生物技術方法  卷一

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第四章

 

ContentsChapter 0Chapter 1Chapter 2Chapter 3Chapter 4 . Appendix

 
     
  表現蛋白質之純化與檢定

本章目錄

  Purification and Identification of Expressed Protein  
 

台灣大學農化系     莊 榮 輝   

 
     
     
 

本 章 目 錄

 
    圖 4.1  
 

4.1   蛋白質純化方法

 

 

 

4.1.1   蛋白質抽取

表 4.1 

 

 

4.1.2   膠体過濾法

圖 4.2  

 

 

4.1.3   離子交換法

 

 

 

4.1.4   親和層析法

 

 

 

4.2   蛋白質檢定方法

 

 

4.2.1   蛋白質定量分析

圖 4.3    圖 4.4

 

 

4.2.2   酵素活性分析法

 

 

 

4.2.3   膠体電泳法

表 4.2

 

 

4.2.4   蛋白質轉印法

 

 

 

4.2.5   免疫染色法

 

 

 

參考文獻

 

 
 

  

詳細目錄  

     
 

  蛋白質構造  蛋白質純化  蛋白質分析  流程圖:A 種  B 種

 
     
     
 

表現目標基因得到蛋白質後,可以進行各種純化方法 (蛋白質抽取膠体過濾法離子交換法親和層析法 等),以便分離出目標蛋白質;同時並檢定其各種基本生化性質 (如 蛋白質定量酵素活性分析膠体電泳免疫轉印 等)。 本章是以表現蛋白質 GUS 為例,說明其純化及檢定方法;因為各種蛋白質的性質差異很大,因此每種蛋白質都有其特定的純化或檢定條件,必須個別去找出其自身的條件。本章整體實驗流程如 圖 4.1 所示。

 
     
     
  
 F4.1

 

4.1  蛋白質純化與檢定實驗操作的流程  

 

4.1

蛋白質純化方法

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利用蛋白質間 生化特性的差異,可以分離並純化出各種蛋白質。純化蛋白質的方法主要是以 色層分析法 進行,但是利用蛋白質分子物理或化學特性的沈澱方法,也是相當簡單、有效而且經濟。

 
   

 

4.1.1

蛋白質抽取

 
     
 

蛋白質在細菌中表現後,以反覆的冷凍-解凍方法打破細胞,再用 硫酸銨 把蛋白質沉澱下來,此步驟可以去除大部份核酸、多醣、脂質等雜物。

 
     
 

儀器用具:

 
 

恆溫震盪培養箱 37℃

 
 

高速冷凍離心機 及離心管 (使用 20,000 rpm 離心陀)

 
 

u使用高速離心機要注意: 離心機及離心陀的溫度要預冷完全,相對位置的兩隻離心管要平衡好,離心陀轉速絕對 不能超過最高速限

 
 

液態氮及冰筒

 
 

37℃ 溫水浴

 
 

藥品試劑:

 
 

轉型菌株 pQG11/M15 [pREP] 單一菌落

 
 

LB/amp/kan 及 IPTG (1 M stock)

 
 

Lysis buffer (50 mM Na3PO4·12H2O, pH 7.0; 0.1 M NaCl; 0.1 mM EDTA; 0.2% Triton X-100)

 
 

u 使用前添加成 10 mM b-mercaptoethanol, 25 mg/mL PMSF, 40 mg/mL lysozyme。

 
 

Buffer A-0 (50 mM Na3PO4, pH 7.0)

 
 

u 使用前每 1 L 添加 70 mL b-mercaptoethanol 成為 10 mM 最終濃度。

 
 

Buffer A-150: Buffer A-0 再加有 0.15 M NaCl

 
 

硫酸銨 (要烘乾並以研砵磨碎)

 
 

方法步驟

 
 

1) 挑取培養皿上單一菌落,培養在 15 mL 之 LB/amp/kan 液體培養基中,以 120 rpm 轉速震盪,在 37℃ 下培養過夜。

 
 

