生物技術方法  卷一

▼ 生物技術核心實驗  BCT 

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第三章  
 

ContentsChapter 0Chapter 1Chapter 2Chapter 3Chapter 4 . Appendix

 
     
  北方雜合分析

本章目錄

  Northern Hybridization  
 

台灣大學植病系     劉 瑞 芬   

 
     
     
 

本 章 目 錄

 
    圖 3.1  
 

3.1   RNA 製備

 

 
 

3.2   以 DIG 標定核酸探針

 
 

3.3   以酵素連結免疫反應與鹼性去磷酸脢呈色反應偵測雜合訊息

圖 3.2

 
 

參考文獻

 

 
 

  

詳細目錄  

     
      
 

基因表現的第一步是由 RNA polymerase 以轉錄反應合成出 mRNA。 由於 mRNA 是細胞內不同基因之轉錄產物,其序列與大小不一,存在量也受嚴格調控,一般約佔細胞內全部 RNA 的 1~5%;其餘 RNA 分屬於 rRNA (約佔 80~85%) 及 tRNA,在真核細胞還有 small nuclear RNA (snRNA) 與 small cytoplasmic RNA (scRNA) 等,它們分別以 RNA 的型式直接參與細胞內特定功能之執行,包括蛋白質轉譯與 mRNA 剪輯等。 因為轉錄反應是基因表現的重要調控點,在分析特定基因之表現情形時,勢必得先了解其 mRNA 的基本性質,包括長度、結構及表現量的多寡等。 本章要介紹的 北方雜合分析 (Northern hybridization analysis) 是一般用來分析 mRNA 最常見的方法;在進行北方雜合反應時,首先必須製備 RNA,製備好之 RNA 以變性洋菜膠體 (denaturing agarose gel) 進行電泳分析後,立刻以毛細管轉印法 (capillary transfer) 或其他方法轉印於尼龍膜上,再以特定核酸探針進行雜合分析,即可偵測目標 mRNA 的長度及存在量。 在下面實驗,我們一方面將以質體 pBlueGus 進行胞外轉錄反應,製備 GUS 基因的正意股 (sense) 與反意股 (antisense) RNA。另外,要自大腸桿菌 pQG11/M15[pREP4] 純化 RNA,以便以北方雜合反應分析在 IPTG 誘導情況下,表現質體 pQG11 所攜帶 GUS 基因的表現情形。實驗流程如 圖 3.1 所示。

 
     
     
 F3.1
 

 

圖 3.1 北方雜合分析實驗操作流程 (放大圖)

 

3.1

RNA 製備

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自細胞抽取 RNA 的步驟主要包括打破細胞、以特定方法移除細胞內的蛋白質和 DNA、及將 RNA 沉澱出來。 一般用於打破細胞的方法包括在低溫下以研缽研磨,或應用均質機將細胞打破等,而將蛋白質與 DNA 移除的方法則包括了酵解、有機溶劑萃取、酒精沉澱及氯化銫梯度離心等。 不論採用哪一種方法,最需費心者莫過於 RNase 的問題。 由於 RNase 會降解 RNA,在 RNA 製備過程中,能否充分避開 RNase 的作用便成了決定 RNA 品質好壞的關鍵因子。 要解決這個問題,首先得注意的是存在於外在環境的 RNase,務求所有實驗器皿都是 RNase-free,因此電泳槽、玻璃及塑膠器皿、反應所需之溶液及二次水等,都必要預先仔細處理,實驗操作者也必須隨時帶上手套 (Sambrook et al., 1989)。 另一個問題則是細胞內原本就有的 RNase 活性;為解決這部份的問題,應在收集到生物材料之後立刻進行 RNA 的製備工作。 若須暫時儲存,則應以液態氮將生物材料急速冷凍後,儲存於 -80℃ 冷凍櫃;當進行 RNA 製備時,一旦取出儲存於冷凍櫃的材料,應立即以液態氮研磨的方式打破細胞,並適時加入 RNA 萃取緩衝液,以避免 RNase 作用。 一般 RNA 萃取緩衝液都含有特定的 RNase 抑制劑,例如 diethylpyrocarbonate (DEPC; Fedorcsak and Ehrenberg, 1966), guanidium thiocyanate (GTC; Chirgwin et al., 1979; McDonald et al., 1987) 或 vanadyl-ribonucleoside complexes (Berger and Birkenmeier, 1979) 等,以便在細胞被打破的剎那,即時抑制細胞堛 RNase。 由於某些 RNase 抑制劑會抑制特定的反應,例如 in vitro translation 等,在選用 RNA 製備方法時,應先弄清楚所使用的 RNase 抑制劑會不會影響到後續反應,以免功虧一簣。

