生物技術方法  卷一

▼ 生物技術核心實驗  BCT 

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Biotechnology Core Techniques

　回目錄   

Contents ． Chapter 0 ． Chapter 1 ． Chapter 2 ． Chapter 3 ． Chapter 4 ． Appendix

Introduction to the BCT Course

BCT 課程以 Central Dogma 為主軸，從 DNA 經 RNA 到蛋白質的一連串基因表現過程，以一已知基因 gus 為對象，將其殖入表現載體 pQE31，觀察其 DNA 以及 mRNA 表現，並檢定其表現蛋白質之構造與活性。

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Central Dogma is the core of the BCT course

Central Dogma 的 DNA, RNA 與蛋白質，三者是相互關連、相互影響的，尤其蛋白質更密切影響著核酸的調節與表現；我們把這種關係以倒立三角形來表示，這個三角形也成為本課程的標誌。

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gus gene (1.8 kb) is isolated and then ligated with the expression vector pQE31 (3.4 kb)

由 pBlueGUS 中切出 1.8 kb gus 片段，同時把 3.4 kb 的載體 pQE31 切開，其上已有 cloning sites，前方並接有一段將來可表現出六個 His 的片段。分別純化後進行 ligation，可得到 5.2 kb 的 pQG11。

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Host cells are transfomed by the recombinant plasmid pQG11, mutants are selected by colony hybridization 

以此 pQG11 對宿主菌進行轉形，以 colony hybridization 挑出轉型株，並以 Southern hybridization 檢定所含 DNA 是否有 gus 片段；再以探針檢定其中的 mRNA。最後所表現出來的 GUS 蛋白質，以各種色析法純化，分析其中的酵素活性，並以抗體對 Western transfer blot 進行專一性染色以顯出 GUS 酵素。

由本圖中的各個步驟或圖形，可連結到『概說』的相關結果。

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Colony hybridization using specific Ab reveals several positive clones expressing GUS protein

經由 colony hybridization 可用專一性抗體挑出含有正在表現 gus 基因的轉形株 (右側濾紙)，不含重組質體的對照組則無 (左側 Control)。

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Positive clones are preliminarily screened by restriction digestion for correct DNA fragments

抽取轉形株的質體並以限制脢酵解，以檢定所含 gus 的 DNA 片段，可初步檢定重組與轉形是否成功。

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gus fragments in the transformants are revealed by Southern blotting analysis

由 Southern blotting 確可在轉形株 DNA 中偵測得正確長度的 gus DNA 片段，圖中的正負控制組，均得到預期的結果。

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RNA transcripts of gus gene are detected by Northern blotting analysis

這些轉形株的 gus 基因，若以 IPTG 誘導，則可由 Northern blotting 看到其 mRNA 產物；所用的探針，則是自行由 PCR 所合成得到；由 in vitro transcription 所得到的 RNA 中，也有可被探針偵測到的色帶。

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The expressed protein is isolated and purified, then analyzed by protein transfer and immunostaining

將轉形株大量培養並且破菌收集其蛋白質，經過膠體過濾法、離子交換法、親和層析法等，逐步把酵素純化，每一步驟除了追蹤 GUS 酵素活性之外，並以抗體檢定 (右圖 Western blot)。結果顯示各階段的純化效果相當良好，並顯出抗體與 GUS 間的高度專一性。

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The native mol mass of GUS is estimated as 260 kD which might contains four subunits

純化的 GUS 酵素進入膠體過濾管柱，與標準分子量的蛋白質比較，結果測得其原態分子量 260 kD，與 SDS 電泳所得單元體的分子量 70 kD 比較，得知 GUS 可能是同質四元體構造。

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Let's do it   :-)

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