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3.3

變性膠體電泳與北方雜合分析

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mRNA 一般會捲繞成特定的三級結構，並與某些蛋白質結合，而以 messenger ribonucleoprotein particles (mRNPs) 的型式存在於細胞內。 由於進行電泳分析時，影響核酸泳動速率的因子主要包括了核酸構形 (conformation) 與大小，為了去除核酸構形所造成的影響，一般以電泳分析 RNA 時都採用變性膠體電泳；在進行這一類電泳分析時，由於 RNA已經被 denatured，影響其泳動速率的因子主要是長度。 一旦 RNA 以變性膠體電泳解析好，即可進一步進行北方轉印與雜合分析 。

　
　 　

 

3.3.1

變性膠體電泳 (denaturing gel electrophoresis)

 　
　 　 　
　

在進行 RNA 變性膠體電泳分析時，如果所要分析的 RNA 比較小 (<1,000 bases)，可以選用聚丙烯醯胺膠體 (polyacrylamide gel)，此時所使用之變性劑 (denaturing reagent) 主要是尿素 (urea)；這個方法一般也被用來分析核酸定序反應的產物。若所欲分析的 RNA 分子較大，可用變性洋菜膠體電泳 (agarose gel electrophoresis) 分析，所使用的變性劑為 (1) glyoxal/dimethyl sulfoxide (DMSO) (McMaster and Carmichall, 1977) 或 (2) 甲醛 (Lehrach et al., 1977)。 以 glyoxal/DMSO 系統進行電泳分析時，所使用之電泳緩衝液為 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)；為了避免電泳進行過程中，電泳槽兩邊之 pH 落差過大，以致影響電泳的進行，最好能在兩極之間加裝電泳緩衝液循環裝置，而且核酸泳動速率也應儘量放慢。以甲醛為變性劑時不會有這些問題，因此操作比較省事，但必須注意，甲醛氣體為有毒物質，配製甲醛洋菜膠體及進行電泳分析時應在抽氣櫥裡操作。 本實驗將採用甲醛洋菜膠體電泳法。

 　
　 　 　

3.3.1.1

清理電泳槽

 　
　 　 　
　

前面已強調過，能否將 RNase 去除乾淨是 RNA 相關實驗成功與否的主要決定因子。 在進行 RNA 電泳分析時，為了避免 RNase 可能帶來之問題，實驗室內最好能騰出一套電泳器材，專門用於 RNA 之分析。如果所使用的電泳槽及鑄膠器一般也用於進行 DNA 分析的話，在進行 RNA 變性膠體電泳分析前應仔細地加以清理；清理時除了以中性清潔劑徹底沖洗乾淨外，最好再用 3% 過氧化氫 (H2O2) 浸泡10 min。

　
　 　 　
　

儀器用具：

　
　

Mupid II 迷你電泳槽及鑄膠器

　
　

藥品試劑：

　
　

中性清潔劑 (abSolve, DuPont NEF971)

　
　

3% H2O2 (過氧化氫)

　
　

dH2O/DEPC

　
　

方法步驟：

　
　

◆ 注意：進行下列步驟時，請務必戴手套！

　
　

1) 以中性清潔劑仔細清洗電泳槽，再以二次水洗去清潔劑，並稍加晾乾。

　
　

2) 以 3% 過氧化氫注滿電泳槽，放置於室溫 10 min。

　
　

3) 倒掉過氧化氫溶液。

　
　

4) 以 dH2O/DEPC 徹底地沖洗電泳槽。

　
　 　

 

3.3.1.2

甲醛洋菜膠體電泳 (formaldehyde-agarose gel electrophoresis)

 　
　 　 　
　

甲醛是一種常用的 RNA 變性劑。在進行甲醛洋菜膠體電泳分析時，必須先配製含有甲醛的洋菜膠體，RNA 也必須先以甲醛及 formamide 進行變性處理，以確保其二度結構充分被打開。由於甲醛可能是一種致癌物質，配製膠體及進行電泳分析時都應在抽氣櫥裡小心操作；進行電泳時所使用的緩衝液為 MOPS。 此外，含有甲醛的洋菜膠體比較滑溜，容易破裂，在移動膠體時應特別留神。由於 rRNA 佔細胞 RNA 總量之 80~85%，以 ethidium bromide 染色後，呈現於膠體上的兩個主要 RNA 色帶應該分別是 large 與 small rRNAs (真核生物為 28S 與 18S，原核生物為 23S 與 16S)；散佈於 small rRNA 附近，呈淡淡 smear 的就是 mRNAs，這是因為 mRNAs 存在量不多，而且長度不一的緣故。長度較短的 5S rRNA 及 tRNA 等則在膠體下方也以特定色帶呈現。

