膠體電泳

最早的電泳是在濾紙上面跑的，但是蛋白質會因為發熱及拖尾而變性；雖然以 cellulose acetate 進行的薄層電泳已有部分改進，仍然不太適用在蛋白質等大分子。後來改用澱粉不但改善發熱及拖尾，也大大增加樣本體積，電泳才大量被用在蛋白質方面。

近二十年來，由於分子生物學的發展，使得電泳更加成熟，而有洋菜糖及聚丙烯醯胺兩大系統；前者多用在水平形式的核酸電泳，後者多用在垂直形式的蛋白質電泳，各領一方之風行。

聚丙烯醯胺膠體的形成，是使用上面的幾項主要成分，經過自由基傳遞的連鎖反應造成的。現在所能購得的商品，品質都不錯，不用自行純化。但 ammonium persulfate (APS) 一定要注意新鮮度，貯藏太久者，通常都會失去效用，是凝膠不全的第一主因。

其他要注意的是，丙烯醯胺單體 (或 Bis) 有神經毒性，必須戴手套處理；注意 SDS 是一種很輕的粉狀物，容易飄起來吸入肺部，造成肺泡表面張力的喪失，引起呼吸困難，要極為小心。

聚丙烯醯胺膠體的形成，是把單元體的丙烯醯胺 (上面的綠色三角形) 一個一個串接起來。若在聚合的過程中，接到一個 Bis，則此長鏈會產生分枝，因而造成立體的網狀構造 (上圖左下)；控制丙烯醯胺及 Bis 的濃度，即可調整這些網目的大小，因而決定樣本蛋白質在膠體中的泳動率。

通常丙烯醯胺及 Bis 的濃度以例如 (T30%, C2.6%) 的百分比來表示︰ T (total) 表示所有丙烯醯胺及 Bis 的總濃度為 30% (即 100 mL 中含有 30 g 的丙烯醯胺及 Bis)，而其中的 Bis (C, cross-linking) 為 T30% 中的 2.6% (即 30% x 0.026 = 0.78%)，因此每 100 mL 中含有 29.22 g 丙烯醯胺，以及 0.78 g Bis。

蛋白質的聚丙烯醯胺膠體電泳通稱為 PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)，其膠體系統是不連續性的，分成焦集膠體及分離膠體，不但膠體濃度不同，其緩衝液 pH 液不同。不連續的目的，在於可以使樣本蛋白質在焦集膠體中凝聚成一條細線，以增加電泳的解析力。

這樣的 PAGE 系統又可分成兩大類，一種在整個系統中加有表面活性劑 SDS，因此稱為 SDS-PAGE；另一種則不加 SDS，因此樣本蛋白質可以保持在其原態狀態，稱為 native-PAGE (或 disc-PAGE)。兩種 PAGE 各有其使用上的優缺點，後面以例子說明其異同點。


蛋白質構造	蛋白質純化	蛋白質分析	其他連結
巨分子	鹽溶及鹽析	蛋白質定量法	生物技術中心
一級構造	膠體過濾法	酵素活性分析	生物技術核心實驗
二級構造	離子交換法	膠體電泳法	酵素純化與分析
三級構造	親和層析法	免疫轉印法	流程圖 A 種
四級構造	純化策略	Proteomics	流程圖 B 種


	蛋白質分析
	膠體電泳法	．電泳形式的演進
		．膠體的成分
		．鑄膠聚合反應
		．電泳膠體系統的組成
		．三種不同性質蛋白質的電泳比較
		．SDS 的分子構造
		．SDS 在蛋白質表面均勻附上一層負電荷
		．兩種電泳方式的結果不同

■ 電泳形式的演進
圖例

	電泳從濾紙發展到澱粉，最後以洋菜糖及聚丙烯醯胺為最常用形式。
	最早的電泳是在濾紙上面跑的，但是蛋白質會因為發熱及拖尾而變性；雖然以 cellulose acetate 進行的薄層電泳已有部分改進，仍然不太適用在蛋白質等大分子。後來改用澱粉不但改善發熱及拖尾，也大大增加樣本體積，電泳才大量被用在蛋白質方面。近二十年來，由於分子生物學的發展，使得電泳更加成熟，而有洋菜糖及聚丙烯醯胺兩大系統；前者多用在水平形式的核酸電泳，後者多用在垂直形式的蛋白質電泳，各領一方之風行。
	A3A1	▼ BCT 相關主題 ▲ TOP

■ 膠體的成分
圖例

	聚丙烯醯胺膠體的組成成分並不複雜。
	聚丙烯醯胺膠體的形成，是使用上面的幾項主要成分，經過自由基傳遞的連鎖反應造成的。現在所能購得的商品，品質都不錯，不用自行純化。但 ammonium persulfate (APS) 一定要注意新鮮度，貯藏太久者，通常都會失去效用，是凝膠不全的第一主因。其他要注意的是，丙烯醯胺單體 (或 Bis) 有神經毒性，必須戴手套處理；注意 SDS 是一種很輕的粉狀物，容易飄起來吸入肺部，造成肺泡表面張力的喪失，引起呼吸困難，要極為小心。
	A3A2	▼ BCT 相關主題 ▲ TOP