 
     

3.1.1

自大腸桿菌抽取 RNA

 
     
 

之前各組成員已分別構築出表現質體 pQG11,pQG11 在 JM109 菌株已可表現出 GUS,但表現量並不高。 若要令 T5 promotor 之啟動受到更好的調控,應進一步將 pQG11 轉形至大腸桿菌菌株 M15[pREP4]。 M15[pREP4] 可持續表現 lac repressor,pQG11 上 T5 promoter 的活性將因而受到抑制,但一旦加入 IPTG 就能誘導 GUS 基因被大量表現。 在這一節的實驗堙A我們將分別自經 IPTG 誘導與未經誘導之 pQG11/M15[pREP4] 菌體抽取 RNA,以便以北方雜合反應分析 GUS mRNA 之表現情形。 下面所採用的方法適用於大腸桿菌及其他革蘭氏陰性菌 RNA 之抽取,實驗進行時先以 lysozyme 分解細胞壁,再以 sodium dodecyl sulfate (SDS) 裂解原生質膜 (Summers, 1970);之後加入適量的氯化鈉溶液將 SDS、蛋白質及大腸桿菌的染色體 DNA 一併沉澱下來,並以離心法移除,存留於上清液的 RNA 則以酒精沉澱。 實驗過程所使用的 RNase 抑制劑為 DEPC。

 
     
 

儀器用具:

 
 

恆溫震盪培養箱 37℃

 
 

冰浴

 
 

微量離心機

 
 

分光光度計 (Hitachi U-1100 spectrophotometer)

 
 

藥品試劑:

 
 

大腸桿菌菌株 pQG11/M15[pREP4]

 
 

LB 培養液

 
 

Ampicillin (100 mg/mL)

 
 

Kanamycin (25 mg/mL)

 
 

IPTG (1 M)

 
 

Protoplasting buffer (15 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.45 M sucrose; 8 mM EDTA, stored at 4℃)

 
 

Lysozyme (50 mg/mL)

 
 

Gram-negative lysing buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM NaCl; 1 mM sodium citrate; 1.5% SDS)

 
 

Diethylpyrocarbonate (DEPC)

 
 

飽和氯化鈉溶液 (以 40 g 氯化鈉溶解於 100 mL dH2O/DEPC)

 
 

絕對酒精及 70% 酒精

 
 

方法步驟:

 
 

大腸桿菌 pQG11/M15[pREP4] 之培養:

 
 

1) 將 pQG11/M15[pREP4] 接種於 2 mL 含 ampicillin (100 mg/mL) 及 kanamycin (25 mg/mL) 之 LB 培養液,於 37℃ 震盪培養過夜。

 
 

2) 隔日早晨,取 0.5 mL pQG11/M15[pREP4] 過夜培養液,加入 25  mL含有 ampicillin (100 mg/mL) 與 kanamycin (25 mg/mL) 之 LB 培養液,於 37℃ 震盪培養 2 h。

 
 

3) 加入25 mL 1 M IPTG,繼續放置於 37℃ 震盪培養。

 
 

4) 經過 4 h 後,取出 pQG11/M15[pREP4] 培養液,開始進行 RNA 製備工作。

 
     
 

製備 RNA:

 
 

注意! 進行以下 RNA 製備實驗時,除了使用依上述步驟所準備的 pQG11/M15[pREP4] 培養液外,請記得向助教領取未經 IPTG 誘導之 pQG11/M15[pREP4] 培養液當做對照組。每次吸取限制脢時,請換新的微量吸管頭以免造成污染。

 
 

1) 取出 4 支 1.5 mL 微量離心管,分別標示為 I-1, I-2, U-1 與 U-2。

 
 

2) 取 3 mL 經 IPTG 誘導之 pQG11/M15[pREP4] 培養液平均分置於微量離心管 I-1 與 I-2。

 
 

3) 取 3 mL 未經 IPTG 誘導之 pQG11/M15[pREP4] 培養液平均分置於微量離心管 U-1 與 U-2。

 
 

4) 以 8,000 rpm (4℃) 離心 5 min,小心倒掉上清液,並以微量吸管盡量吸掉殘留之液體。

 
 