　
　 　 　
　

儀器用具：

　
　

65℃ 恆溫水槽

　
　

微量離心機

　
　

Mupid II 迷你電泳槽及鑄膠器

　
　

UV transilluminator

　
　

防護面罩

　
　

拍立得相機

　
　

抽氣櫥

　
　

藥品試劑：

　
　

自菌體抽取之 RNA (I-1, I-2, U-1, and U-2) 與胞外轉錄反應所製備之正意股及反意股 RNA (#1, #2, #3, and #4)。

　
　

5×formaldehyde gel running buffer (0.1 M MOPS, pH 7.0; 40 mM sodium acetate; 5 mM EDTA)

　
　

Formaldehyde gel loading buffer (0.25% bromophenol blue; 0.25% xylene cyanol; 50% glycerol; 1 mM EDTA)

　
　

Ethidium bromide (1 mg/mL in dH2O/DEPC

　
　

dH2O/DEPC

　
　

方法步驟：

　
　

◆ 注意：

　
　

a. 下列實驗主要參照 Sambrook et al. (1989) 的方法。

　
　

b. 進行下列實驗時請務必戴手套。

　
　

c. 甲醛與 formamide 都放在抽氣櫥內。

　
　 　 　
　

準備一片 1.2% 甲醛洋菜膠體：

　
　

1) 秤取 0.48 g agarose 置 100 mL 血清瓶，加入 25 mL dH2O/DEPC。

　
　

2) 以微波爐加熱溶解之後，微微晃動血清瓶使混合均勻，再移至 60℃ 恆溫水槽靜置 5 min。

　
　

3) 將裝著 agarose 溶液的血清瓶移至抽氣櫥，加入 8 mL 之 5× formaldehyde gel running buffer 及 7.2 mL 之甲醛，輕輕搖晃血清瓶以便混合均勻。

　
　

◆ 膠體總體積為 40 mL，為了避免 agarose 溶液因溫度快速下降，很快便凝固，應力求動作迅速，但應避免劇烈搖晃，以免弄出一大堆氣泡，影響膠體凝結。

　
　

4) 儘速於抽氣櫥內把混合液倒入膠體鑄模，並插入樣本梳 (teeth comb)。

　
　

◆ 膠體凝固至少需時 30 min。

　
　 　 　
　

製備電泳分析所需之 RNA 樣本：

　
　

1) 取出 8 支 1.5 mL 微量離心管，分別標示為 U-1, U-2, I-1, I-2, #1, #2, #3 及 #4，並根據下表所示依序加入各項試劑 (體積單位為 mL)。

　
　

◆ U-1, U-2, I-1 及 I-2 分別為大腸桿菌所分得之 RNA (3.1.1 節)，#1, #2, #3及 #4 分別是胞外轉錄反應所得到之 RNA (3.1.2 節)。

　
　

 

I-1, I-2

U-1, U-2

#1

#2

#3

#4

Reagents

RNA from pQG11/M15[pREP4]

RNA from pQG11/M15[pREP4]

Tx-pBlueGus/ HindIII

Tx-pBlueGus/ BamHI

Tx-pBlueGus/ HindIII

Tx-pBlueGus/ BamHI

+ IPTG   – IPTG  

e/ DNase

e/ DNase

e/o DNase

e/o DNase

dH2O/DEPC

4.5 - x

4.5 - x

2.5

2.5

2.5

2.5

RNA

x (6 mg)

x (6 mg)

2

2

2

2

5×formaldehyde gel-running buffer

2

2

2

2

2

2

Formaldehyde

3.5

3.5

3.5

3.5

3.5

3.5

Formamide

10

10

10

10

10

10

Total volume

20

20

20

20

20

20

　
　

2) 混合均勻並離心數秒後，放置於 65℃ 恆溫水槽作用 15 min。

　
　

3) 將作用完之微量離心管移置於冰浴中。

　
　

4) 離心數秒後，再將離心管放回於冰浴中，並於各離心管分別加入 2 mL 之 formaldehyde gel loading buffer 與 1 mL ethidium bromide。

　
　

　

　
　

電泳：

　
　

1) 要進行電泳時，把已凝固之洋菜膠體放進電泳槽，並加入適量 1×formadehyde gel running buffer。

　
　

2) 以 50 V 定電壓預跑 5 min。

　
　

3) 依序注入上列 8 個 RNA 樣本，以 50 V 定電壓進行電泳，待追蹤染劑移動至膠體三分之二處時，關閉電源，將膠體移至 UV transilluminator box，觀察 RNA 色帶之存在情形，並拍照存證。

