 2)	14.8	mg
SDS	(2% × 2)	4.0	gm
b-mercaptoethanol	(5% × 2, Sigma M-6250)	10.0	mL

加水 80 mL 溶之，pH 調到 6.8，再加水至 100 mL

F 液：通用電泳緩衝液，5× 溶液

Tris	(Tris base, 90 mM × 5)	54.5	gm
Boric acid	(80 mM × 5)	24.8	gm
EDTA·2Na	(2.5 mM × 5)	4.7	gm

加水 800 mL 溶之，pH 調到 8.4，再加水至 1,000 mL
u使用時稀釋 5 倍。本溶液在 disc- 或 SDS-PAGE 均通用，後者要加 SDS 至 0.1%。

SDS 水溶液 (10%)

uSDS 粉末很輕，揚起來很容易吸入肺部，在肺泡溶解產生界面活性的作用，使得肺部細胞無法進行氧分子交換，非常危險。

APS 溶液 (過硫酸銨, 5%)：

APS	(ammonium persulfate, Bio-Rad 161-0700)	50	mg

溶於 l mL 水中，使用前才配製好，隔日不可再用。
uAPS 是自由基 (free radical) 的產生者，可誘發 acrylamide 的連鎖聚合反應，因此是整個凝膠反應的起始者。
u冬天可增至 10%，夏天可減至 2%。注意 APS 固體很容易分解，應密蓋貯於乾燥皿；鑄膠無法凝結的毛病，多出自 APS 的品質不良。

追蹤染料 (tracking dye)：

Bromophenol blue	(Sigma B-6896)	l	mg

溶於 5 mL 水，再加 5 mL 甘油均勻混合。
u加在樣本蛋白質中，可增加樣本密度並賦予顏色，方便目視以注入膠片的樣本槽。

染色液 (CBR 染液)：

Coomassie brilliant blue R-250	(CBR, Sigma B-0149)	1	gm

溶於 250 mL 水後，再加入 250 mL 甲醇及 50 mL 醋酸混合均勻，充分溶解 CBR，若有不溶物質，則須過濾後裝瓶密蓋。
uCoomassie blue 有許多種不同的相關化合物，不要取用作為蛋白質定量用的 Coomassie blue G-250 來染色，效果稍差。

脫色液 (20% 甲醇及 10% 醋酸)：

	在一 1 L 量筒中，先倒入 200 mL 甲醇及 100 mL 醋酸，再加水至 1 L，混合均勻後密蓋備用。
	u甲醇濃度可提高到 30%，則可增加脫色速度，但小心脫色過度。

標準分子量組合︰

Pharmacia 有高低兩種分子量的標準蛋白質組合，專供 SDS-PAGE 使用：

高分子量組： Thyroglobulin (669kD, 330 kD), ferritin (440 kD, 220 kD, 18.5 kD), catalase (232 kD, 36 kD), albumin (67 kD)

低分子量組： Phosphorylase (94 kD), albumin (67 kD), ovalbumin (43 kD), carbonic anhydrase (30 kD), trypsin inhibitor (20 kD), lactalbumin (14.4 kD)

另外 Novex 有預先染好藍色的 SeeBlue (LC5625) 標準蛋白質組合，除了一般電泳外，更可用在轉印，檢查轉印是否成功：

SeeBlue: Myosin (250 kD), albumin (98 kD), glutamic dehydrogenase (64 kD), alcohol dehydrogenase (50 kD), carbonic anhydrase (36 kD), myoglobin (30 kD), lysozyme (16 kD), aprotinin (6 kD), insulin B chain (4 kD)

請注意： SeeBlue 的分子量標度會隨著膠體濃度的不同而有所變化。

方法步驟：

SDS 平板膠片鑄造︰

1) 整理出兩組玻璃片及白板鑄膠組合，先用酒精拭淨，並選擇合適的間隔條 (0.75 mm) 組合起來。

u請熟悉鑄膠三明治組合的正確組裝方式，以免灌入的膠液漏出來。

2) 三明治組合後直立站好，準備所要濃度的 SDS 膠體溶液如表 4.2。兩片 0.75 mm 厚的平板膠片約需 10 mL 分離膠體溶液，以及 5 mL 焦集膠體溶液。APS 液到最後才加入，未加 APS 以前可在真空中抽去溶液中的氧氣。

