免疫轉印

與蛋白質定量法的原理大致相同，跑完電泳後，蛋白質的各種染色方法，也是利用蛋白質分子上的種種特性，尤其是各種胺基酸的基團。以下是最常用的三類膠片染色方法，但若要進行蛋白質轉印，就不能先進行這些染色法，因為染色後蛋白質都被固定在膠片上。

最方便而常用的染色，是使用 Coomassie Blue R 與蛋白質上面的 (1) 非極性基團 (2) Arg 或 Lys 等鹼性基團結合，因而使得蛋白質染上藍色。

硝酸銀染色法的靈敏度比 Coomassie Blue 高至百倍，但步驟較為繁複，而且有些蛋白質會有負染色的情形；硝酸銀染色可能是銀銨錯離子與蛋白質上面的 Lys, Arg 等鹼性基團結合，然後被還原成金屬銀而呈色。

蛋白質上面的糖分子，可被過碘酸 (periodic acid) 氧化產生醛基，後者可與 Schiff's reagent 結合生成洋紅色的堆積物，因而染成洋紅色，此稱為 PAS 糖染色。上述醛基也可以與硝酸銀染色的銀銨錯離子結合，因而染上金屬銀，因此也可以把硝酸銀染色用來作為糖染色。

通常蛋白質轉印不很困難，只要照上面把膠片-轉印紙三明治包好，通電後即可轉印成功。但再來使用抗體的免疫染色，就要小心各個操作步驟，以免染出來一片空白，或更慘的是，所有色帶全部都被染出來。

免疫染色是利用抗體來偵測轉印紙上面的抗原蛋白質，其原理也相當單純，但有很多應用上或技術上的問題。上圖列出目前較常用的免疫染色方法，都是源自最早的放射線免疫呈色，但現在都改用酵素，並且使所產生的生成物為水不溶性，以便把呈色堆積在轉印紙上。

為了提高靈敏度，有許多方法可用；例如酵素改用較靈敏的 alkaline phosphatase，或更採用會產生螢光產物的基質，靈敏度直逼放射性標示。更可使用 avidine (上圖 S) 及 biotin (上圖洋紅色六角星) 的放大系統，把單一個抗體的結合，連接到更多酵素標示，可提高靈敏度至百倍。

若使用金的膠體作為二次抗體的標示，則也可以用在電子顯微鏡的組織切片染色上，追蹤抗原分子的細胞位置；甚至可使用不同大小的金膠體，分別標示在兩種抗體，追蹤不同的抗原蛋白質。

左圖的 Coomassie Blue 染色結果顯示，蛋白質在純化過程中，純度越來越高，最後大約只剩下 70 kD 的 GUS 色帶。平行的另一張膠片進行免疫染色，則不管在哪一個純化步驟，都染出相同的色帶，是因為抗體的專一性之故。


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一級構造	膠體過濾法	酵素活性分析	生物技術核心實驗
二級構造	離子交換法	膠體電泳法	酵素純化與分析
三級構造	親和層析法	免疫轉印法	流程圖 A 種
四級構造	純化策略	Proteomics	流程圖 B 種


	蛋白質分析
	免疫轉印法	．各種蛋白質染色法的原理
		．轉印及免疫染色流程
		．免疫轉印的種類與呈色機制
		．以電泳及抗體檢定表現蛋白質 GUS
		．以膠體過濾法求得 GUS 原態分子量

■ 各種蛋白質染色法的原理
圖例

	蛋白質染色也是利用到蛋白質分子上的各種基團。
	與蛋白質定量法的原理大致相同，跑完電泳後，蛋白質的各種染色方法，也是利用蛋白質分子上的種種特性，尤其是各種胺基酸的基團。以下是最常用的三類膠片染色方法，但若要進行蛋白質轉印，就不能先進行這些染色法，因為染色後蛋白質都被固定在膠片上。最方便而常用的染色，是使用 Coomassie Blue R 與蛋白質上面的 (1) 非極性基團 (2) Arg 或 Lys 等鹼性基團結合，因而使得蛋白質染上藍色。硝酸銀染色法的靈敏度比 Coomassie Blue 高至百倍，但步驟較為繁複，而且有些蛋白質會有負染色的情形；硝酸銀染色可能是銀銨錯離子與蛋白質上面的 Lys, Arg 等鹼性基團結合，然後被還原成金屬銀而呈色。蛋白質上面的糖分子，可被過碘酸 (periodic acid) 氧化產生醛基，後者可與 Schiff's reagent 結合生成洋紅色的堆積物，因而染成洋紅色，此稱為 PAS 糖染色。上述醛基也可以與硝酸銀染色的銀銨錯離子結合，因而染上金屬銀，因此也可以把硝酸銀染色用來作為糖染色。
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■ 轉印及免疫染色流程
圖例

	蛋白質轉印原理很簡單，但後續的染色操作及結果解讀要很小心。
	通常蛋白質轉印不很困難，只要照上面把膠片-轉印紙三明治包好，通電後即可轉印成功。但再來使用抗體的免疫染色，就要小心各個操作步驟，以免染出來一片空白，或更慘的是，所有色帶全部都被染出來。
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■ 免疫轉印的種類與呈色機制
圖例

	免疫染色要靠專一性高的抗體，以及靈敏的二次抗體-酵素連結體。
	免疫染色是利用抗體來偵測轉印紙上面的抗原蛋白質，其原理也相當單純，但有很多應用上或技術上的問題。上圖列出目前較常用的免疫染色方法，都是源自最早的放射線免疫呈色，但現在都改用酵素，並且使所產生的生成物為水不溶性，以便把呈色堆積在轉印紙上。為了提高靈敏度，有許多方法可用；例如酵素改用較靈敏的 alkaline phosphatase，或更採用會產生螢光產物的基質，靈敏度直逼放射性標示。更可使用 avidine (上圖 S) 及 biotin (上圖洋紅色六角星) 的放大系統，把單一個抗體的結合，連接到更多酵素標示，可提高靈敏度至百倍。若使用金的膠體作為二次抗體的標示，則也可以用在電子顯微鏡的組織切片染色上，追蹤抗原分子的細胞位置；甚至可使用不同大小的金膠體，分別標示在兩種抗體，追蹤不同的抗原蛋白質。
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■ 以電泳及抗體檢定表現蛋白質 GUS
圖例

	BCT 蛋白質實驗的電泳及轉印結果。
	左圖的 Coomassie Blue 染色結果顯示，蛋白質在純化過程中，純度越來越高，最後大約只剩下 70 kD 的 GUS 色帶。平行的另一張膠片進行免疫染色，則不管在哪一個純化步驟，都染出相同的色帶，是因為抗體的專一性之故。
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■ 以膠體過濾法求得 GUS 原態分子量
圖例

	比較 SDS-PAGE 及膠體過濾結果得知 GUS 是一個四元體構造。
	膠體過濾可求得 GUS 的原態分子量約在 260 kD，而 SDS-PAGE 測得 GUS 的單元體分子量為 70 kD，因此可推得 GUS 的四級構造為四元體。
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