■ 鑄膠聚合反應
圖例

	聚丙烯醯胺膠體的聚合反應是一種自由基的連鎖反應。
	聚丙烯醯胺膠體的形成，是把單元體的丙烯醯胺 (上面的綠色三角形) 一個一個串接起來。若在聚合的過程中，接到一個 Bis，則此長鏈會產生分枝，因而造成立體的網狀構造 (上圖左下)；控制丙烯醯胺及 Bis 的濃度，即可調整這些網目的大小，因而決定樣本蛋白質在膠體中的泳動率。通常丙烯醯胺及 Bis 的濃度以例如 (T30%, C2.6%) 的百分比來表示︰ T (total) 表示所有丙烯醯胺及 Bis 的總濃度為 30% (即 100 mL 中含有 30 g 的丙烯醯胺及 Bis)，而其中的 Bis (C, cross-linking) 為 T30% 中的 2.6% (即 30% x 0.026 = 0.78%)，因此每 100 mL 中含有 29.22 g 丙烯醯胺，以及 0.78 g Bis。
	A3A3	▼ BCT 相關主題 ▲ TOP

■ 電泳膠體系統的組成
圖例

	現今蛋白質分析都採用不連續性的丙烯醯胺膠體電泳。
	蛋白質的聚丙烯醯胺膠體電泳通稱為 PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)，其膠體系統是不連續性的，分成焦集膠體及分離膠體，不但膠體濃度不同，其緩衝液 pH 液不同。不連續的目的，在於可以使樣本蛋白質在焦集膠體中凝聚成一條細線，以增加電泳的解析力。這樣的 PAGE 系統又可分成兩大類，一種在整個系統中加有表面活性劑 SDS，因此稱為 SDS-PAGE；另一種則不加 SDS，因此樣本蛋白質可以保持在其原態狀態，稱為 native-PAGE (或 disc-PAGE)。兩種 PAGE 各有其使用上的優缺點，後面以例子說明其異同點。
	A3A4	▼ BCT 相關主題 ▲ TOP

■ SDS 的分子構造
圖例

	SDS 有一個極性頭部，與一條非極性尾巴。
	因此 SDS 可以介入極性與非極性基團之間，是一種界面活性劑，就是俗稱的清潔劑。SDS 可以把非極性尾巴鑲入蛋白質三級構造的內部，而以其極性頭部與外界的水分子結合，因而使得蛋白質變性。
	A3A5	▼ BCT 相關主題 ▲ TOP

■ SDS 在蛋白質表面均勻附上一層負電荷
圖例

	SDS 不但把蛋白質變性，而且覆蓋其原有電荷，在表面敷上一層負電荷。
	在 SDS-PAGE 系統中，除了整個電泳系統含有 0.1% SDS 外，樣本也要加入 SDS (並以 mercaptoethanol 打斷雙硫鍵) 同時加熱處理。則蛋白質會解構成為一條直鏈狀分子，其上並佈滿了 SDS 的負電荷；請注意，理論上 SDS 是很均勻的吸附到蛋白質上，因此不管原來蛋白質分子的大小，每種蛋白質分子上所吸附的負電荷密度是相同的。
	A3A6	▼ BCT 相關主題 ▲ TOP

■ 三種不同性質蛋白質的電泳比較
圖例

	以三種虛擬蛋白質說明 native- 與 SDS- 兩種 PAGE 的不同機制。
	在原態狀態下，X 的分子量最大，Z 的分子量最小；但 Z 的 pI 為 9.3，在 native- PAGE 的 pH 之下，則會帶有正電荷，因此其泳動率受到電荷及分子量的雙重影響，不太容易預測；而 SDS-PAGE 則因為原來的電荷已經被 SDS 所覆蓋，所有分子都會往正極泳動，因此只剩下分子量為影響泳動率的唯一因素。
	A3A7	▼ BCT 相關主題 ▲ TOP

■ 兩種電泳方式的結果不同
圖例

	SDS-PAGE 比較能夠準確預測樣本蛋白質的泳動率。
	蛋白質 Z 在左邊的 native-PAGE 中無法向下泳動，但在右邊的 SDS-PAGE 則可以依其分子量正確泳動；因此一般使用上，SDS-PAGE 的應用較廣泛。在 SDS-PAGE 下，雖然 X 分子被解構成單元體，因此分子量由 160 kD 變成 40 kD；但若在較為溫和的樣本處理條件下，有可能看到未完全解構的 160 kD 蛋白質色帶。
	A3A8	▼ BCT 相關主題 ▲ TOP