2) 取上述菌液 6 mL 加入 300 mL 新鮮 LB/amp/kan 培養基中,以 120 rpm 37℃ 培養至 A600 = 0.6 後,加入 IPTG 成為 1 mM 濃度,繼續以 120 rpm 在 37℃ 震盪培養 4 h。

 
 

3) 將菌液倒入 50 mL 離心管 (conical tube) 中離心 10 min (5,000 rpm)。

 
 

4) 倒去上清,可將菌塊連同離心管置 -20℃ 冰箱貯存。

 
 

5) 取出含菌塊之離心管置碎冰上,待菌塊溶解後,以殘存液體均勻懸濁之。再加入 10 mL lysis buffer 輕輕懸浮之。

 

XT

6) 將菌液放在液態氮中冷凍 1 min,然後在 37℃ 水浴中搖盪溶解之。如此反覆三次,儘量不要產生大量氣泡。將離心管的內容物倒入 50 mL 高速離心機的離心管內。

 
 

7) 離心 20 min (12,000 rpm, 4℃) 取上清共 _____ mL,稱為 粗抽取液 (XT);預留 100 mL 以便日後一起進行分析。

 
 

u此後樣本均得放置碎冰上,以低溫進行實驗。 

 
 

8) 此上清加入 5 mL buffer A-0 混勻後倒入燒杯,置碎冰上放冷,不時攪拌並緩緩加入固體硫酸銨 _____ gm,使成為 70% 飽和度,加完後再攪拌 10 min。

 
 

u參照 表 4.1 找出該體積所要加的固體硫酸銨,以達 70% 飽和度。 

 

TP

9) 離心 20 min (12,000 rpm, 4℃) 後小心倒去上清,取白色沈澱部份。

 

 

10) 沈澱加以 2 mL buffer A-150 均勻懸濁之,再以桌上型離心機去除不溶物質,(10,000 rpm, 5 min),共得 ______ mL,稱為 全蛋白質 (TP);預留 100 mL,連同上述 XT 置 4℃ 冷藏。

 
 

11) 其餘溶液部份準備進行膠體過濾層析,標示清楚後置 4℃ 冷藏。

 
 

註解討論:

 
 

a. 緩衝液中為何還要添加某些藥品或試劑? (如硫酸銨, NaCl, EDTA, PMSF, Triton X-100, b-mercaptoethanol 等)。

 

 

b. 某些處理的意義何在? (為何要冰浴、取沉澱或上清、冷藏或凍藏)

 

 

c. 為何反覆冷凍-解凍可以把細菌打破? 還有哪些方法可以打破菌體?

 

 

d. 以 lysis buffer 破菌時,如何得知你的細胞確實有破裂開來?

 

 

e. 在細胞打破之後,想像你的目標樣本或蛋白質,會變成什麼樣子。

 

 

f. 蛋白質沈澱時為何要緩緩加入硫酸銨? 若加太快會有何種後果?

 

 

g. 若你的目標蛋白質不會被飽和硫酸銨沈澱下來,你將如何繼續實驗? 這給你何種訊息?

   

 

T4.1
4.1  百分飽和濃度硫酸銨之添加量

0

最終硫酸銨百分飽和濃度

 

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

90

100

加入 1 L 溶液中之固態硫酸銨克數

硫酸銨起始百分飽和濃度

0

106

134

164

194

226

258

291

326

361

398

436

476

516

603

697

0

20

0

27

55

83

113

143

175

207

241

276

312

349

387

469

557

20

25

 

0

27

56

84

115

146

179

211

245

280

317

355

436

522

25

30

 

 

0

28

56

86

117

148

181

214

249

285

323

402

488

30

35

 

 

 

0

28

57

87

118

151

184

218

254

291

369

453

35

40

 

 

 

 

0

29

58

89

120

153

187

222

258

335

418

40

45

 

 

 

 

 

0

29

59

90

123

156

190

226

302

383

45

50

 

 

 

 

 

 