T4.2

表 4.2 配製兩片 0.75 mm 膠片所需膠體 (mL)

	分離膠體							焦集膠體
膠體百分比	5%	7.5%	10%	12.5%	15%	20%	1 0%	4%	4%
A 液 (40%)	-	-	-	-	-	-	5.0	-	0.5
A 液 (30%)	3.3	5.0	6.7	8 .3	10	13	-	0.66	-
B 液	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	-	-
C 液	-	-	-	-	-	-	-	1.24	1 .24
10% SDS 液	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.05	0.05
純水	11.4	9.7	8.0	6.4	4.7	1.7	9.7	2.95	3.11
APS 液	0.1	0.1	0.1	0.1	0 .1	0.1	0.1	0.1	0.1
總體積	20	20	20	20	20	20	20	5	5

u上表粉紅色部份為使用 40% A 液製備的配方。

3) 以上分離膠體各成份在小燒杯中混合均勻後，可直接沿著玻璃一側倒入鑄膠組合到預定高度 (約八成高)，勿陷住氣泡；再輕輕加上一層 isopropanol。也可使用滴管慢慢加入膠體，同樣勿注入氣泡。

4) 約 30 min 可凝結，以濾紙吸去 isopropanol，同法倒入焦集膠體溶液，要加到滿；儘快插入樣品槽齒模，注意不可有氣泡陷在膠體中。

u一般在凝膠完成後，膠體與所加的水層之間，會出現清楚的直線界面，但因為背景為白色，較不易觀察之。

5) 再度凝結後取下齒模即可使用。若不立刻使用，則把整個膠片組合用保鮮膜包好，膠面上方加一水層，勿使乾掉，在 4℃ 約可放 1~2 週。

電泳方法︰

6) 若膠片組合保存於 4℃，則要等待膠片完全回復室溫，才架到電泳槽。

u膠片一定要完全回溫，否則在進行電泳時，玻璃會因熱脹而破裂。

7) 取 F 液稀釋成一倍溶液，並加 SDS 成為 0.1%；先倒入下方的正極槽，注意不可有氣泡黏在膠體，然後倒入上方的負極槽。用微量針筒或微量吸管一個一個清洗樣本槽，除去殘留在槽內的膠體 (刷牙)。

u刷牙的動作很重要，而且要徹底，否則注入樣本時，會有大麻煩。又因為白色氧化鋁板乃白色背景，不容易看出樣本槽的位置，可用 Hoefer 所附的透明樣本槽位置模板，作為指引，順便可練習樣本添加的動作。

8) 取蛋白質樣本溶液，加入同體積 E 液，以及適量追蹤染料 bromophenol blue，混勻後在 100℃ 加熱 10 min。放冷短暫離心後即可依次以微量吸管注入樣本槽，樣本體積可自斟酌，但要記好位置及體積；通常都使用 5~15 mL。

u注入樣本時，儘量把針頭或吸管伸到樣本槽底部，但不要觸到樣本槽底的膠面，則可以使得樣本所佔的體積最小，分離效果較好。

9) 裝上電源蓋，以 100~150V 進行電泳，最高可加至 200V，視實驗的緊急程度，以及膠片發熱的情形而定。通電後兩極附近會立刻產生無數細微氣泡，是通電的特徵。

10) 追蹤染料很快進入膠體，開始焦集成藍色細線，並向下泳動，大約 1 h 可泳動到底邊，中止電泳，除去電源蓋。

u有些分子量較大的樣本，或使用濃度較高的膠片，可以等到藍色細線泳出膠體才停止。

膠片染色法：

11) 取出膠片組合，使玻璃板向上，先除去兩側間隔條，再以扁形藥匙輕輕撬起玻璃，膠片則留在白板上。切除焦集膠體，並在分離膠片的右上方截角做記號 (區別膠片的左右)。

