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流程圖 A 種
A 種 流程圖
A 種流程適用於暑期班、學期班
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流程圖 A 種 |
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A 種 流程圖 |
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A 種流程適用於暑期班、學期班 |
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下載 A 種流程圖 PowerPoint file (711 KB)
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■ 蛋白質操作技術 |
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圖 例 |
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蛋白質的操作技術大致分為層析法及電泳法，再加上定量分析。 |
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蛋白質部分的操作，總共分成五個單元，其內容不外層析法、電泳法及定量分析法。 上表把這五次實驗的大概內容，分成這三大範疇，分別表列出來，並且各連結到相關的背景資料；也可以點選上表各項操作，直接跳到相關的流程圖。 |
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| ChartAX |
▲ TOP |
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■ 各實驗進行總流程圖 |
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圖 例 |
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總流程圖列出所有實驗的先後關係。 |
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總共五次的實驗中，共進行九種實驗，分別標示為 P1 至 P9 (P 代表 protein)，並且在上面註明講義的相關章節號碼。這種 P1~P9 的編號，僅用在本流程圖網頁，其目的在整理出各實驗單元，以方便學員確認。 點選各章節號碼 (如 4.2.1) 可以直接連結到操作流程本文。 |
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| ChartA0 |
▲ TOP |
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■ (1) 粗抽取及膠體過濾法 |
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圖 例 |
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粗抽取並沈澱出總蛋白質，回家前進入膠體過濾管柱。 |
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蛋白質的第一次實驗，把表現有 GUS 酵素的菌體打破，粗抽取液 (XT) 以硫酸銨沈澱出總蛋白質 (TP)，並在回家前把總蛋白質注入膠體過濾管柱；第二天必須來收取分劃收集器，並進行定量分析。 本次實驗的注意要點︰ (1) 菌體一定要完全打破，以提高酵素回收率。 (2) 各項離心步驟要小心，勿流失寶貴樣本，或因失誤倒掉樣本。 (3) 膠體過濾管柱要裝填妥當，使用前並且以緩衝液高壓流洗。 (4) 分劃收集器要小心操作好，以免收不到樣本，或者中途故障。 (5) 酵素一定要保持在 4C 下 (或冰浴)，不可在室溫下暴露太久，也不可凍結之。 (6) 每一純化步驟，記得留取 0.1 mL 作為樣本，標記好名稱組別，小心保存在 4C 下。 (7) 小心照顧好層析管柱，以便最後進行分子量檢定，否則必須重新裝填管柱。 |
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| ChartA1 |
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■ (2) 離子交換法 |
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圖 例 |
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離子交換法是極為有效的純化方法。 |
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以各種定量方法定出膠體過濾後，GUS 酵素的溶離位置，收集之後得到部分純化的酵素 (GF)。 GF 則繼續通入 DEAE 陰離子交換管柱，並以人工方式提高鹽濃度，逐次溶離下蛋白質，並進行定量分析找出 GUS 的溶離位置 (IEX)。本次實驗的注意要點︰ (1) DEAE 膠體一定要再生完全，檢查其 pH 與離子濃度是否正確。 (2) 小心勿讓 DEAE 膠體乾掉，使用後要再生收回。 (3) 也要記得收取 0.1 mL IEX 樣本。 |
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| ChartA2 |
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■ (3) 親和層析法 |
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圖 例 |
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因表現的 GUS 上接有六個連續 His，因此可用含有 Ni 的親和膠體吸著之。 |
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金屬螯合層析法是利用膠體上面的金屬 (Ni) 與目標蛋白質之間的親和力，來除去其它雜質，效果通常都十分顯著。 我們所表現的 GUS 酵素，在其分子端點接有 (His)6 tag，因此可利用 His 上面的 imidazole 基團，與金屬離子結合。待洗去所有無法結合的雜質，再以高濃度的游離 his 或者 imidazole，把 GUS 溶離下來。 到本次實驗已經完成所有純化工作，因此要準備進行電泳，開始練習鑄膠 (SDS-PAGE)，是另一個十分有威力的分析工具。 |
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| ChartA3 |
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■ (4) 電泳及轉印 |
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圖 例 |
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電泳後把蛋白質轉印到紙上，準備用抗體辨認目標蛋白質。 |
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進行電泳之前，一定要把各個樣本的蛋白質濃度精密測量，以便取等量蛋白質進行電泳；每個電泳的蛋白質使用量，約在 1 至 10 mg 之間，不可太稀或過濃，都沒有好處。 轉印蛋白質時，要小心轉印三明治的包裝法，以及轉印的條件。在電泳時，我們使用有色的 marker，以便觀察轉印是否成功。轉印後，轉印紙可以浸在 urea-PBST 中保存，準備以抗體偵測之。 同時，請把早先的膠體過濾管柱整理好，取得標準分子量蛋白質，以進行 GUS 原態分子量的檢定。 |
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| ChartA4 |
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■ (5) 免疫染色及分子量決定 |
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圖 例 |
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抗體可專一性地結合目標蛋白質，是極為重要的生化工具。 |
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我們將以對抗 GUS 蛋白質的單株抗體，對轉印紙進行免疫偵測，單株抗體有相當高的專一性，可以在一堆雜蛋白色帶中，無誤地挑出目標蛋白質，並以二次抗體及標示酵素，進行二度偵測與顯像。同時，以膠體過濾法決定分子量，也可依據標準品的分子量，內插求出 GUS 的原態分子量。 本次操作的成敗，將是所有實驗的最後命脈所繫；當最後看到各個純化步驟的樣本，一一呈現專特的深褐色，則所有辛苦將拋之九霄雲外。並可以此定出 GUS 單元體的分子量，與膠體過濾所得的結果，可推出 GUS 蛋白質的四級構造。 所有實驗到此全部結束，由 DNA 經 RNA 到蛋白質，體驗一次生命的分子之旅。 |
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| ChartA5 |
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下載 A 種流程圖 PowerPoint file (711 KB) ▼ 到 B 種流程圖 (四單元課程)
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構 造 ． 純 化 ． 分 析 |
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Protein/Achart |
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本網頁最近修訂日期： 2003/11/05 |