　
　

u 注意： 這一片膠體往下將用來進行北方轉印實驗，請小心處置！

　
　

註解討論：

 　
　

a. 請觀察膠體上 RNA 色帶之存在情形，你知道它們各代表什麼嗎？

　
　

b. 若你必須估算特定 mRNA 分子的長度，應如何進行？

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3.3.1.3

以毛細管轉移方式進行北方轉印實驗

 　
　 　 　
　

要進行北方雜合反應前，必須先將 RNA 自洋菜膠體轉移至硝化纖維紙 (nitrocellulose membrane) 或尼龍膜 (nylon membrane) 上，這一個過程稱為 轉印 (blotting)。 一般常用的方法包括毛細管轉移法 (capillary transfer, Alwine et al., 1977)、真空轉移法 (vacuum transfer, Peferoen et al., 1982) 與電轉印法 (electroblotting, Smith et al., 1984)。 毛細管轉移法借助吸水紙吸收轉移緩衝液時所產生的牽引力量將 RNA 自洋菜膠體轉移至膜上；要轉印完全，起碼需要作用 6 h 以上。 雖然所需花費的時間比較長，以其不須要特別的儀器設備，毛細管轉移法目前仍被普遍採用。 若分析 RNA 時，採用變性聚丙烯醯胺膠體電泳，則必須以電轉印法進行 RNA 轉印。至於膜的選擇，硝基纖維素膜的優點是比較不會產生非專一性反應；不過其一旦被潤溼再烘乾之後，容易碎裂，不適用於進行多次雜合反應。 尼龍膜的優點是韌性好，與核酸結合的能力也相當強，所以正可以彌補硝基纖維素膜的缺點。 一旦將 RNA 轉移至膜上後，即可以利用紫外線照射法 (uv irradiation) 或真空乾燥法 (在真空下 80℃ 加熱 2 h) 將其固定於轉印膜上。

　
　 　 　
　

儀器用具：

　
　

塑膠盒

 　
　

玻璃板

　
　

裁紙刀

　
　

藥品試劑：

　
　

20×SSC (3 M NaCl, 300 mM sodium citrate)

　
　

尼龍膜

　
　

3MM 濾紙

　
　

吸水紙

　
　

dH2O/DEPC

　
　

方法步驟：

　
　

1) 將甲醛洋菜膠體移放在塑膠盒內，以 dH2O/DEPC 沖洗數次，以便去除甲醛。

　
　

 u 注意：在移動膠體時請特別留心，不要把膠體弄破了！ 

　
　

2) 注入 100 mL 20×SSC，靜置 5 min。

　
　

3) 根據圖 3.2 所示，依序在塑膠盒上堆疊玻璃板、濾紙 (作為鹽橋)、電泳膠、尼龍膜、三層濾紙、與吸水紙，以便以毛細管轉移方式將 RNA 轉印於尼龍膜上；塑膠盒內裝入適量 20×SSC，以便作為轉移緩衝液。

　
　

u 注意：

　
　

a. 濾紙與尼龍膜應先以 20×SSC 潤濕，再用於堆疊。

　
　

b. 在濾紙、尼龍膜、與電泳膠夾層間可能會有氣泡存在，因此在放好電泳膠、尼龍膜或濾紙後，應立即檢視，並以食指輕輕平移的方式小心趕走氣泡。

　
　

c. 此轉印步驟將持續至隔天才結束。

　

F3.2

 　 　
　 　 　
　

　
　

圖 3.2 以毛細管轉移法進行核酸轉印

  

　 　 　
　 　 　
　

註解討論：

 　
　

a. 假使所要分析的 RNA 長度大於 2.5 kb，在進行毛細管轉移前，膠體最好先以 0.05 N NaOH 處理 20 min，再以 20×SSC 浸泡 40 min，以便局部分解 RNA，提升轉印效率。

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3.3.2

北方雜合反應

 　
　 　 　
　

北方雜合反應的步驟主要包括： (1) 加入核酸探針，使與固定於尼龍膜上的特定 RNA 進行雜合反應，及 (2) 待雜合反應結束後以含鹽緩衝液與 SDS 洗掉非專一性結合於尼龍膜上之核酸探針。 進行反應時應注意下列幾個問題： (1) 實驗操作過程仍應儘可能避免 RNase 的污染；(2) 反應前應先進行雜合前置反應 (prehybridization)，以便減少核酸探針與尼龍膜之間的非專一性結合反應；(3) 如果所使用的核酸探針是以 random priming 或 PCR 等方法所製備的雙股 DNA 探針，使用前務必先加變性 (denature)；(4) 選用適當的嚴苛度 (stringency) 進行雜合反應及反應後的尼龍膜漂洗工作，以便增強雜合反應訊息，並減少雜訊，這主要可以從溫度與鹽濃度兩個方面加以考量。