12) 取染色盤 (大約比膠片稍大)，倒入 CBR 染色液，在染色盤上方把上述白板倒翻過來，挑起膠片一角，利用重力使膠片掉落到染色缸中。

u若要進行蛋白質轉印，則膠片不能染色，要浸入轉印緩衝液中。

13) 在 CBR 中染色約 30 min，染色盤要加密蓋，置於旋轉平台慢速 50 rpm 搖盪之；要注意膠片是否完全沒入染色液中，否則會造成染色不均勻。

14) 染色後小心把 CBR 染劑倒回原來瓶中，整塊膠片變成藍色，先用自來水洗掉殘餘的染色液，再倒入約 20 mL 脫色液，加密蓋後再放回旋轉平台搖盪。染色脫色過程請戴手套，否則會在膠片上留下指紋。

15) 膠片的藍色背景漸漸脫掉，待脫色液轉成藍色後，可以換新脫色液；如此脫色數次，在一小時內應可看到蛋白質的藍色色帶出現。用過的脫色液，請回收倒在有機溶液的廢液桶中。

16) 待膠片背景完全透明後，染色脫色完成。倒去脫色液，改用 50% 甲醇液洗一兩次，待膠片縮至大約原來的尺寸，則可準備乾燥之。

膠片乾燥法：

17) 把玻璃紙 cellophane 先用水浸溼，平鋪在乾燥用的玻璃片上，玻璃紙會比玻璃片大，因此四週有多出來的部份。

18) 把膠片平鋪在玻璃紙中央，膠片與玻璃紙間不要有任何氣泡。

u除了氣泡之外，若膠片沒有回復原來的大小，或者膠片的四邊有傷痕，都很容易造成膠片乾燥後的龜裂現象。

19) 在膠片上再加一層浸溼的玻璃紙，也不要陷有氣泡在內；把玻璃紙多出來的部份反摺到玻璃背面，用手抹平表面水份，並用紙巾吸乾。

20) 把此乾片三明治組合放在桌上，次日即可得到已經乾燥好的膠片，用電風扇或冷氣機吹之，可以加快乾片速度。

u有乾片後用指甲尖輕敲膠片，若還可以看到指甲所留下的痕跡，表示膠片並未完全乾燥，要再等候。

21) 待膠片完全乾燥後，以美工刀或剪刀去除多餘的玻璃紙，再加以護貝，則可永久保存之。免疫染色的轉印紙，也可以護貝保存。

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4.2.4

蛋白質轉印法

蛋白質經 SDS-PAGE 後，膠片浸入轉印緩衝液，蛋白質可被轉印到硝化纖維紙 (nitrocellulose) 上，先經尿素洗去 SDS，並使蛋白質回復原態抗原性，可使用抗體進行免疫染色 (Towbin et al, 1979)。

儀器用具：

電泳轉印槽 (Hoefer Transphor TE 52)：

轉印槽 (可容納 4 個轉印三明治)

轉印三明治 (轉印夾、方形海綿墊 2 片)

轉印紙：早期使用硝化纖維紙，現在多用尼龍材質者

Immobilon-P (Millipore IPUH 000 10, 0.45 mm, PVDF 材質)

濾紙 (Whatman #1, 3MM) 兩張，裁成比轉印紙稍大者。

供電器 (可供 400~500 mA 者)

方形培養皿 (轉印紙清洗用)

旋轉搖盪器 (rotary shaker)

藥品試劑：

轉印緩衝液 (Blotting buffer)： 10×溶液

Tris	(Tris base, 25 mM×10)	60.6	gm
甘胺酸	(0.192 M×10)	288.0	gm

加水 1,500 mL 溶之，pH 以 HCl 調到 8.3，加水至 2,000 mL
u使用時取 500 mL 倒入一 5 L 桶中，加 500 mL 甲醇後，加水到 5 L，均勻攪拌之。如此配成者，含 10% 甲醇；若是轉印胜汰或是蛋白質的分子量太小，可提高到 20%。