5) 各加入 0.5 mL protoplasting buffer,以微量吸管將大腸桿菌充分懸浮。

 
 

6) 再加入 1 mL protoplasting buffer 與 12 mL 50 mg/mL lysozyme,混合均勻之後,移置於冰浴中作用15 min。

 
 

7) 以 7,000 rpm 於 4℃ 離心 5 min。

 
 

8) 小心倒出上清液,並以微量吸管盡量吸掉殘留之液體。

 
 

9) 各加入 75 mL gram-negative lysing buffer 及 2 mL DEPC,以微量吸管小心懸浮沉澱於管底之大腸桿菌原生質體,並離心數秒。

 
 

在以微量吸管懸浮大腸菌原生質體時,一旦 pellet 被充分打散即應停止懸浮動作,以避免大腸菌 DNA 斷裂可能造成的問題。

 
 

DEPC 可能是一種致癌物質,使用時請在抽氣櫥內操作。

 
 

10) 將微量離心管放入 37℃ 恆溫水槽作用 5 min。

 
 

11) 作用完畢之後,將離心管移到冰浴中靜置 5 min。

 
 

12) 加入 38 mL 飽和氯化鈉溶液,以手指頭輕彈管壁,充分混合均勻。

 
 

13) 靜置於冰浴中作用 10 min,此時應有白色沉澱出現。

 
 

14) 以 13,000 rpm 於 4℃ 離心 10 min。

 
 

15) 將上清液移至新的微量離心管,並加入 0.3 mL 絕對酒精。

 
 

16) 混合均勻後將離心管放置於 -20℃ 過夜,以便沉澱 RNA。

 
 

RNA 在酒精內相當穩定,若須長期保存,可停在這一步。

 
 

隔天:

 
 

17) 以 14,000 rpm 於 4℃ 離心 15 min。

 
 

18) 小心倒掉上清液後,加入 300 mL 70% 酒精。

 
 

19) 以 14,000 rpm 於 4℃ 離心 5 min 之後,小心倒掉上清液。

 
 

20) 將微量離心管倒置於桌面上 30 min,以便風乾 RNA。

 
 

21) 將 RNA 溶解於 30 mL dH2O/DEPC。

 
 

22) RNA定量:取 5 mL RNA,加入 995 mL dH2O/DEPC 稀釋之後,以分光光度計測其在 260 nm 與   280 nm 之吸光值 (記得使用石英測光管),並計算 RNA 之濃度與 A260/A280 之比值。

 
 

RNA 溶液在 260 nm 之吸光值為 1.0 時,則濃度相當於 40 mg/mL,而其 A260/A280 之比值應為 1.7~2.0 (DNA 則為 1.8 左右)。

 
 

這四個 RNA 樣本將於後續實驗中,分別以甲醛洋菜膠體電泳進行分析 (3.3.1.2)。

 
 

註解討論:

 
 

a. RNA 製備過程中為何須要加入 DEPC? DEPC 的作用方式為何? 它會 modify RNA 嗎?

 
 

b. 在加入飽和氯化鈉溶液後,所得到的白色沉澱包含那些成份?

 
 

c. 以上述方法所得到的 RNA 沉澱除了 RNA 之外,可能還會包含小量 DNA 與蛋白質,但應不致於干擾到後續要進行的北方雜合反應。

   

 

3.1.2

胞外轉錄反應 (in vitro transcription)

 
     
 

由於 RNA 聚合脢一般由數個次單元組合而成,早先要在試管內應用 RNA 聚合脢的轉錄活性合成 RNA 並非易事,但這個問題在 SP6 (Bulter and Chamberlin, 1982), T3 (Morris et al., 1986) 及 T7 (Davanloo et al., 1984) 等噬菌體之 RNA聚合脢陸續被發現以後,情況已完全改觀。 這主要是因為這類 RNA 聚合脢由一條多胜汰 (polypeptides) 所構成,其在進行轉錄反應時所須辨認的啟動子 (promoter) 長度僅 20 bp 左右,而且轉錄起始位置非常明確,轉錄效能良好,成了目前進行胞外轉錄反應時的最佳選擇 (Krieg and Melton, 1984; Metlon et al., 1984; Studier and Moffatt, 1986; Tabor and Richardson, 1985)。 要進行胞外轉錄反應時,僅需將目標基因次選殖 (subclone) 至帶有 SP6, T3 或 T7 啟動子的轉錄載體,或者運用 PCR 技術在基因的一端加上 SP6, T3 或 T7 啟動子的序列,即可運用對應的 RNA 聚合脢活性在試管內合成正意股或反意股 RNA。 以質體 DNA 為模版進行胞外轉錄反應前,應先用限制脢自目標基因的一端切開,以免轉錄反應持續進行至載體的序列 (run-on),但在選擇限制脢切位時應避免使用目標基因也帶有的切位;限制脢內切好之質體 DNA 經 phenol/chloroform 萃取之後,即可用來進行胞外轉錄反應。 在下列實驗堙A我們要使用的質體是 pBlueGus。