0

30

60

92

125

159

194

268

348

50

55

 

 

 

 

 

 

 

0

30

61

93

127

161

235

313

55

60

 

 

 

 

 

 

 

 

0

31

62

95

129

201

279

60

65

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0

31

63

97

168

244

65

70

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0

32

65

134

209

70

75

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0

32

101

174

75

80

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0

34

139

80

90

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0

70

90

100

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0

100

本表數據來自Methods in Enzymology (1990) Vol. 182, p. 291,而該表原始資料又來自Data for Biochemical Research (1969) Dawson, R.M.C. et al. (ed), 2nd edition, Oxford Univ. Press.

4.1.2

膠体過濾法

 
     
 

不同大小的蛋白質分子進入 膠體過濾 管柱,可依其 分子量 差異分離;是一種廣泛應用的 partition 色析法 (Pharmacia Biotech 操作手冊, Gel Filtration)。

 
     
 

儀器用具:

 
 

色析管柱 (Pharmacia C column, 1.6 × 100 cm)、鐵架、鐵夾及水平儀

 
 

u 此種管柱的底面積是 2 cm2,因此其總體積為 200 mL。

 
 

分劃收集器 (fraction collector, 需準備乾淨試管約 100 支)

 
 

u收集分劃有 滴數、體積、時間 三種選擇,因為我們不使用輸液幫浦,因此只能用滴數分劃,請先定好若干滴收一個體積分劃。

 
 

濃縮用離心機 (低速 5,000 rpm)

 
 

u一般細胞實驗用的離心機即可,若用高速離心機則以低速轉動,但無法蓋上離心陀的蓋子,離心過程要特別小心。

 
 

濃縮用離心管 Centriprep-30 (Amicon 4322) 請注意其使用方法

 
 

uCentriprep 系列是利用離心力壓擠小分子,使之濾過超微薄膜上的小孔洞,是一種超微過濾法 (ultrafiltration);Centriprep-30 可濾過 30 kD 以下的分子,因此可以把水分子濾走,以達濃縮效果。

 
 

藥品試劑:

 
 

膠體 Sephacryl S-300 (Pharmacia):

 
 

a. 預先以緩衝液 buffer A-150 平衡好,並且使完全沈降後的膠體體積,佔全部體積的七至八成;要先預估好膠體的使用量。

 
 

b. 膠體溫度要與操作場所的溫度一致,否則溫度變化會產生氣泡。

 
 

c. Sephacryl 系列膠體有相當大的吸附力,因此要在緩衝液加入 0.15 M 以上的 NaCl 以除去非專一性吸附。

 
 

u一般膠體過濾法均在冷房內操作,但為方便起見,本實驗均在室溫下操作;要儘量保持室溫的恆定,否則膠體溫度的變化會造成氣泡的生成。

 
 

Buffer A-150:注意使用時的溫度要與管柱膠體的溫度一致

 
 

標準分子量組合 (Bio-Rad 151-1901): 溶於 1 mL 後每組取 0.4 mL

 
 

含有 thyroglobulin (670 kD), bovine gamma globulin (158 kD), chicken ovalbumin (44 kD), equine myoglobin (17 kD), vitamin B12 (1,350)

 
 

u除了上述標準分子量的各種蛋白質外,也可加入目標酵素一起進行膠體過濾,並以活性分析定出目標酵素的溶離體積。

 
 

方法步驟

 
 

管柱裝填: 

 
 

1) 以純水沖洗玻璃管柱 (以純水上下沖洗即可,嚴禁使用試管刷);並請了解管柱的構造與拆裝方法,垂直架好管柱,以軟管連接分劃收集器,並以 buffer A-150 試看管路是否通暢;可以用止血鉗或長尾文書夾夾住出口軟管,則可控制溶離的進行。 注意系統的擺設要適當,不要裝置於交通要衝。

 
 

2) 依預估量取出 Sephacryl 膠體,注意膠體的溫度與緩衝液是否已平衡;將瓶中的膠體上下震盪,使之完全懸浮,但勿產生太多氣泡。

 
 

