生物技術方法  卷一

▼ 生物技術核心實驗  BCT 

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Biotechnology Core Techniques

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概 說  本實驗課程內容的快速導覽

ContentsChapter 0Chapter 1Chapter 2Chapter 3Chapter 4 . Appendix

Introduction to the BCT Course

 

BCT 課程以 Central Dogma 為主軸,從 DNA 經 RNA 到蛋白質的一連串基因表現過程,以一已知基因 gus 為對象,將其殖入表現載體 pQE31,觀察其 DNA 以及 mRNA 表現,並檢定其表現蛋白質之構造與活性。

  

 

Slides 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9

 

 

Slide 1

 

 

Central Dogma is the core of the BCT course

   
 

Central Dogma 的 DNA, RNA 與蛋白質,三者是相互關連、相互影響的,尤其蛋白質更密切影響著核酸的調節與表現;我們把這種關係以倒立三角形來表示,這個三角形也成為本課程的標誌。

   
 

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Slide 2

 

 

gus gene (1.8 kb) is isolated and then ligated with the expression vector pQE31 (3.4 kb)

   
 

由 pBlueGUS 中切出 1.8 kb gus 片段,同時把 3.4 kb 的載體 pQE31 切開,其上已有 cloning sites,前方並接有一段將來可表現出六個 His 的片段。分別純化後進行 ligation,可得到 5.2 kb 的 pQG11。

   
 

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Slide 3

 

 

Host cells are transfomed by the recombinant plasmid pQG11, mutants are selected by colony hybridization 

   
 

以此 pQG11 對宿主菌進行轉形,以 colony hybridization 挑出轉型株,並以 Southern hybridization 檢定所含 DNA 是否有 gus 片段;再以探針檢定其中的 mRNA。最後所表現出來的 GUS 蛋白質,以各種色析法純化,分析其中的酵素活性,並以抗體對 Western transfer blot 進行專一性染色以顯出 GUS 酵素。

   
 

由本圖中的各個步驟或圖形,可連結到『概說』的相關結果。

   
 

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Slide 4

 

 

Colony hybridization using specific Ab reveals several positive clones expressing GUS protein

   
 

經由 colony hybridization 可用專一性抗體挑出含有正在表現 gus 基因的轉形株 (右側濾紙),不含重組質體的對照組則無 (左側 Control)。

   
 

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Slide 5

 

 

Positive clones are preliminarily screened by restriction digestion for correct DNA fragments

   
 

抽取轉形株的質體並以限制脢酵解,以檢定所含 gus 的 DNA 片段,可初步檢定重組與轉形是否成功。

   
 

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Slide 6

 

 

gus fragments in the transformants are revealed by Southern blotting analysis

   
 

由 Southern blotting 確可在轉形株 DNA 中偵測得正確長度的 gus DNA 片段,圖中的正負控制組,均得到預期的結果。

   
 

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Slide 7

 

 

RNA transcripts of gus gene are detected by Northern blotting analysis

   
 

這些轉形株的 gus 基因,若以 IPTG 誘導,則可由 Northern blotting 看到其 mRNA 產物;所用的探針,則是自行由 PCR 所合成得到;由 in vitro transcription 所得到的 RNA 中,也有可被探針偵測到的色帶。

   
 

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Slide 8

 

 

The expressed protein is isolated and purified, then analyzed by protein transfer and immunostaining

   
 

將轉形株大量培養並且破菌收集其蛋白質,經過膠體過濾法、離子交換法、親和層析法等,逐步把酵素純化,每一步驟除了追蹤 GUS 酵素活性之外,並以抗體檢定 (右圖 Western blot)。結果顯示各階段的純化效果相當良好,並顯出抗體與 GUS 間的高度專一性。

   
 

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Slide 9

 

 

The native mol mass of GUS is estimated as 260 kD which might contains four subunits

   
 

純化的 GUS 酵素進入膠體過濾管柱,與標準分子量的蛋白質比較,結果測得其原態分子量 260 kD,與 SDS 電泳所得單元體的分子量 70 kD 比較,得知 GUS 可能是同質四元體構造。

   
 

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開始動手做實驗吧 :-)

 
 

Let's do it   :-)

 
 

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最近修訂日期︰ 2004/03/23