 
     

3.1.2.1

質體 DNA 酵解反應與洋菜膠體電泳分析

 
     
 

本實驗以 BamHI 與 HindIII 酵解 pBlueGus,並以洋菜電泳分析產物。

 
     
 

儀器用具:

 
 

微量離心機

 
 

37℃ 恆溫水槽

 
 

Mupid II 迷你電泳槽及鑄膠器

 
 

UV transilluminator

 
 

防護面罩

 
 

拍立得相機

 
 

藥品試劑:

 
 

質體 pBlueGus DNA (由助教提供)

 
 

限制脢 BamHI 與 HindIII (BRL)

 
 

10×Reaction buffer 2 (BRL)

 
 

10×Reaction buffer 3 (BRL)

 
 

Agarose

 
 

1×TAE 電泳緩衝液

 
 

DNA 分子量標記 (l DNA/HindIII, 0.5 mg/mL)

 
 

10×追蹤染劑 (0.25% bromophenol blue; 0.25% xylene cyanol; 0.1 M EDTA; 50% glycerol)

 
 

Ethidium bromide (500 mg/mL)

 
 

拍立得 667 底片

 
 

方法步驟:

 
 

1) 取兩支 1.5 mL 微量離心管,分別標示為 #1 與 #2 之後,依下表所列順序,逐一加入酵解反應所需各項物質 (體積單位為 mL)。

 
 

注意:應等所有成份都加了之後,再加入限制脢。

 
 

 

#1

#2

pBlueGus/ HindIII

pBlueGus/BamHI

dH2O

7

7

10×Reaction Buffer  

Buffer 2  

Buffer 3

2

2

pBlueGus DNA

10

10

Restriction enzyme

HindIII

BamHI  

1

1

Total volume

20

20

 
 

2) 以手指頭輕彈微量離心管,以便均勻混合管中各項物質。

 
 

3) 離心數秒後,放置於 37℃ 恆溫水槽作用 1~2 h。

 
 

4) 請利用這一段時間參照『基本操作技術』所描述的步驟準備一片1.2% 洋菜膠體。

 
 

u Ethidium bromide 是強力致癌物質,嚴禁戴著手套到處亂摸!

 
 

5) 自恆溫水槽取出微量離心管,離心數秒後暫存冰中備用。

 
 

6) 擬進行電泳分析時,請拿出 3 支 1.5 mL 微量離心管,分別標示為 #1, #2 與 #3,並依下表所示在各離心管逐一加入適量之 DNA 與 10× 追蹤染劑 (體積單位為 mL)。

 
 

 

 

#1

#2

#3

pBlueGus/HindIII

pBlueGus/BamHI

l DNA/HindIII

DNA sample

2

2

1

dH2O

7

7

8

10×追蹤染劑

1

1

1

Total volume

10

10

10

 
 

7) 把膠片移至電泳槽,注入適量電泳緩衝液,以微量吸管 P20 逐一將樣本吸入注出數次使混合均勻,並小心注入膠片的樣本槽中。

 
 

8) 接好電極線以定電壓 100 V 進行電泳,待追蹤染劑移動至膠體三分之二處時,關閉電源,將膠體移至 UV transilluminator box,以拍立得相機拍照 。

 
 

u DNA 泳動方向為 (-) 向 (+)。 此外,在 UV transilluminator box 上直接觀察 DNA 色帶時,沒戴眼鏡的同學應戴上護目鏡或面罩,以避免 UV 灼傷;含有 ethidium bromide 之洋菜膠體請丟至專用容器中!

 
 

註解討論:

 
 

a. 請檢視 pBlueGus 的 map,想想為何要選用 BamHI 與 HindIII? 可以選用其他切位嗎?

