生物技術方法  卷一

▼ 生物技術核心實驗  BCT 

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Contents ． Chapter 0 ． Chapter 1 ． Chapter 2 ． Chapter 3 ． Chapter 4 ． Appendix

本章目錄

台灣大學農化系     王 愛 玉   

本 章 目 錄

2.1   質體 DNA 的小量分離

圖 2.1

2.2   質體 DNA 之檢定分析  

2.3   DNA 片段的分離與純化

2.4   DNA 之定量

2.5   接合反應

2.6   質體對大腸桿菌的轉形

2.7   重組質體的檢定

 參考文獻

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本章實驗主要是藉由基本的 DNA 剪接方法，建構能夠在大腸桿菌中大量表現 GUS 之表現質體 (圖 2.1)。 將已經次選殖於質體 pBluescript SK (-) 之 gusA (原稱 uidA) 基因片段，以適當的限制脢作用後，選殖至表現載體 pQE31 上，以利用其上之 T5 promoter 進行表現。 gusA 基因原本即存在於大部分的大腸桿菌中，屬於誘導性的基因 (inducible gene)，當培養基中存在 GUS 能夠作用的基質 (glucuronides) 時，即可誘導大腸桿菌中的 gus operon 進行表現 GUS, glucuronide-specific permease, GusC 等蛋白質。 由於 GUS 相當穩定，活性檢測也十分簡易，因此 gusA 基因常被應用為報導基因 (reporter gene)，探討目標基因的表現及其調控機制。 本課程則是利用 GUS 相當穩定的優點，作為初學者練習質體建構、基因表現產物分析及純化的材料。 基因表現產物分析及純化等實驗將於第三、四章中說明，表現質體的建構則分別在以下各階段進行：

2.1 質體 DNA 的小量分離：

自 E. coli 菌株中分離純化 pBlueGus (pBluescript 上帶有 gusA DNA 片段) 以及 pQE31。

2.2 質體 DNA 之檢定分析：

純化的兩種質體以限制脢進行切割後進行電泳檢定。

2.3 DNA 片段的分離：

將經過 BamHI 與 HindIII 切割的 pBlueGus 及 pQE31，進行電泳分離，並將 gusA DNA 片段及 pQE31 自膠體中溶離出。

2.4 DNA 之定量：

將溶離出之 gus DNA 及 pQE31 進行定量分析。

2.5 接合反應 (ligation)：

將 gusA DNA 片段及經 BamHI 與 HindIII 切割之 pQE31 以適當比例混合並加入 T4 DNA ligase 進行接合反應。

2.6 質體對大腸桿菌的轉形 (transformation)：

將接合反應液對 E. coli JM109 進行轉形，以得到帶有質體之菌株。

2.7 重組質體的檢定：

以 colony hybridization, histochemical detection, 質體檢定, Southern 轉印等方法，挑選可以表現 GUS 的轉形株。

F2.1

圖 2.1 表現質體 pQG11 之建構流程 (放大圖)

■  參考『概說』Slide 3 

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2.1

質體 DNA 之小量分離法

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這個實驗是以 alkaline lysis 的方法進行，其原理是將細菌以 NaOH 及 SDS 分解，並使蛋白質及 DNA 變性，繼之以酸中和。在此情況下，小分子質體 DNA 在中和後可恢復原態，但大部份的細菌染色體 DNA 則無法完全復原而與 SDS^-K⁺ 所形成之複合物一起沉澱下，可以離心去除之，上清液中所含的質体則可以酒精或異丙醇將其沉澱下來。

儀器用具：

微量離心機  

冰浴  

真空乾燥濃縮機 (SpeedVac)  

藥品試劑：

MP I (25 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM EDTA, pH 8.0; 50 mM glucose)

MP II 新鮮配製 (0.2 N NaOH; 1% SDS; 使用前以 10 N NaOH, 10% SDS 稀釋混合配製)

MP III (3 M 醋酸鉀溶液，pH 5.2，置冰浴中)

RNase A (1 mg/mL, 已經過 100℃加熱 30 min 以去除 DNase 活性)

純酒精及 70% 酒精

TE-8.0 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA, pH 8.0)

