膠體過濾

純化酵素的第一個步驟，就是打破細胞，把所有的蛋白質分離出來；這多採用鹽析或有機沉澱法，通常可以去除蛋白質以外的大部分物質，有相當大的純化效果，但目標蛋白質可能只佔總蛋白質的百分之一以下。

『部分純化』所使用的方法，幾乎是本實驗課中純化方法的主軸，多使用各種管柱層析法；通常其純度可達 50-90% 之間 (以蛋白質含量而言)。

為得到少量均質蛋白質，還得利用其他各種純化方法；通常很難定義什麼是均質蛋白質，例如目標蛋白質的水解片段也會影響其純度。幸而 99% 以上純度的蛋白質，已經可以進行很多實驗，而不會影響結果。但當製備抗體時，若此 1% 不純物質的抗原性很強，則可能造成抗體效價的低落，或專一性的不足。

若要分類自然界中的所有分子，可以大略分成極性及非極性兩大類。

極性分子上的電子分佈不均勻，常常造成分子上某些部份的電子密度較大，因而產生偶極性，偶極性會有暫時的正負電荷產生；因此兩個極性分子相遇，可利用其偶極性的正負電荷互相吸引，會有較大的親和力。

反之，非極性的分子上，其電子密度分佈較為均勻，因此不會有偶極產生，事實上非極性分子上不會帶有電荷。非極性的分子，比較喜歡與非極性的分子接近，可以看作因為無法與極性分子接近，被極性分子排斥所造成的非極性間的相互吸引力量。但也可以說是分子上電子的短暫分配不均，所形成的凡得瓦爾吸引力。

為何極性分子上的電子密度分佈會較不均勻？若分子內的任何兩個原子之間，其間的陰電性相差太大，例如氫 (陰電性 2.1) 與氧 (3.5)，則氫原子上的電子會被氧原子所吸引，使得氫氧附近的電子分佈不均勻。反之，碳 (2.5) 與氫 (2.1) 之間的陰電性相差較小，因此飽和碳氫化合物都是屬於極性較小的分子。

陰電性是描述一個原子搶電子的能力，陰電性大者容易搶奪其相鄰原子的電子。這是與其原子構造有關，在週期表右方的原子，因為其原子核內的質子數越來越多，正電荷較大，因此吸引電子的能力也較大。因此，分子的化學性質，幾乎都可用電子的爭奪來解釋；而分子或基團的極性大小，也可解釋大半的生物化學現象。

任何種類的色層分析方法，一定有兩個主要組成︰固定相 (stationary phase) 及流動相 (mobile phase)，二者各有不同的極性強度；樣本分子因其自身極性的強弱，與此二相之親和力不同。與固定相親和力大者，易留滯原地；與流動相親和力大者，易隨流動相移動，因而達成分離的目的。

通常流動相為液體或氣體，而固定相可為固體或液體。若固定相為固體，則稱為吸附性 (adsorption) 層析；若為液體，則稱為分配性 (partition) 層析。

層析法所用的膠體大小要均一，材質堅固而耐得住高壓，並且沒有非專一性的吸附。膠體過濾的膠球內外，貫穿許多小孔徑的通路，分子量小的粒子，比較容易進入膠球中，因此被延滯流出。而離子交換法或親和層析法的膠球，其上分布有離子基團或親和基團，可以吸附目標蛋白質，以達分離效果。

分離蛋白質所使用的膠球，必須以多醣類為主體；例如 Sephadex 使用葡萄聚醣，而 Sepharose 使用洋菜糖為主要材料。至於平常所說的樹脂類 (resin) 則只能用在小分子樣本，因為樹脂對蛋白質的吸附力很大，經常會使得蛋白質變性失活。


蛋白質構造	蛋白質純化	蛋白質分析	其他連結
巨分子	鹽溶及鹽析	蛋白質定量法	生物技術中心
一級構造	膠體過濾法	酵素活性分析	生物技術核心實驗
二級構造	離子交換法	膠體電泳法	酵素純化與分析
三級構造	親和層析法	免疫轉印法	流程圖 A 種
四級構造	純化策略	Proteomics	流程圖 B 種


	蛋白質純化
	膠體過濾法	．蛋白質純化三個階段
		．Like dissolves like
		．色層分析法基本原理
		．膠體過濾法的膠球
		．膠體過濾是 partition 層析法
		．膠球的堆疊
		．管柱裝填方法

■ 蛋白質的純化有三個階段
圖例

	酵素純化過程的各個階段都有其常用的分離純化方法。
	純化酵素的第一個步驟，就是打破細胞，把所有的蛋白質分離出來；這多採用鹽析或有機沉澱法，通常可以去除蛋白質以外的大部分物質，有相當大的純化效果，但目標蛋白質可能只佔總蛋白質的百分之一以下。『部分純化』所使用的方法，幾乎是本實驗課中純化方法的主軸，多使用各種管柱層析法；通常其純度可達 50-90% 之間 (以蛋白質含量而言)。為得到少量均質蛋白質，還得利用其他各種純化方法；通常很難定義什麼是均質蛋白質，例如目標蛋白質的水解片段也會影響其純度。幸而 99% 以上純度的蛋白質，已經可以進行很多實驗，而不會影響結果。但當製備抗體時，若此 1% 不純物質的抗原性很強，則可能造成抗體效價的低落，或專一性的不足。
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■ Like dissolves like
圖例

