蛋白質定量

雖然本節的主題是蛋白質分析，但主題及對象都是酵素，事實上兩者很難分開。

我們先在本小節說明蛋白質的定量，然後下一小節簡單說明酵素活性分析的主要原則。接著是蛋白質或酵素研究上，最重要的工具 - 膠體電泳，以及蛋白質轉印後的免疫染色法。最後，大概介紹最近興起的 proteomics，算是沈寂五十年後，大家對蛋白質研究的重新發現。

任何定量方法，一定是根基於目標分子的構造或性質上的特性所設計的；蛋白質也不例外，所有的蛋白質定量方法，都是依照蛋白質構造上的特性，以及其基本化學原理。以下簡述這幾個方法的主要基理︰

(1) Biuret Method︰銅離子與蛋白質骨架上的 C=O 基團結合，再還原成銅 (紅橙色)。

(2) Lowry Method︰前半為 Biuret Method，再加上磷鉬酸與磷鎢酸對 Tyr 吸附呈色 (藍色)。

(3) UV absorbance︰蛋白質骨架上 C=O 對 200 nm 波長，芳香族胺基酸對 280 nm 有吸光。

(4) Bradford Method︰ Coomassie Blue G 吸附到蛋白質後會變成藍色，蛋白質越多，藍色越深。

(5) Special properties︰許多蛋白質含有特殊的金屬 (如 Cd)、基團 (如 heme) 等，都有特定的分析方法。

CBG 有點像指示劑，會在不同的酸鹼度下變色；在酸性下是茶色，在中性下為藍色。當 CBG 接到蛋白質上去的時候，因為蛋白質會提供 CBG 一個較為中性的環境，因此會變成藍色。當樣本中的蛋白質越多，吸到蛋白質上的 CBG 也多，藍色也會增強。因此，藍色的呈色強度，是與樣本中的蛋白質量成正比。

靈敏度就是精確度，是看一種分析法能夠測到的最低量；最低限越低者，表示該分析法越靈敏。準確度是看該分析方法準不準，會不會有假反應；不該測到的出來了，該測到的卻沒測到。高準確度如 Biuret 法，通常測到的都確實是蛋白質的量，不太會有假結果；低準確度者如 280 nm 吸光的方法，因為樣本蛋白質可能因為不含芳香族基團，而完全測不到。

再來比較 280 nm 與 205 nm 兩種吸光方法，後者既精確又準確，前者不精確又不準確。因為，蛋白質在 205 nm 的吸光能力非常強，而且所有蛋白質的骨架上，都含有相同比例的 C=O 基團，不會相差太多。有關於精確度與準確度，請看下面打靶的例子。


蛋白質構造	蛋白質純化	蛋白質分析	其他連結
巨分子	鹽溶及鹽析	蛋白質定量法	生物技術中心
一級構造	膠體過濾法	酵素活性分析	生物技術核心實驗
二級構造	離子交換法	膠體電泳法	酵素純化與分析
三級構造	親和層析法	免疫轉印法	流程圖 A 種
四級構造	純化策略	Proteomics	流程圖 B 種


	蛋白質分析	．酵素分析方法
	蛋白質定量法	．各種蛋白質定量法
		．Coomassie Blue 蛋白質定量法
		．各種蛋白質定量法的比較
		．精確度 vs. 準確度

■ 酵素分析方法
圖例

	酵素分析方法是蛋白質分析的最重要主流。
	雖然本節的主題是蛋白質分析，但主題及對象都是酵素，事實上兩者很難分開。我們先在本小節說明蛋白質的定量，然後下一小節簡單說明酵素活性分析的主要原則。接著是蛋白質或酵素研究上，最重要的工具 - 膠體電泳，以及蛋白質轉印後的免疫染色法。最後，大概介紹最近興起的 proteomics，算是沈寂五十年後，大家對蛋白質研究的重新發現。
	A1A1	▼ BCT 相關主題 ▲ TOP