3) 在管柱內加入約 10 cm 高緩衝液,然後將膠體慢慢沿著管壁倒入管柱,一直加到管柱頂端,開始流洗後膠體沈降很快。當膠體上方的液面逐漸降低時,可於頂端添加膠體,以達所要高度;膠體高度約 90 cm。

 
 

4) 膠體完全沈降後,小心以 buffer A-150 加滿管柱,關閉出口,裝上頂端端蓋並連通緩衝液瓶,打開出口以重力流洗。 調整緩衝液瓶高度,使流速約每五~六秒一滴,並設定收集體積為 2.5 mL/tube。

 
 

5) 膠柱流洗約 100 mL 後,關閉出口,拆開頂端端蓋,先以滴管吸出膠體上方的溶液到剩約 1 cm高,注意勿破壞膠體表面平整; 然後打開出口,使液面下降至膠體面,再關閉出口,準備注入樣本。

 
 

樣本色析進行: 

 
 

6) 以微量吸管或滴管吸取樣本 (樣本體積不得超過膠體總體積的 3%),沿著膠體上方管壁緩慢加入,注意切勿破壞膠體的平整表面!

 
 

(樣本確實體積 _______ mL)

 
 

7) 打開出口,同時開啟分劃收集器;當樣本完全沒入膠體時,關閉出口,緩緩加入與樣本相等體積的 buffer A-150,打開出口待其慢慢進入膠體中,如此重複二次。不得擾動膠體表面,造成凹陷。

 
 

8) 暫時關閉出口,將液面高度加滿至管柱頂端,並把頂端端蓋鎖上;然後打開出口開始溶離,調整緩衝液瓶的高度,使流速為 六秒一滴

 
 

9) 要留心觀察前面幾個分劃,確定整個系統運轉無礙,小心分劃收集器最容易出問題。管柱預計將流洗過夜,收集約 80 管。

 
 

10) 收集分劃試管,進行蛋白質定量分析以及 GUS 活性測定,並請作圖。

 

GF

u蛋白質定量及 GUS 活性分析方法,請見下面數節 (4.2.1, 4.2.2)。 

 
 

11) 收集 GUS 活性區,以 Centriprep-30 濃縮至 10 mL 後,加 buffer A-0 稀釋至 20 mL,再次濃縮至 _______ mL (GF),保留 100 mL。

 
 

12) 管柱請再以 buffer A-150 流洗 100 mL 後,小心放置一旁,準備以後進行分子量測定。

 
 

u在此期間,請注意不要讓管柱膠體乾掉,也要注意膠體溫度不可變化太大,否則膠體內將會產生氣泡,無法再用,必須重新裝填。

 
 

分子量測定  

 
 

13) 進行分子量測定前一天,請先以 buffer A-150 流洗 100 mL,並檢查膠柱內有無氣泡產生,若有嚴重的氣泡或乾裂,必須重新裝填管柱。

 
 

14) 取標準分子量溶液 0.4 mL,加上純質目標酵素 0.5 mL (以親和層析法所得之 AF 部份),如上法注入管柱中,立刻開始進行膠體過濾,並收集各分劃。請依循上述所有管柱及分劃收集器的操作要點。

 
 

15) 收集所得的各分劃,進行蛋白質定量分析,可定出數個蛋白質尖峰,以作為分子量依據;另以目測法,決定 紅色高峰 的管數,則可定出 vitamin B12 的溶離管數。利用以上數據,可畫出分子量與溶離管數間的直線關係,作為分子量判定的標準校正線。

 
 

16) 同樣的一批分劃,請進行 酵素活性分析 (GUS),則可定出酵素的溶離體積,對照上述標準校正線,則可求出酵素的分子量。

 
 

 結果參考『概說Slide 9 

 
 

拆除管柱及保存膠體:

 
 

17) 若管柱長期不用,應當自管柱中取出膠體,以緩衝液清洗後,置冷藏室中保存,但絕對不要放在冷凍箱中。膠體若裝填太緊,有時可能不易取出,要有耐心地以緩衝液慢慢沖出來。

 
 

18) 膠體可以加 0.01% NaN3 防止霉菌生長,但使用前記得要洗去;再度使用時,請檢查膠體中有無灰黑色霉菌顆粒,若有結塊而不易打散者,也不要使用。

 
     
 

註解討論:

 
 

a. 在裝填管柱之前,要先估計所要的膠體體積多少,如何預估之?