	近朱者赤、近墨者黑，物以類聚，不論人類或是分子皆同。
	若要分類自然界中的所有分子，可以大略分成極性及非極性兩大類。極性分子上的電子分佈不均勻，常常造成分子上某些部份的電子密度較大，因而產生偶極性，偶極性會有暫時的正負電荷產生；因此兩個極性分子相遇，可利用其偶極性的正負電荷互相吸引，會有較大的親和力。反之，非極性的分子上，其電子密度分佈較為均勻，因此不會有偶極產生，事實上非極性分子上不會帶有電荷。非極性的分子，比較喜歡與非極性的分子接近，可以看作因為無法與極性分子接近，被極性分子排斥所造成的非極性間的相互吸引力量。但也可以說是分子上電子的短暫分配不均，所形成的凡得瓦爾吸引力。為何極性分子上的電子密度分佈會較不均勻？若分子內的任何兩個原子之間，其間的陰電性相差太大，例如氫 (陰電性 2.1) 與氧 (3.5)，則氫原子上的電子會被氧原子所吸引，使得氫氧附近的電子分佈不均勻。反之，碳 (2.5) 與氫 (2.1) 之間的陰電性相差較小，因此飽和碳氫化合物都是屬於極性較小的分子。陰電性是描述一個原子搶電子的能力，陰電性大者容易搶奪其相鄰原子的電子。這是與其原子構造有關，在週期表右方的原子，因為其原子核內的質子數越來越多，正電荷較大，因此吸引電子的能力也較大。因此，分子的化學性質，幾乎都可用電子的爭奪來解釋；而分子或基團的極性大小，也可解釋大半的生物化學現象。
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■ 色層分析法的基本原理圖解
圖例

	色層分析法的系統一定要分有兩相。
	任何種類的色層分析方法，一定有兩個主要組成︰固定相 (stationary phase) 及流動相 (mobile phase)，二者各有不同的極性強度；樣本分子因其自身極性的強弱，與此二相之親和力不同。與固定相親和力大者，易留滯原地；與流動相親和力大者，易隨流動相移動，因而達成分離的目的。通常流動相為液體或氣體，而固定相可為固體或液體。若固定相為固體，則稱為吸附性 (adsorption) 層析；若為液體，則稱為分配性 (partition) 層析。
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■ 膠體過濾法的膠球
圖例

	各種膠體層析法的膠球都有許多大小孔洞。
	層析法所用的膠體大小要均一，材質堅固而耐得住高壓，並且沒有非專一性的吸附。膠體過濾的膠球內外，貫穿許多小孔徑的通路，分子量小的粒子，比較容易進入膠球中，因此被延滯流出。而離子交換法或親和層析法的膠球，其上分布有離子基團或親和基團，可以吸附目標蛋白質，以達分離效果。分離蛋白質所使用的膠球，必須以多醣類為主體；例如 Sephadex 使用葡萄聚醣，而 Sepharose 使用洋菜糖為主要材料。至於平常所說的樹脂類 (resin) 則只能用在小分子樣本，因為樹脂對蛋白質的吸附力很大，經常會使得蛋白質變性失活。
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■ 膠體過濾法是一種 partition 層析法
圖例
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	膠體過濾法根據樣本的分子大小進行分離。
	膠體過濾法的流動相與固定相都是液體，事實上根本都是同一種緩衝液，只是分成在膠體裡面 (固定相)，與在膠球外面 (流動相) 兩個不同的液相，因此是一種 partition 層析法。樣本的分子量小者，因為容易進入膠體中的固定相，因此會被滯留在膠體中，較慢被溶離出來，可以與分子量較大者分離開來。
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■ 膠球的堆疊
圖例

	膠球的堆疊要緊密，以降低膠球間的空隙。
	膠球在管柱中堆疊，要儘量密實，以便降低膠球間的空間；因為這些空間會造成亂流，並且沒有分離效果。若把膠球的大小下降，則可以降低此空間，增加膠柱的解析力，但其流率也隨著下降，必須加大壓力以便順利流洗，此即 HPLC (high pressure liquid chromatography)。因此，HPLC 所用的膠球材質必須很耐壓，多採用陶瓷、矽膠 (silica gel) 等材料所製成。
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■ 管柱的裝填方法
圖例

	多練習膠柱的裝填，並注意檢查所有預先設定的條件。
	預先算準所需要的膠體，好好平衡在指定的緩衝液，並且把該膠體及管柱，事先保存在操作的溫度下；這樣的預備工作，幾乎已經成功一半了。另有一些基本的注意事項︰ (1) 膠體裝填時，要一次倒完膠體，儘量不要中斷。 (2) 膠柱裝填完成後要充分流洗，並且使用稍高的壓力，以便使膠體裝填密實。 (3) 勿使膠體乾掉，也注意分劃收集器是否正常運作。 (4) 整個系統的溫度不可改變，尤其不可升溫，否則會產生氣泡；流洗緩衝液的溫度亦同。
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