 
 

b. 如果酵解反應不完全,會對後續的胞外轉錄反應造成什麼影響?

   

 

3.1.2.2

phenol/chloroform 進行 DNA 萃取

 
 

儀器用具:

 
 

微量離心機

 
 

藥品試劑:

 
 

Plasmid DNA 酵解產物: #1 (pBlueGus/HindIII), #2 (pBlueGus/BamHI)

 
 

Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) 以下簡稱為 PCI

 
 

Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) 以下簡稱為 CI

 
 

3 M NaOAc (醋酸鈉 pH 5.2)

 
 

純酒精及 70% 酒精

 
 

方法步驟:

 
 

u 注意! 進行這一部份實驗之前,請先確定 pBlueGus/HindIII 與 pBlueGus/ BamHI 兩者的酵解反應都已經完全。

 
 

1) 於酵解反應 #1 與 #2 之微量離心管分別加入 182 mL 去離子水。

 
 

2) 以 200 mL PCI 萃取一次,亦即加入 PCI 後,以 vortex 震盪混合,並在室溫離心 3 min。

 
 

3) 以微量吸管 P200 將上層液移至新的微量離心管。

 
 

4) 加入等體積之 CI,以 votex 充分震盪混合,並在室溫離心 3 min。

 
 

5) 以微量吸管 P200 將上層液移至新的微量離心管。

 
 

6) 加入 0.1 倍體積之 3 M NaOAc (pH 5.2) 及 2.5 倍體積絕對酒精。

 
 

7) 置於 -20℃ 過夜,或於 -80℃ 放置 30 min,以便沈澱 DNA。

 
     
 

隔天:

 
 

1) 自冷凍櫃取出微量離心管,以 14,000 rpm 離心 10 min。

 
 

u 注意:請利用這一段時間參照『基本操作技術』所描述的步驟準備一片 1.2% 洋菜膠體。 Ethidium bromide 是一種強力致癌物質,嚴禁戴著手套到處亂摸!

 
 

2) 小心地倒出上清液。

 
 

3) 徐徐加入 0.5 mL 之 70% 酒精 (預先放在 -20℃ 預冷)。小心不要動到 DNA 沈澱。

 
 

4) 以 14,000 rpm 低溫離心 5 min 之後,倒去上清液,並將微量離心管倒置於一張乾淨的衛生紙上 30 min,以便風乾 DNA。

 
 

u 也可以用 SpeedVac 乾燥 DNA,但應小心處理,以免 DNA pellet 不見了。

 
 

5) 以 10 mL dH2O/DEPC 溶解 DNA。

 
 

6) 依照下表,自 pBlueGus/BamHI 與 pBlueGus/HindIII 各取 1 mL DNA 以洋菜膠體電泳進行分析,並估算其濃度。

 
 

u DNA濃度之估算請以 l DNA/HindIII 量為參考值。

 
 

 

 

#1

#2

#3

#4

pBlueGus /HindIII

pBlueGus /BamHI

lDNA /HindIII

lDNA /HindIII

DNA sample

1

1

1

2

dH2O

8

8

8

7

10×追蹤染劑

1

1

1

1

Total volume

10

10

10

10

 
     
 

註解討論:

 
 

a. 模版 DNA 是否夠乾淨是胞外轉錄反應能否成功的重要因子。

   

 

3.1.2.3

胞外轉錄反應

 
 

儀器用具:

 
 

微量離心機

 
 

藥品試劑:

 
 

Plasmid DNA 酵解產物 pBlueGus/HindIII 及 pBlueGus/BamHI

 
 

5×Transcription buffer (200 mM Tris-Cl, pH 8.0; 40 mM MgCl2; 10 mM spermidine-(HCl)3; 125 mM NaCl; BRL)

 
 

NTPs (含 ATP, CTP, GTP及UTP 各 2.5 mM)

 
 

RNase 抑制劑 RNasin (40 U/mL)

 
 

T7 與 T3 RNA polymerase (BRL)

 
 

dH2O/DEPC

 
 

100 mM DTT (dithiothreitol)

 
 

DNase (RNase-free)

 
 

Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1), 以下簡稱 PCI

 
 

Chloroform/isoamyl alcohol (24:1), 以下簡稱 CI

 
 

方法步驟:

 
 

u 注意:進行下列實驗時,請務必戴手套!