甲醇 (用來潤溼尼龍材質的轉印紙)

PBST 洗液：

PBST 為 pH 7.0 的 PBS (phosphate buffered saline) 緩衝液，另加有 0.05% Tween-20，用來清洗轉印紙，以去除非專一性的蛋白質吸附。

尿素洗液 (6 M Urea-PBST) :

尿素 180 gm 溶在 300 mL PBST 中，加溫攪拌溶解，再加 PBST 至 500 mL。

方法步驟：

u全程請戴手套操作，以免污染轉印紙！

1) 電泳後 SDS-PAGE 膠片浸在轉印緩衝液中，洗 2~3 次，每次 10 min。

2) 取出轉印槽，先小心放一攪拌子在底部，再倒一半轉印緩衝液。

u攪拌子千萬不能丟到轉印槽內，會打破轉印槽底部的陶瓷散熱片。

3) 取轉印紙切成約如膠片大小，先在方形培養皿中以少許甲醇浸溼數秒鐘，再置入轉印槽中的緩衝液 10 min 後使用。另取兩張濾紙，以及兩片方形海綿墊，都放在轉印槽的緩衝液中備用。

4) 取出轉印夾打開平放，先墊一張方形海棉墊，舖上一張溼濾紙，小心疊上已潤溼的轉印紙，其間勿陷入氣泡；轉印紙再滴上數滴緩衝液後，小心平舖膠片上去，加蓋一層濾紙，及另一張海綿，也都不可陷入氣泡，即可把整個轉印三明治卡夾裝好。

u膠片疊到轉印紙時，最好一次成功，不要重作，否則蛋白質色帶可能會印上去，最後產生重疊影像。

5) 將轉印三明治置入已經放有一半轉印緩衝液的轉印槽中，注意有轉印紙的那一面向正極 (紅色)，膠片那面向負極 (黑色)。

6) 當三明治都放入轉印槽後，以轉印緩衝液蓋滿所有的三明治，小心動一動卡夾，除去附在卡夾內外的氣泡，蓋上蓋子，放到一攪拌器上，打開攪拌器開始攪拌，同時接好電源，裝置完成後放置 10 min。

7) 以 400 mA 開始轉印，溫度會漸漸上升，轉印 1.5 h 後中止轉印，取出轉印三明治，打開後依次取出轉印紙及膠片。

u上述轉印條件會使溫度上升至 70~90℃，若有冷卻系統，可把溫度控制設在 5℃；轉印槽內應該加以攪拌，以便使整個溫度分佈均勻。

8) 轉印後的膠片可以繼續進行 CBR 染色，看有無蛋白質殘留。若電泳時加有藍色標準蛋白質 marker (SeeBlue)，則可在轉印紙上看到藍色的色帶，確定轉印成功，並可評估轉印效率。

9) 轉印紙浸在約 15 mL 尿素洗液中浸洗過夜，期間換三次尿素洗液，並且要溫和搖盪之。

10) 若不做免疫染色，則轉印後不用尿素洗液清洗，以清水沖過後改用 amido black (l % 溶於 10% 甲酸) 染色 1 h，再以 10% 甲酸脫色，沖水後晾乾即可，但其靈敏度較低。

註解討論：

a. 轉印時槽內的水溫並不均勻，液面的溫度比底部要高，電流也就不會均勻，注意轉印效果因此會有差異；最好加以攪拌使水溫均勻。

b. 膠片及轉印紙應切角做記號，以分辨左右或正反面，免得呈色後分不清樣本的次序。

c. 甲醇可提高到 20%，一般分子量越小，所用甲醇的含量越高；但甲醇含量太高，可能會使分子量太大者不易泳離膠體。

■ 結果參考『概說』Slide 8

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4.2.5

免疫染色法

轉印到紙上的蛋白質抗原，可與其專一性抗體結合，再以二次抗體-酵素結合體 (2nd Ab-HRP) 或 Protein A-HRP 呈色；可在一群轉印色帶中，專一性地挑出目標蛋白質，是最有用的檢定工具 (Burnett, 1981)。