 
 

b. Sephacryl 膠體層析操作,要能緊密裝填管柱膠體,為何要如此做?

 
 

c. 在實際操作裝填管柱之前,請先以空的管柱模擬整個過程。

 
 

d. 何謂色層分析法? 為何膠體過濾法是一種 partition 色層分析法?

 
 

e. 本實驗班所使用到的色層分析用具,雖已經相當齊全,但離正式研究需求,仍有少些距離。 以下列出一般常用的色析純化設備 (如 圖 4.2 ):

 
 

(1) 梯度製造器 可在離子交換法時,拉出各種溶離梯度。

 
 

(2) 輸液幫浦 可以穩定而有效地輸送緩衝液進入管柱。

 
 

(3) 管柱 可以加裝 reservoir 以便一次完成膠體的裝填;也可在膠體裝填完成之後,在膠面上方接一 adaptor 以便消除無效空間。

 
 

(4) 監視及記錄器 可同步監視管柱溶離出來的物質,且忠實記錄。

 
 

(5) 分劃收集器 可收集所有的溶離分劃,是最不可缺的用具。

 

F4.2

   
      
 

 
      
 

4.2  色層分析的設備及裝置

  

   

 

4.1.3

離子交換法

 

     
 

各種蛋白質分子上可能帶有不同的電性,經過離子交換管柱,可依其分子 帶電性 的差異而分離開來 (Pharmacia Biotech 操作手冊, Ion Exchange)。

 
     
 

儀器用具:

 
 

塑膠管柱 (Bio-Rad Econo-Pac column 732-1010, 1.5 × 12 cm)

 
 

分劃收集器 (fraction collector, 另需準備乾淨試管約 60 支)

 
 

濃縮用離心機 (低速 5,000 rpm) 及濃縮離心管 Centriprep-30

 
  
 

藥品試劑:

 
 

DEAE Sephacel (膠體體積約 15 mL,預先以緩衝液 Buffer A-0 平衡好)

 
 

Buffer A-0 (如上述配法)

 
 

Buffer A-300 溶離液:Buffer A-0 加有 0.3 M NaCl

 
 

Buffer A-500 溶離液:Buffer A-0 加有 0.5 M NaCl

 
 

方法步驟

 
 

1) 將 Econo-Pac 管柱架好,並將三向閥及軟管等組合完成。

 
 

2) 震盪 DEAE Sephacel 膠體使之懸浮,小心倒入管柱中,讓膠體慢慢沈降,在沈降過程中隨時加入 buffer A-0,勿使膠體乾掉。

 
 

3) 待膠體沈降完全後,高度應在 15 cm 左右。膠柱以 buffer A-0 一直流洗,流速快慢可以不考慮;連接好收集器,每試管收 2.5 mL。

 
 

u離子交換法的膠體平衡極為重要,可測流出液的 pH 或離子濃度,看是否與 buffer A-0 相同,若不一樣則需要再流洗之。

 
 

4) 樣本的添加方法同上述膠體過濾法,並啟動分劃收集器開始收集,當樣本全部沒入膠體後,再加入同體積 buffer A-0。以 buffer A-0 流洗 50 mL 後,去除膠體上方的緩衝液,但勿使膠體乾掉。

 
 

5) 然後依序以 buffer A-300, buffer A-500 溶離之,每批次流洗各 50 mL,注意更換濃度時,膠體上方勿殘存上一種溶液。

 

IEX

6) 收集所有分劃,進行蛋白質定量分析以及 GUS 活性測定,結果作圖。

 
 

7) 收集 GUS 活性區,並以 Centriprep-30 濃縮至 _______ mL (IEX),記得要保留 100 mL。

 
 

8) 離子交換膠體以 buffer A-0 洗過 50 mL 後,收起來交回。

 
 

註解討論:

 
 

a. 離子交換膠體一定要平衡在緩衝液中,如何確知膠體已平衡完全?。

 
 

b. 為何要逐漸升高鹽濃度? 其作用機理為何?