 
 

1) 取 4 支 1.5 mL 微量離心管,分別標示  #1, #2, #3 與 #4,再依下表依序在 #1 與 #2 加入胞外轉錄反應所需各項試劑 (單位 mL):

 
 

  

Gus#1

Gus#2  

Rxs

(pBlueGus/HindIII)

(pBlueGus/BamHI)

dH2O/DEPC

25 - x

25 - x

Plasmid DNA

x (up to 2 mg)

x (up to 2 mg)

5×transcription buffer

10

10

NTP (2.5 mM each)

10

10

RNasin (40 U/mL)

1

1

DTT (100 mM)

2.5

2.5

RNA polymerase  

T3 RNA polymerase

T7 RNA polymerase

  (50 U/mL)

1.5

1.5

Total volume

50

50

 
 

u 注意:在逐一加入各項反應試劑時,微量離心管維持於室溫即可,以免在低溫時,DNA 遇到轉錄緩衝液所含 spermidine 產生沈澱。

 
 

2) 以手指頭輕彈離心管壁使混合均勻,離心數秒後放置於 37℃ 恆溫水槽作用 1 h

 
 

3) 反應結束時,自 #1 與 #2 分別取出 4 mL反應物,放到微量離心管 #3 與 #4 中,將 #3 與 #4 存放於 -20℃ 冷凍櫃中。

 
 

4) 取 1 mL DNase 加到 #1 與 #2,混合均勻後放置於 37℃ 作用 15 min,以便去除 DNA 模版。

 
 

5) 反應結束後,加入 53 mL dH2O/DEPC,以 100 mL PCI 萃取一次,劇烈震盪後,離心 14,000 rpm 5 min。

 
 

6) 以微量吸管 P200 將上層液移至一新的微量離心管,下層之 PCI 以 100 mL dH2O/DEPC 反萃取 (back-extraction) 一次。

 
 

7) 以微量吸管 P200 將上層液移至步驟 6) 之新離心管。

 
 

8) 估計兩次上層液聚集之後的總體積,並以等體積之 CI 萃取一次,劇烈震盪後,離心 14,000 rpm 5 min。

 
 

9) 以微量吸管 P200 將上層液移至一支新的微量離心管,加入 0.1 倍體積之 3 M NaOAc (pH 5.2) 及 2.5 倍體積之絕對酒精。

 
 

10) 混合均勻,並置於 -20℃ 過夜,以便沈澱 RNA。

 
 

 隔天:

 
 

1) 自冷凍櫃取出微量離心管,以 14,000 rpm 於 4℃ 離心 10 min。

 
 

2) 仔細移去上清液之後,加入 0.5 mL 70% 酒精。

 
 

3) 以 14,000 rpm 於 4℃ 離心 5 min。

 
 

4) 去除上清液之後,將微量離心管倒置於一張乾淨的衛生紙上大約 30 min,以便風乾 RNA。

 
 

5) 以 10 mL dH2O/DEPC 溶解 RNA 沈澱。

 
 

註解討論:

 
 

a. RNasin 是一種 RNase 抑制劑 (Blackburn et al., 1977),一般進行胞外轉錄或轉譯反應時,都需添加 RNasin,以避免 RNA 降解的問題。

 
 

b. 以上述胞外轉錄反應所合成出來的 #1 與 #2 RNA 各有多長?

 
 

c. 如何得知 #1 與 #2 RNA 各為 GUS 基因的正意股或反意股 RNA?

 
 

d. 若要以上述胞外轉錄反應製造帶 cap 的 mRNA,可以怎麼進行?

 

   

 