方法步驟：

1) pBlueGus/JM109, pQE31/JM109 接種於含 100 mg/mL ampicillin 之 LB 培養基，於 37℃ 震盪培養過夜。

2) 取 1.5 mL 菌液，加於微量離心管中，以 6,000 rpm 離心 2 min 後，倒去上清，以微量吸管頭儘可能吸去殘留液體。

◆ 兩種質體均請製備三管！

3) 沉澱加入 0.1 mL MP I，劇烈震盪，將沉澱完全打散。

4) 慢慢加入 0.2 mL MP II，蓋上管蓋後將管子反覆上下搖動，注意不可震盪！ 此時溶液應漸澄清且黏度增加；將離心管置冰浴中。 

5) 加入 0.15 mL MP III，混合均勻，亦不可劇烈震盪，置冰浴中 5 min。

6) 以 12,000 rpm 離心 5 min。

7) 小心吸出上清至另一離心管，加入 2 倍體積之純酒精 (或 0.6 倍體積之 isopropanol)，混合均勻，置室溫 2 min。

8) 以 12,000 rpm 離心 10 min。倒去上清液，沉澱以 70% 酒精洗二次，每次各離心 1 min。

◆ 小心不要把沈澱也倒掉了！

9) 沉澱以 SpeedVac 乾燥後，以 30 mL TE-8.0 溶解 (可以微量吸管頭反覆緩慢吸放溶液，以助溶解)。

◆ 若無 SpeedVac，可將沈澱置乾燥器 (desiccator) 中抽氣乾燥；或將管中殘留之酒精吸乾，在室溫中乾燥或置 laminar flow hood 內吹乾。

10) 加入 1 mL RNase A。

11) 進行限制脢切割、電泳分析等實驗。

註解討論：

a. 質體抽取的量與品質除了與操作技術相關外，仍與許多因素有關，例如：

1.  質體的 copy number。

2.  宿主菌株的基因型 (genotype)。

3.  細菌的生長時期。

4.  培養基種類。有報告指出，利用 Terrific broth 或 2XYT 等培養基可得較多量之質體。

b. 上面步驟 2) 中的菌液體積可加倍至 3 mL。 將 1.5 mL 的菌液離心後，倒去上清，再加入 1.5 mL 菌液，同法離心後，再接著進行質體抽取。

c. 此法抽取質體，在過程中並無法將小分子 RNA 與質體分離，太多的 RNA 常會影響電泳結果的判讀或干擾下游的實驗，因此步驟 10) 中，加入 RNase A 的目的即在去除 RNA。

d. RNase 的存在會影響下游的實驗時 (例如 in vitro transcription)，則可於 RNase 作用後，將 DNA 溶液如下處理：

1. 加入等體積的 phenol/chloroform/isoamyl alcohol (PCI, 三者以 25:24:1 混合)，震盪混合均勻後，以 12,000 rpm 離心 5 min。

2. 將上層溶液吸至乾淨離心管，加入等體積 chloroform/isoamyl alcohol (24:1, CI)，震盪混合均勻後，以 12,000 rpm 離心 2 min。

3. 吸出上層溶液至乾淨離心管，加入 2 倍體積的酒精及 1/10 體積的 3 M sodium acetate 溶液 (pH 5.2, 以下簡稱 3 M NaOAc-5.2)，混合均勻，置 -70℃ 30 min 或於 -20℃ 靜置 3 h 以上。

4. 12,000 rpm 離心 15 min (4℃)。 沉澱物以 70% 酒精洗二次，每次各以同轉速離心 2 min。

5. 沉澱乾燥後，以 TE-8.0 溶解。

2.2

質體 DNA 之限制脢分析

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本實驗是將上一節分離得到的質體，以不同限制脢作用，經電泳分離 DNA 片段後，比較各 DNA 片段之泳動率與分子量，檢定質體之正確性，並進行大量 DNA 之限制脢切割，以進行重組質體的建構。

2.2.1

質體 DNA 之檢定

儀器用具：

37℃及 65℃ 水浴或恆溫槽

Mupid II 迷你電泳槽及鑄膠器

UV transilluminator

防護面罩

拍立得相機

藥品試劑：

2.1 節 中以小量分離法得到的二種質體 pBlueGus 及 pQE31

pBluescript SK(-) 由助教提供

限制脢：BamHI, HindIII (10 U/mL, BRL)

10×Reaction buffer 2 (0.5 M Tris-HCl, pH 8.0; 0.1 M MgCl₂; 0.5 M NaCl)

10×Reaction buffer 3 (0.5 M Tris-HCl, pH 8.0; 0.1 M MgCl₂; 1.0 M NaCl)

1 M NaCl

無菌水

10× 追蹤染劑 (0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol, 0.1 M EDTA, 50% glycerol)