 　
　 　 　
　

儀器用具：

　
　

Crosslinker (Stratalinker 1800, Stratagene)

　
　

塑膠盒

　
　

平端鑷子

　
　

封口機

　
　

42℃ 恆溫槽

　
　

60℃ 恆溫槽

　
　

藥品試劑：

　
　

6×SSC (0.9 M NaCl, 90 mM sodium citrate)

　
　

尼龍膜

　
　

4 M LiCl

　
　

Hybridization solution [formamide, 50% (v/v); 5×SSC; blocking reagent, 2% (w/v); N-lauroylsarcosine, 0.1% (w/v); SDS, 0.02% (w/v)]

　
　

3MM 濾紙

　
　

2×SSC, 0.1% SDS

　
　

0.1×SSC, 0.1% SDS

　
　

方法步驟：

　
　

u 南方雜合反應請參照 6) 之後的步驟進行，惟所使用之探針為 3.2.1 節以 random priming 進行標定者。進行下列實驗時，請務必帶手套。

　
　

1) RNA 轉印步驟結束後，移除電泳膠上之吸水紙與 3MM 濾紙。

　
　

2) 把尼龍膜連同電泳膠一齊移置於乾淨衛生紙上，並請小心維持電泳膠與尼龍膜的相對位置。

　
　

3) 以防水筆在尼龍膜上標出電泳膠樣本孔的位置，並以剪刀剪掉尼龍膜左上角，以便標記電泳膠的左右方位。

　
　

4) 小心地拉開尼龍膜，將之放置於 6×SSC (20 mL) 浸泡 5 min。

　
　

5) 以平端鑷子夾起尼龍膜，待 6×SSC 滴乾之後，把尼龍膜平放於衛生紙上，風乾至少 30 min。

　
　

u 與電泳膠接觸的那一面應朝上。

　
　

6) 以 Stratalinker 1800 進行 uv 連結反應。

　
　

7) 雜合前置反應：

　
　

a) 將 10 mL 雜合溶液注入一個塑膠袋。

　
　

b) 把已經風乾之尼龍膜移置於塑膠袋內，小心地把氣泡移除之後，以封口機密封好，再移至 42℃ 恆溫槽進行雜合前置反應 1~2 h。

　
　

8) 核酸探針變性反應：

　
　

a) 以微量吸管小心地把 PCR 產物移至新的微量離心管。

　
　

b) 將裝著核酸探針的微量離心管放入沸水中加熱 10 min。

　
　

u 與電泳膠接觸的那一面應朝上。

　
　

c) 把離心管移入冰浴裏靜置 3 min。

　
　

d) 瞬間離心後，取出已被變性的核酸探針，加到 5 mL 之雜合溶液。

　
　

9) 雜合反應：

　
　

a) 剪開塑膠袋一角，倒出塑膠袋內雜合前置反應所使用之溶液，並加入新配之含有核酸探針的雜合溶液 (8-d)。

　
　

b) 小心移除氣泡，並以封口機密封塑膠袋。

　
　

c) 如前節所述將塑膠袋移至 42℃ 恆溫槽，雜合反應將進行過夜。

　
　

10) 以含鹽緩衝液與 SDS 漂洗轉印膜 (Northern blot)：

　
　

a) 拿出塑膠袋，塑膠方盒以清水沖洗乾淨之後，裝入 80 mL [2×SSC, 0.1% SDS]。 剪開塑膠袋，把尼龍膜取出放進 [2×SSC, 0.1% SDS]，於室溫漂洗 2 次，每次 5 min。

　
　

b) 續以 100 mL [0.1×SSC, 0.1% SDS] 於 60℃ 洗 2 次，每次 15 min。

　
　 　 　
　

註解討論：

 　
　

a. 在進行步驟 6) 之 uv 連結反應之後，若無法立即進行北方雜合反應，可將尼龍膜放入塑膠袋中，並放置於 -20℃ 冰箱保存。

　
　

b.  在完成步驟 10) 之轉印膜漂洗工作後，若無法立即進行 DIG 酵素連結免疫反應與鹼性去磷酸脢呈色反應，可將轉印膜放入塑膠袋中，並放置於 4℃ 冰箱保存。