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3.2

DIG 標定核酸探針

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DNA 探針一般可以用 32P, 35S 或非放射性物質如 biotin 及 digoxigenin (DIG) 加以標定;標定時利用 DNA 聚合脢的活性,在 DNA 聚合反應中,另加入 [a-32P] dATP, [a-32P] dCTP 或 DIG-11-dUTP 等標定物質,所合成出來的即是被標定的核酸片段。 目前常見的方法包括 nick translation (Rigby et al., 1977), random priming (Feinberg and Vogelstein, 1983) 與 polymerase chain reaction (PCR; Mullis et al., 1986; Saiki et al., 1988) 等。 若須對 DNA 進行 end labeling 時,可以進行 kinase 或 filling-in reaction。 前者以  [g-32P] ATP 為 phosphate donor,利用 T4 polynucleotide kinase 的活性對帶有 5'-OH 的 DNA 進行標定。人工合成的寡核甘酸 (oligonucleotides) 5' 端為 -OH group,可直接用於 kinase reaction;一般 DNA 片段,若 5' 端帶有 phosphate group,最好先經 phosphatase 處理,再進行 kinase reaction。 Filling-in reaction 是將 DNA 以特定限制脢切開,露出 recessed 3' termini 後,利用 Klenow 的活性把 3' 端補齊 (filling-in); 因此,只要加入適當的 [a-32P] dNTP,即可在 DNA 的 3' 端進行標定。 此外,也可以應用 bacteriophage T4 DNA polymerase 的 3' 5' exonuclease 活性製造 recessed 3' termini,再進行 filling-in (Challberg and Englund, 1980)。 至於正意股或反意股 RNA 探針,則可以 [a-32P] UTP 或 DIG-11-UTP 等為標定物質,應用胞外轉錄反應加以標定 (Melton et al., 1984)。 下面要介紹的是目前最常用的方法: random priming 及 PCR。

 
   

 

3.2.1

Random priming

 
     
 

DNA 聚合脢要進行 DNA 聚合反應時一定要有 引子 (primer),因為它只能以引子所提供的 3'-OH 為起始點進行延伸 (extension) 的工作,而不能就地重新合成新的 DNA (de novo synthesis)。 一般實驗常以機器合成之寡核甘酸為引子進行 DNA 聚合反應,這時固然可以根據已知序列設計核酸引子,但也可以採用 逢機引子 (random primers)。 所謂逢機引子即其序列為逢機序列,不經特別設計,目前應用最廣者是以自動化機器所合成的、六到八個核甘酸長的寡核甘酸混合物;反應進行中若有任何一條逢機引子結合到模版 DNA,即可引導 DNA 聚合反應之進行。 以 random priming 方法進行核酸標定,是以逢機引子引導 Klenow fragment (large fragment of E. coli DNA polymerase I; Klenow and Henningsen, 1970) 進行 DNA 聚合反應,並在反應過程中添加 [a-32P]dNTP 或 DIG-11-dUTP 等標定物質。 而為了避免 random priming 也發生於載體部份的 DNA,最好不要直接以質體 DNA 為模版進行標定反應,而應預先將目標 DNA 自載體切除出來。

 
     
 

儀器用具:

 
 

微量離心機

 
 

沸水浴及冰浴

 
 

藥品試劑:

 
 

模版 DNA (pBlueGus 之 BamHI-HindIII DNA 片段,將由助教提供)

 
 

0.2 M EDTA, pH 8.0

 
 

4 M LiCl

 
 

Random priming kit (Roche):

 
 

Hexanucleotide mix (random primer)

 
 

dNTP mixture (1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP, pH 7.5)

 
 

Klenow enzyme (2 U/mL)

 
 

絕對酒精

 
 

70% 酒精

 
 

TE (10 mM Tris-Cl, pH 8.0; 1 mM EDTA)

 
 

方法步驟:

 
 

u 以下反應條件與步驟主要參照 random priming kit 製造廠商所提供之產品說明書。

 
 

1) 取 100 ng 模版 DNA,加入適量去離子水,把體積補足為 15 mL。

 
 

2) 於沸水中加熱 10 min。

 
 

u 請記得以夾子固定微量離心管之管蓋部份,以免離心管在加熱過程中蓋子爆開、進水!

 
 

3) 加熱後,迅速把微量離心管移至冰浴中,靜置數分鐘。

 
 

4) 離心數秒後,依序加入下列三種試劑:

 
 

2 mL hexanucleotide mix

 
 

2 mL dNTP mixture

 
 

1 mL Klenow enzyme

 
 

5) 以指頭輕彈離心管,以便混合均勻。

 
 

6) 短暫離心後,置於 37℃ 恆溫水槽中作用 2 h。

 
 

u 反應時間至少須要 1 h,最長可反應過夜。

 
 

7) 作用完畢之後,加入 2 mL 之 0.2 M EDTA,以便終止 DNA 聚合反應。

 
 

8) 加入 2.5 mL 4 M LiCl 及 75 mL 純酒精,混合均勻,置 -20℃ 過夜。

 
 

隔天:

 
 

1) 於 13,000 rpm,4℃ 離心 15 min。

 
 

2) 倒出上清液,加入 50 mL 之 70% 酒精,再離心 5 min。

 
 