 
 

c. 蛋白質分子大多帶有電荷,此種性質是如何形成的?

 
 

d. 在實際操作裝填管柱之前,請先在心中或紙上模擬整個實驗過程。

  

   

 

4.1.4

親和層析法

 
     
 

若表現蛋白質上含有一段 六個 His 的片段,而親和吸著劑膠體上接有鎳離子,此蛋白質會專一性地結合到吸著膠體;洗去雜質後可用 imidazole 溶離純質蛋白質 (Pharmacia Biotech 操作手冊, Affinity Chromatography)。

 
     
 

儀器用具:

 
 

親和層析管柱 (Bio-Rad 731-1550 Poly-Prep column, 0.8 × 4 cm)

 
 

分劃收集器 (另需準備乾淨試管約 25 支)

 
     
     
 

藥品試劑:

 
 

金屬螯合親和層析膠體 (Ni-NTA agarose, QIAGEN 30210) 1 mL

 
 

u在洋菜膠粒上接有 nitrilotriacetic acid (NTA) 官能基,可以螯合鎳離子;使用前先以鎳離子飽和之。

 
 

Buffer B-300/0 (50 mM Na3PO4, pH 8.0; 0.3 M NaCl)

 
 

u在使用前才添加成 10 mM b-mercaptoethanol。洋菜膠粒上接有 nitrilotriacetic acid (NTA) 官能基,可以螯合鎳離子;使用前先以鎳離子飽和。

 
 

Buffer B-300/20: Buffer B-300/0 加有 20 mM imidazole

 
 

Buffer B-300/250: Buffer B-300/0 加有 250 mM imidazole

 
 

方法步驟

 
 

1) 親和層析膠體 1 mL 已經裝填在管柱內,成為一淡藍色膠柱。請把管柱架直在鐵架上,去除下方的填塞物,用 buffer B-300/0 流洗 20 mL 後塞住出口,準備注入樣本。

 
 

2) 除去膠面上方的緩衝液,並取出樣本 (IEX) 使其回到室溫,慢慢用滴管加到親和膠體上,小心勿弄亂膠體表面;讓樣本沒入膠體中,同時收集流出液每管 2.5 mL。

 
 

3) 待樣本全部進入膠體後,關閉出口,再慢慢加入 buffer B-300/20,打開出口收集流出液;buffer B-300/20 共流洗 30 mL。

 

AF

4) 接著以 buffer B-300/250 流洗 30 mL,方法同上,收集各分劃。

 
 

5) 所有分劃均定量蛋白質並測定酵素活性,收集酵素活性最高的數個分劃,共得 _______ mL (AF),保留 100 mL 以供分析。

 
 

註解討論:

 
 

a. 離子交換法及親和層析法操作時,當你要換用另一種溶離液時,膠體表面上能不能留有原來的緩衝液?

 

 

b. 目標蛋白質 GUS 是如何接到親和膠體上? 又是如何被溶離下來的?

 

 

c. 若你發現蛋白質無法結合到 Ni-NTA 親和膠體上去,但你確定蛋白質上有 His 片段,則如何解釋之?

 

 

d. 親和層析法的種類非常多,只要兩種物質間有專一性的親和力,就可設計以親和法來進行純化工作,請儘量舉出你所知道的各種例子。

  

   

 

 

▼ 接續 4.2.1 節 ▼

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最近修訂日期︰ 2002/07/28