洋菜膠 (agarose, low EEO)

1×TAE 電泳緩衝液

Ethidium bromide (EtBr) stock solution (500 mg/mL)

DNA 標準分子量 (lMr 及 LadMr)

Polarid 667 底片

方法步驟：

1) 取 9 支微量離心管，依下表所列 (以 mL 為單位) 依序加於管壁上：

◆ 注意！每次吸取限制脢時，請換新的微量吸管頭以免造成污染。

    總體積為 20 mL，短暫離心後，以微量吸管頭輕輕混合。

2) #1, #4, #7 暫置冰浴，其餘各管置於 37℃ 反應 1 h 後，每管再分別依下表所列 (以 mL 為單位) 依序加於管壁上：

    總體積為 30 mL，短暫離心後，以微量吸管頭輕輕混合。 #3, #6, #9 置於 37℃ 繼續反應 1 h，其餘各管置於冰浴中。

◆ 在反應期間，每組請利用空檔製備 12-well 及 6-well 的 1% agarose gels 各二片；其中一片 12-well gel 必須做厚一點。

◆ 注意！Ethidium bromide 為致突變劑，操作時請務必戴手套，並禁止戴著手套的手到處亂摸！

3) 每管分別加入 3 mL 10×追蹤染劑，置 65℃ 水浴 5 min 後，移至冰浴降溫後即可進行電泳分析。

◆ 未使用的電泳膠片請以保鮮膜封好，裝入封口袋中，置 4℃ 冰箱，留至明天使用。

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2.2.2

大量 DNA 之限制脢作用

若電泳分析結果顯示你所純化的質體 DNA 質量均佳 (請將結果拿給教師或助教看)，則可進行大量 DNA 之 BamHI 及 HindIII 切割。

藥品試劑：

2.1 節 中以小量分離法得到的二種質體

限制脢：BamHI, HindIII (20 U/mL, BioLabs)

10×NE Buffer BamHI (0.1 M Tris-HCl, pH 7.9; 0.1 M MgCl₂; 1.5 M NaCl; 10 mM dithiothreitol)

100×BSA (10 mg/mL bovine serum albumin)

方法步驟：

1) 取兩支微量離心管，分別標上 pQE31 及 pBlueGus，如下所列依序加於管中：

總體積為 200 mL，短暫離心後，以微量吸管頭輕輕混合，置 37℃ 反應過夜。

◆ 剩餘的質體請保存在 4℃，不要丟掉，以後的實驗還會用到！

2) pBlueGus 取出 5 mL，pQE31 取出 10 mL，加入追蹤染劑，進行電泳分析，檢視切割是否完全。

3) 若切割完全，請由 2.3 節中任選一法進行 DNA 片段純化。

註解討論：

a. 進行大量 DNA 的限制脢切割，可選用高濃度的限制脢，以減少反應的體積。若沒有高濃度的限制脢，則需將反應總體積增加，以避免加入多量的酵素時，過多的 glycerol 影響酵素的作用。

b. 這部份的實驗改用 BioLabs 的酵素，所以反應亦依廠商所建議最適條件進行。

c. 切割完全的 pQE31，亦可不進行 DNA 片段純化，可依 2.1 節註解討論 d 之步驟 1~5 進行純化，以去除限制脢及鹽類。 乾燥後之 DNA 沈澱以 25 mL TE-8.0 溶解。但因切下之 polylinker 小片段未去除，在進行接合反應時，可能會再與載體接合，降低得到重組質體的機率。

2.3

DNA 片段的分離與純化

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2.3.1

DEAE membrane 吸附法

利用離子交換的原理，在低鹽情況下使 DNA 吸附在帶正電荷的濾膜上，再利用含有高濃度鹽類的緩衝液將 DNA 自膜上溶離下來。

儀器用具：

Mupid II 迷你電泳槽

UV transilluminator

防護面罩

扁平藥匙

乾淨刀片

65℃ 水浴或恆溫槽

藥品試劑：

經 BamHI 及 HindIII 作用之 pBlueGus 及 pQE31

含 EtBr 之 1.0 % 12-well agarose gel

1×NET (20 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 0.1 mM EDTA, pH 8.0)

High salt NET (20 mM Tris-HCl; 1.0 M NaCl; 0.1 mM EDTA, pH 8.0)

0.5 M NaOH

10 mM EDTA

TE-8.0

n-Butanol

Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (PCI, 25:24:1)

