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  蛋白質純化

  

 

膠體過濾法

蛋白質純化三個階段

 

Like dissolves like

色層分析法基本原理

膠體過濾法的膠球

膠體過濾是 partition 層析法

膠球的堆疊

管柱裝填方法

      

蛋白質的純化有三個階段

 

酵素純化過程的各個階段都有其常用的分離純化方法。

純化酵素的第一個步驟,就是打破細胞,把所有的蛋白質分離出來;這多採用鹽析或有機沉澱法,通常可以去除蛋白質以外的大部分物質,有相當大的純化效果,但目標蛋白質可能只佔總蛋白質的百分之一以下。

『部分純化』所使用的方法,幾乎是本實驗課中純化方法的主軸,多使用各種管柱層析法;通常其純度可達 50-90% 之間 (以蛋白質含量而言)。

為得到少量均質蛋白質,還得利用其他各種純化方法;通常很難定義什麼是均質蛋白質,例如目標蛋白質的水解片段也會影響其純度。幸而 99% 以上純度的蛋白質,已經可以進行很多實驗,而不會影響結果。但當製備抗體時,若此 1% 不純物質的抗原性很強,則可能造成抗體效價的低落,或專一性的不足。

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Like dissolves like

近朱者赤、近墨者黑,物以類聚,不論人類或是分子皆同。

若要分類自然界中的所有分子,可以大略分成 極性 非極性 兩大類。

極性分子上的電子分佈不均勻,常常造成分子上某些部份的電子密度較大,因而產生偶極性,偶極性會有暫時的正負電荷產生;因此兩個極性分子相遇,可利用其偶極性的正負電荷互相吸引,會有較大的親和力。

反之,非極性的分子上,其電子密度分佈較為均勻,因此不會有偶極產生,事實上非極性分子上不會帶有電荷。非極性的分子,比較喜歡與非極性的分子接近,可以看作因為無法與極性分子接近,被極性分子排斥所造成的非極性間的相互吸引力量。但也可以說是分子上電子的短暫分配不均,所形成的 凡得瓦爾 吸引力。

為何極性分子上的電子密度分佈會較不均勻? 若分子內的任何兩個原子之間,其間的 陰電性 相差太大,例如氫 (陰電性 2.1) 與氧 (3.5),則氫原子上的電子會被氧原子所吸引,使得氫氧附近的電子分佈不均勻。反之,碳 (2.5) 與氫 (2.1) 之間的陰電性相差較小,因此飽和碳氫化合物都是屬於極性較小的分子。

陰電性是描述一個原子搶電子的能力,陰電性大者容易搶奪其相鄰原子的電子。這是與其原子構造有關,在週期表右方的原子,因為其原子核內的質子數越來越多,正電荷較大,因此吸引電子的能力也較大。因此,分子的化學性質,幾乎都可用電子的爭奪來解釋;而分子或基團的極性大小,也可解釋大半的生物化學現象。

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色層分析法的基本原理圖解

色層分析法的系統一定要分有兩相。 

任何種類的色層分析方法,一定有兩個主要組成︰固定相 (stationary phase) 及 流動相 (mobile phase),二者各有不同的極性強度;樣本分子因其自身極性的強弱,與此二相之親和力不同。 與固定相親和力大者,易留滯原地; 與流動相親和力大者,易隨流動相移動,因而達成分離的目的。

通常流動相為液體或氣體,而固定相可為固體或液體。若固定相為固體,則稱為吸附性 (adsorption) 層析;若為液體,則稱為分配性 (partition) 層析。

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膠體過濾法的膠球

各種膠體層析法的膠球都有許多大小孔洞。

層析法所用的膠體大小要均一,材質堅固而耐得住高壓,並且沒有非專一性的吸附。膠體過濾的膠球內外,貫穿許多小孔徑的通路,分子量小的粒子,比較容易進入膠球中,因此被延滯流出。而離子交換法或親和層析法的膠球,其上分布有離子基團或親和基團,可以吸附目標蛋白質,以達分離效果。

分離蛋白質所使用的膠球,必須以 多醣類 為主體;例如 Sephadex 使用葡萄聚醣,而 Sepharose 使用洋菜糖為主要材料。至於平常所說的 樹脂類 (resin) 則只能用在小分子樣本,因為樹脂對蛋白質的吸附力很大,經常會使得蛋白質變性失活。

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膠體過濾法是一種 partition 層析法

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膠體過濾法根據樣本的分子大小進行分離 。

膠體過濾法的流動相與固定相都是液體,事實上根本都是同一種緩衝液,只是分成在膠體裡面 (固定相),與在膠球外面 (流動相) 兩個不同的液相,因此是一種 partition 層析法。樣本的分子量小者,因為容易進入膠體中的固定相,因此會被滯留在膠體中,較慢被溶離出來,可以與分子量較大者分離開來。

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膠球的堆疊

膠球的堆疊要緊密,以降低膠球間的空隙。

膠球在管柱中堆疊,要儘量密實,以便降低膠球間的空間;因為這些空間會造成亂流,並且沒有分離效果。若把膠球的大小下降,則可以降低此空間,增加膠柱的解析力,但其流率也隨著下降,必須加大壓力以便順利流洗,此即 HPLC (high pressure liquid chromatography)。因此,HPLC 所用的膠球材質必須很耐壓,多採用陶瓷、矽膠 (silica gel) 等材料所製成。

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管柱的裝填方法

多練習膠柱的裝填,並注意檢查所有預先設定的條件。

預先算準所需要的膠體,好好平衡在指定的緩衝液,並且把該膠體及管柱,事先保存在操作的溫度下;這樣的預備工作,幾乎已經成功一半了。

另有一些基本的注意事項︰

(1) 膠體裝填時,要一次倒完膠體,儘量不要中斷。

(2) 膠柱裝填完成後要充分流洗,並且使用稍高的壓力,以便使膠體裝填密實。

(3) 勿使膠體乾掉,也注意分劃收集器是否正常運作。

(4) 整個系統的溫度不可改變,尤其不可升溫,否則會產生氣泡;流洗緩衝液的溫度亦同。

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下一小節︰ 離子交換法

 構  造     .     純  化     .     分  析

  

  Protein/Purification/P2

本網頁最近修訂日期: 2001/06/30