藥品試劑：

抗體溶液：可用傳統抗血清或單株抗體，其最適使用濃度，隨抗體效價不同而異，以下為一般適用範圍的參考，均以明膠-NET 稀釋之。

a. 傳統抗血清： 1:100 到 1:1,000

b. IgG (冷凍乾燥品)： 10~50 mg/mL

c. 單株抗體 (小白鼠腹水)： 1:200 到 1:5,000

d. 單株抗體 (細胞培養液)：原液或 1:10

明膠-NET：用來稀釋抗體溶液或酵素連結體

明膠 gelatin	(Merck 4070, 0.25%)	5.0	gm
NaCl	(0.15 M)	17.5	gm
EDTA	(5 mM)	3.6	gm
Tween-20	(0.05%)	1.0	mL
Tris	(Tris base, 50 mM)	12.1	gm

加熱溶解於 1,800 mL 純水後 pH 調到 8.0，再加水到 2,000 mL

酵素連結體：

可使用 2nd Ab-HRP 或 Protein A-HRP，使用濃度每家商品不同，約為 1:1,000 到 1:5,000 之間，以明膠-NET 稀釋之。

PBST 洗液

DAB 基質溶液：

DAB	(diaminobenzidine, Sigma D-5637)	5	mg

溶於 100 mL Buffer A-0，再加 10 mL H₂O₂，新鮮配製，避光貯存。
uDAB 為致癌物質，稱量時勿吸入 DAB 細塵，並小心處理秤量紙。

方法步驟：

1) 尿素洗過夜的轉印紙再以 10 mL PBST 洗三次，每次約 10 min，均在上述方形培養皿中進行。

2) 轉印紙放在明膠-NET 溶液中反應，置室溫中反應 1 h。一般使用方形培養皿當容器，但亦可裝入塑膠袋中反應，較節省試劑用量。

3) 反應後，以 PBST 浸洗二次。

4) 把轉印紙放在抗體溶液中反應，置室溫反應 1 h。

5) 反應後以 PBST 洗三次，改用酵素連結體反應，在室溫下反應 1 h。

6) 以 PBST 洗四至五次，注意容器也要洗乾淨。

7) 加入 DAB 基質溶液約 10 mL 呈色，儘量避光，並且不時搖動呈色液。

8) 數分鐘內可呈色，在背景加深前倒去 DAB，以水沖過數次後晾乾。

註解討論：

a. 非專一性的呈色經常會造成困擾，此問題可用尿素洗液解決，尿素可洗去 SDS，且使蛋白質或胜汰回復其構形或抗原性。

b. DAB 呈色時，應含有一不會呈色之負對照組作為比較；當樣本含有標準分子量的組合時，其蛋白質色帶應不會呈色。

■ 結果參考『概說』Slide 8

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	參考文獻：
	Affinity chromatography - Principles and methods, Pharmacia Biotech 操作手冊
	Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248-254
	Burnett WN (1981) Anal Biochem 112: 195-203
	Gel filtration - Principles and methods, 6th ed, Pharmacia Biotech 操作手冊
	Ion exchange chromatography - Principles and methods, ed AA, Pharmacia Biotech 操作手冊
	Jefferson RA, Burgess SM, Hirsh D (1986) b-Glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker. Proc Natl Acad Sci USA 83: 8447-8451
	Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685
	Protein Liquid Chromatography (2000) Kastner M ed, J Chromatography Library Vol 61, Elsevier
	Scopes RK (1994) Protein purification - Principles and practice, 3rd ed, Springer-Verlag
	Towbin H, Staehelin T, Gordon J (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 76: 4350-4354
	莊榮輝主編 (2000) 酵素化學實驗。台灣大學農化系
	參考網頁：酵素純化與分析 (140.112.78.220/~juang/ECX/index.htm)

	致謝：

	感謝台大生化所張震東教授對於本章內容，以及在教學與技術上的建議及指正。


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■ 最近修訂日期︰ 2002/07/28