Chloroform/isoamyl alcohol (CI, 24:1)

10 M ammonium acetate (NH₄OAc)

DEAE membrane (Schleicher & Schuell, NA 45)

過濾膜 (Millipore VSWP01300, 0.025 mm, 13 mm)

方法步驟：

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1) 經 BamHI 及 HindIII 作用之 pBlueGus 及 pQE31，置 65℃ 水浴 10 min，移至冰浴降溫後，以含 EtBr 之 1.0% agarose gel 進行電泳。

2) NA 45 以滅過菌的剪刀剪成適當大小，置於培養皿中，以 10 mM EDTA-8.0 浸泡處理 10 min，繼以 0.5 M NaOH 處理 5 min。 以無菌水快速清洗五、六次後，浸泡於無菌水中，置於 4℃ 可保存數週。

◆ 此部份助教已準備好。

3) 電泳後之膠片以 EtBr 染色後，以長波長 UV 燈觀察 DNA 片段所在位置，並在 DNA 色帶前後切一刀，以扁平藥匙輔助將 NA 45 插入 DNA 前後的切縫中；再以 UV 燈觀察 NA 45 插入的位置是否恰當。

4) 將膠片置回電泳槽中，以 100 V 進行電泳約 10 min (時間隨 NA 45 位置與 DNA 距離而定)；以 UV 燈觀察 DNA 是否完全吸附到 NA 45。

5) 將 NA 45 取出，浸於 NET 中漂洗以去除附著於 NA 45 的膠體 (可用微量吸管頭末端將膠體輕輕去除)，再移置於微量離心管中 (每 2-3 片置於一管中)，吸去多餘的液體。

◆ 注意！不可讓 NA 45 乾掉，否則 DNA 無法被溶離下來。

6) 加入 0.3 mL high salt NET，於 68℃ 加熱 40 min，其間不時震盪。

◆ NA 45 膜片避免重疊在一起，並且必須完全浸泡於溶液中。

7) 將溶液吸出，原管中之 NA 45 再加入 300 mL high salt NET，於 68℃ 加熱 10 min。

◆ 以下的步驟常容易出錯，請務必分清楚離心後該取上層或下層溶液，請先保留各部份的溶液，確定無誤後再丟棄。

8) 將兩次溶離液合併，加入等體積之 n-butanol，震盪混合，以 12,000 rpm 離心 5 min。離心後應可分為兩層，DNA 溶液在下層。仔細觀察管底是否有沈澱，吸取下層溶液至另一離心管，避免吸到沈澱。 這時 DNA 溶液體積應該減少，可以把兩管或三管的溶液合併成一管。

◆ 溶離後的 NA 45 請以 UV 照射檢查是否仍有 DNA 殘留。

9) 加入等體積之 PCI，震盪混合，以 12,000 rpm 離心 5 min。

10) 吸取上層水溶液至另一離心管，原管中加入等體積的 TE-8.0，混合均勻，以 12,000 rpm 離心 2 min。將上層液吸出。

11) 合併上層液，加入等體積 CI，震盪混合，以 12,000 rpm 離心 2 min。

12) 將上層溶液吸出，加入 0.2 倍體積之 10 M NH₄OAc，2.5 倍體積的絕對酒精，置 -20℃ 沉澱過夜  (本次實驗請置於 -70℃ 30 min)。

13) 以 12,000 rpm 離心 20 min (4℃)，沉澱以 -20℃ 預冷之 70% 酒精洗兩次，以同轉速離心 2 min。

◆ 倒掉上清時請小心，不要讓沈澱流失！ 沈澱通常很少，且因純度高幾近透明，不易察看；上清最好吸到另一微量試管中暫時保留。

14) 沉澱乾燥後溶於 20 mL TE-8.0 中。

15) 取一個直徑 3 cm 之培養皿，加入 5 mL TE-8.0。以平端鑷子小心夾取 VSWP 濾膜，將濾膜之光亮面朝上置於液面上。 將溶離之 DNA 溶液加在膜上，靜置透析至少 30 min 以去除殘留之鹽。