3) 倒出上清液並風乾 DNA。

 
 

4) 最後以 50 mL TE 溶解 DNA。

 
 

註解討論:

 
 

a. 影響標定效率的因子主要包括模版 DNA 的純度、使用量與反應時間;在進行標定反應時,若 DNA 使用量較高 (最高 2 mg),或反應時間較長 (最長 20 h),可獲得的標定 DNA 量一般比較多。

 
 

b. 標定反應完成後以酒精沉澱標定 DNA,主要是為了去除 unincorporated nucleotides。 由於 unincorporated nucleotides 一般不會影響到後續的南方雜合反應,酒精沉澱這一步或可省略。但如果所製備的探針是要用於原位雜合反應 (in situ hybridization) 時,最好仍進行酒精沉澱。

 
 

c.  本實驗以 LiCl 取代一般常用的鹽類進行酒精沉澱,是因為 LiCl 在酒精裡的溶解度比較好,容易去除。

 
 

d. 不要對 DIG- 標定之 DNA 進行 phenol/chloroform 萃取,因為 DIG 可能會存留在 organic phase。

   

 

3.2.2

PCR

 
     
 

PCR 是近年來極受歡迎的 DNA 增殖技術,應用層面非常廣,其中包括了核酸探針之製備。如果一段 DNA 已經被次選殖至載體上,要以 PCR 擴增這段 DNA 時,可根據質體 multiple cloning sites 兩邊的序列,選用適當的核酸引子對夾出目標 DNA;比較常用的引子包括 SP6, T3 與 T7 promoter primer, M13/pUC forward 與 reverse primers 等。 進行 PCR 反應時若同時添加 [a-32P]dNTP 或 DIG-11-dUTP,所增殖的 DNA 即被 32P 或 DIG 所標定,所以 PCR 是製備核酸探針非常便捷好用的方法。

 
     
 

儀器用具:

 
 

微量離心機

 
 

PCR 反應器

 
 

藥品試劑:

 
 

模版 DNA: pBlueGus 質體 DNA (~50 pg)

 
 

核酸引子對: T3 promoter primer 與 T7 promoter primer (各 2 mM)

 
 

礦物油 (是否需要視 PCR 反應器機型而定)

 
 

PCR DIG probe synthesis kit (Roche), 內含:

 
 

Taq DNA polymerase (Expand High Fidelity, 3.5 U/mL)

 
 

10×PCR DIG probe synthesis mix (2 mM dATP, dCTP, dGTP, 1.9 mM dTTP, 及 0.1 mM DIG-11-dUTP, pH 7.0)

 
 

Expand high fidelity buffer with MgCl2 (10×)

 
 

方法步驟:

 
 

u 以下反應條件主要參照 PCR DIG probe synthesis kit 製造廠商所提供之產品說明。

 
 

1) 取一支 0.5 mL 微量離心管,依下表逐一加入各項試劑 (單位 mL):

 
 

Reagents

Volume

Final conc.

dH2O

28.5

-

10×PCR buffer

5

1×

10×PCR DIG mix

5

200 mM dNTP

T3 promoter primer

5

0.2 mM

T7 promoter primer

5

0.2 mM

pBlusGus DNA

1

~50 pg

Taq DNA polymerase

0.5

0.5 U

Tot al volume

50

 

 
 

2) 以手指頭輕彈管壁使各項試劑混合均勻。

 
 

3) 短暫離心後,徐徐加入100 mL 礦物油。

 
 

u 有些 PCR 反應器不需使用礦物油。

 
 

4) 在 PCR 反應器上設定 PCR 反應條件:

 
 

Denaturation︰ 94/10 min

 
 

擴增反應

 
 

30 循環之 [94/45 s ® 55/1 min ® 72/2 min]

 
 

最後之 elongation step: 72℃/10 min

 
 

5) 將微量離心管移至反應器上,並開始進行 PCR 反應。

 
 

6) 反應完成後,以微量吸管吸出礦物油,並取出 5 mL PCR 反應產物,進行洋菜膠體電泳分析。

 
 

註解討論:

 
 

a. PCR 標定產物所呈現的 molecular mass 應比未標定者大。

 
 

b. 影響 PCR 反應之因子主要包括哪些?

 
 

c. 以 PCR 及 random priming 進行標定反應各有哪些優點?

 
   

 

 

接續 3.3 節 ▼   

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最近修訂日期︰ 2004/03/23