　
　

c. 最後以 [0.1×SSC, 0.1% SDS] 漂洗轉印膜時，所用的溫度可依實際需要再調整，以便去除非專一性反應，減少雜訊。

　
　

d. 一般還可以藉哪些方式控制雜合反應之嚴苛度？

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3.3.3

以酵素連結免疫反應與鹼性去磷酸脢呈色反應偵測雜合訊息

 　
　 　 　
　

進行雜合反應時所使用的探針若為放射性物質所標定者，雜合訊息可經由放射顯影術 (autoradiography) 偵測出來；若為 DIG 所標定者，則需借助 anti-DIG 抗體與鹼性去磷酸脢 (alkaline phosphatase, AP) 之 conjugate，並利用鹼性去磷酸脢的酵素活性轉現雜合反應訊息。 目前常用來進行鹼性去磷酸脢呈色反應的基質為 NBT (nitroblue tetrazolium) 與 BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, toluidinium salt)； 此外，也可以選用 CSPD 或 CDP-Star 等試劑，以增加檢測敏感度。

 　
　 　 　
　

儀器用具：

　
　

平端鑷子

　
　

旋轉搖盪器 (rotary shaker)

　
　

藥品試劑：

　
　

DIG nucleic acid detection kit (Roche), 內含：

　
　

Anti-DIG-AP conjugate

　
　

NBT/BCIP stock solution

　
　

Blocking reagent

　
　

Washing buffer (buffer 1 + 3% Tween 20, v/v)

　
　

Maleic acid buffer (0.1 M maleic acid; 0.15 M NaCl; adjust to pH 7.5 with NaOH)

　
　

Blocking solution (1% blocking reagent in maleic acid buffer)

　
　

Detection buffer (0.1 M Tris-HCl, pH 9.5; 0.1 M NaCl; 50 mM MgCl2)

　
　

TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA)

　
　

Color-substrate solution (需要使用時取 10 mL 之 detection buffer，加入 200 mL NBT/BCIP stock solution 均勻混合)

　
　

方法步驟：

　
　

u 注意：

　
　

a. 以下反應條件與程序主要是參照 DIG nucleic acid detection kit 製造廠商所提供之產品說明書。

　
　

b. 北方與南方雜合之尼龍膜可同步處理，所有反應於室溫進行。

　
　

c. 以平端鑷子將尼龍膜自一種溶液移至次一種溶液時，儘可能滴乾前者之殘留部份，以免影響後續反應。

　
　

d. 浸洗過程應以搖盪器低速搖動 (50 rpm)，以便加強作用。

　
　

1) 進行 anti-DIG/AP conjugate 與 DIG-核酸探針之免疫結合反應：

　
　

a) 以 50 mL 之 washing buffer 浸洗尼龍膜 1 min。

　
　

b) Blocking：把尼龍膜放入 20 mL blocking solution 作用 30 min，以便填充尼龍膜上之非專一性結合部位。

　
　

c) 取出 2 mL 之 anti-DIG-AP conjugate，並以 10 mL 之 blocking solution 稀釋。

　
　

d) 免疫結合反應：把 anti-DIG-AP conjugate 稀釋液連同尼龍膜一起放入塑膠袋內，仔細除去氣泡並封口之後，低速搖動作用 30 min。

　
　

e) 以 50 mL washing buffer 浸洗尼龍膜 2 次 (每次 15 min)，以便去除多餘及非專一性結合於尼龍膜的 anti-DIG-AP conjugate。

　
　

f) 將尼龍膜放置於 20 mL 之 detection buffer 漂洗 2 min。

　
　

2) 鹼性去磷酸酵素呈色反應：

　
　

a) 取出尼龍膜，放入 10 mL 現配之 color-substrate solution，並隨即把尼龍膜及作用溶液移至黑暗環境 (例如抽屜內) 作用。每幾分鐘檢視一次，待紫色條帶出現時即可終止反應。

　
　

b) 欲終止反應時，請把尼龍膜移至 50 mL TE 浸漬 5 min。

　
　

c) 拿出尼龍膜，滴乾反應液後放置於衛生紙上風乾至少 30 min，加以護貝即可保存。

　
　

註解討論：

 　
　

a. 可用來定量 RNA 的方法，除了北方雜合分析之外，還有 primer extension, S1 mapping, RNase protection 及 reverse transcriptase-PCR 等；這些方法各有其特色，可依研究內容之需要選擇使用。

　
　

b. 若應實驗需要，須以不同核酸探針對同一張轉印膜進行多次雜合反應時，應注意隨時保持轉印膜溼潤，否則可能會因轉印膜乾透，無法去除膜上之雜合訊息，而影響了後續的雜合反應。

  
　

■  結果參考『概說』Slide 7 

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Chap3

 　

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■ 最近修訂日期︰ 2002/07/28