註解討論：

a. 當 DNA 分子量較大時 (> 5 kb)，溶離效率會降低。

b. 步驟 6) 中的溶離時間隨 DNA 大小而作調整。 DNA 分子量較小時，溶離時間可縮短。

c. 步驟 11) 中儘可能避免在 -70℃ 進行沈澱，溶液中的鹽會隨之沈澱，因此必須以 drop dialysis (步驟 15) 將大量的鹽去除。

d. 以 n-butanol 萃取 DNA 溶液，主要在去除嵌入 DNA 中的 EtBr，並可濃縮溶液的體積。當溶液體積已經很少時，則需用事先經過水飽和之 n-butanol。

e. 加入 PCI 及 CI 的用意為何？ PCI 溶液為什麼是黃色的？

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2.3.2

Silica gel 吸附法

藥品試劑：

經 BamHI 及 HindIII 作用之 pBlueGus 及 pQE31

含 EtBr 之 1.0% 12-well agarose gel

Concert Rapid Gel Extraction System (Gibco BRL)，內含：

Spin column (裝填有 silica gel)

Gel Solubilization Buffer (L1)

Washing Buffer (L2, 含 NaCl, EDTA, Tris-HCl, ethanol)

TE-8.0

方法步驟：

1) 經 BamHI 及 HindIII 作用之 pBlueGus 及 pQE31，置於 65℃ 水浴 10 min，移至冰浴降溫後，以含 EtBr 之 1.0% agarose gel 進行電泳 (兩種樣品各用六個 wells，每個 well 注入 30 mL 樣品)。

2) 電泳後以長波長 UV 燈觀察 DNA 片段所在位置，並以乾淨刀片將 GUS 及 pQE31 片段切下，請儘可能去除周圍多餘的膠體。

3) 取數個微量離心管，分別稱重後將膠體置於管中再稱重以估計膠體重量。 注意！每管膠體不可超過 400 mg。 接著於離心管中加入 Gel Solubilization Buffer (L1) 以溶解膠體，加入比例為： 約 10 mg 膠體加入 30 mL L1。

4) 置 50℃ 水浴中作用 15 min，每隔 3 min 以手指輕彈管壁促進膠體溶解。如果膠體尚未溶解完全，則延長作用時間 5-10 min 務使膠體完全溶解。

5) 將 spin column 置於 2 mL 離心管中，加入已完全溶解之膠體溶液，於 12,000 rpm 轉速下離心 1 min。 此時 DNA 片段已與 column 上之 membrane 結合，離心完成後，去除離心管之流出物。

6) 將 spin column 置回離心管中，加入 500 mL Gel Solubilization Buffer (L1)，靜置室溫下 1 min，再於 12,000 rpm 轉速下離心 1 min，並去除離心管之流出物。。

7) 將 spin column 置回離心管中，加入 700 mL Washing Buffer (L2)，靜置室溫 5 min 後，於 12,000 rpm 轉速下離心 1 min，並去除離心管之流出物。

8) 將 spin column 置回離心管中，再於 12,000 rpm 轉速下離心 1 min，以完全去除離心管中殘留的 Washing Buffer (注意：一定要將 washing buffer 完全去除，以免干擾後續酵素反應)。

9) 將 spin column 置於另一乾淨的離心管中，加入 30 mL 已經 65℃ 預熱過的 TE-8.0 Buffer 於 silica membrane 上，靜置 5 min，以將附於膜上之 DNA 完全溶離出。

10) 於 12,000 rpm 轉速下離心 2 min。收集含有 DNA 的溶離液，並進行 DNA 的定量及接合反應。

註解討論：

a. 以 Silica gel 法來進行 DNA 片段的純化，目前有許多商品化的套組 (kit) 可利用，可依需求選擇適當的套組。

b. 一般而言，Silica gel 吸附法對較小的 DNA 片段 (< 0.5 Kb) 回收率並不佳，在使用前須詳閱套組操作說明所列適用片段大小。

2.4

DNA 之定量

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藥品試劑：

純化之 gusA 片段及 pQE31 BamHI/HindIII 片段

1% 6-well agarose gel

DNA 標準分子量 (lMr, 0.5 mg/mL)

方法步驟：

1) 取 4 支微量離心管，依下表加入 DNA, TE-8.0 及追蹤染劑 (mL)：

2) 短暫離心混合後，將各管樣品置 65℃ 水浴 5-10 min 後，移至冰浴降溫後進行電泳分析。

3) 將膠體置於 UV transilluminator 上觀察各色帶的亮度，與已知量之 lMr 比較，找出分別與 #3, #4 亮度相當之片段。

◆ 由 圖 1.5 可知 lMr 每一 DNA 片段的量。

4) 估計 #3, #4 之 DNA 量及計算每 mL 所含之莫耳數。

▼ 接續 2.5 節 ▼   

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