■ 各種蛋白質定量法
圖例

	蛋白質的胜鍵脊骨，或者其各種基團，都可以用來定量蛋白質。
	任何定量方法，一定是根基於目標分子的構造或性質上的特性所設計的；蛋白質也不例外，所有的蛋白質定量方法，都是依照蛋白質構造上的特性，以及其基本化學原理。以下簡述這幾個方法的主要基理︰ (1) Biuret Method︰銅離子與蛋白質骨架上的 C=O 基團結合，再還原成銅 (紅橙色)。 (2) Lowry Method︰前半為 Biuret Method，再加上磷鉬酸與磷鎢酸對 Tyr 吸附呈色 (藍色)。 (3) UV absorbance︰蛋白質骨架上 C=O 對 200 nm 波長，芳香族胺基酸對 280 nm 有吸光。 (4) Bradford Method︰ Coomassie Blue G 吸附到蛋白質後會變成藍色，蛋白質越多，藍色越深。 (5) Special properties︰許多蛋白質含有特殊的金屬 (如 Cd)、基團 (如 heme) 等，都有特定的分析方法。
	A1A2	▼ BCT 相關主題 ▲ TOP

■ Coomassie Blue 蛋白質定量法
圖例

	CBG 會吸附到蛋白質分子上，並且變成藍色。
	CBG 有點像指示劑，會在不同的酸鹼度下變色；在酸性下是茶色，在中性下為藍色。當 CBG 接到蛋白質上去的時候，因為蛋白質會提供 CBG 一個較為中性的環境，因此會變成藍色。當樣本中的蛋白質越多，吸到蛋白質上的 CBG 也多，藍色也會增強。因此，藍色的呈色強度，是與樣本中的蛋白質量成正比。
	A1A3	▼ BCT 相關主題 ▲ TOP

■ 各種蛋白質定量法的比較
圖例

	各種蛋白質的定量方法，各有其優缺點。
	靈敏度就是精確度，是看一種分析法能夠測到的最低量；最低限越低者，表示該分析法越靈敏。準確度是看該分析方法準不準，會不會有假反應；不該測到的出來了，該測到的卻沒測到。高準確度如 Biuret 法，通常測到的都確實是蛋白質的量，不太會有假結果；低準確度者如 280 nm 吸光的方法，因為樣本蛋白質可能因為不含芳香族基團，而完全測不到。再來比較 280 nm 與 205 nm 兩種吸光方法，後者既精確又準確，前者不精確又不準確。因為，蛋白質在 205 nm 的吸光能力非常強，而且所有蛋白質的骨架上，都含有相同比例的 C=O 基團，不會相差太多。有關於精確度與準確度，請看下面打靶的例子。
	A1A4	▼ BCT 相關主題 ▲ TOP

■ 精確度 vs. 準確度
圖例

	精確度與準確度可以用打靶的例子來說明。
	各種生化測量或分析方法，都有其應用上的評估標準，基本上是檢討其精確度與準確度；事實上與打靶的精準度很像。例如打五發子彈，有些槍的精確度很好，五發都中在相當小的範圍內，但離靶心較遠，如左靶的 Lowry method；另有些槍雖然都中在靶心附近，但較散開，有準確度而缺精確度，例如 Biuret method 即是。這是因為 Biuret 是根據蛋白質骨架上的 carbonyl (-C=O) 基團來定量，任何蛋白質的骨架都完全一樣，不會因蛋白質不同而有很大的差異，因此準確度較好。而 Lowry 法是 Biuret 加上對 Tyr 的加強呈色，可以因此測得更微量的蛋白質；雖然其精確度是變大了，但並非所有的蛋白質都含有相同量的 Tyr，因此準確度變差。同樣的，兩種以吸光度來測蛋白質量的方法，因為其所根據原理的不同，亦出現巨大的差異情形。由於 206 nm 測的也是蛋白質骨架上的 carbonyl 基團，因此非常準確；又由於其骨架上的 carbonyl 基團數目很多，蛋白質在 206 nm 的吸光非常之強，因此其精確度也很高。而 280 nm 所測的是芳香基團胺基酸的吸光，每種蛋白質分子上芳香胺基酸的數目與種類都不一樣，因此不同的蛋白質的280 nm 吸光就有極大的差別，測量起來因此不會太準。但我們可以先測得每個蛋白質的分子消光係數，以此來校正測量的吸光值，可求得正確的蛋白質含量。
	A1A5	▼ BCT 相關主題 ▲ TOP