2.5

接合反應

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純化的 gusA 片段與經 BamHI/HindIII 作用的 pQE31 片段混合後，末端序列互補的部份會進行黏合，但仍須藉由 DNA ligase 催化 phosphodiester bond 的形成，將缺口接合起來。

儀器用具：

12℃ 恆溫槽

藥品試劑：

純化之 gusA 片段及 pQE31 BamHI/HindIII 片段

T4 DNA ligase (1 U/mL, BRL)

5×T4 DNA ligase buffer (0.25 M Tris-HCl, pH 7.6; 50 mM MgCl₂; 5 mM ATP; 5 mM DTT; 25% PEG-8000)

方法步驟：

1) 兩種 DNA 片段於 65℃ 水浴加熱 10 min 後，置冰浴中。

2) 取 5 支微量離心管置冰浴中，依下表所列 (單位 mL) 依序加入各成份：

  * Vector 與 Insert 之比例為 莫耳數比，DNA 總量為 100 ng。

3) #1~#4 置於 12℃ 反應過夜，#5 則不加 ligase，直接置於 4℃ 冰箱。

4) #1~#4 反應過夜後，以 70℃ 加熱 10 min，置冰浴中。

註解討論：

a. 步驟 1) 及 4) 加熱及冰浴的作用分別為何？

b. 以不同莫耳比例進行接合反應的用意為何？

c. 本實驗是將載體以兩種不同的限制脢進行作用，因此進行接合反應時，載體自我接合的機率較小。若是將 DNA 片段選殖於載體上單一的限制脢位址時，可將限制脢作用過的質體以 alkaline phosphatase 作用，去除 5' 端的磷酸根，以避免進行接合反應時，質體末端自行接合。

2.6

質體之轉形

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細菌質體需藉由 轉形 (transformation) 的技術，將之引介入細菌體中，藉由寄主細菌的系統來達成複製或進行基因表現的目的。寄主細菌的選擇，須視質體的種類及實驗的目的而定。本實驗的目的在建構一個表現質體，使之能在大腸桿菌中大量表現 GUS。 然而，利用大腸桿菌進行外源基因的表現時，常遇到的問題是，外源基因的產物會對寄主細菌造成傷害；此外，持續不斷的表現外源基因也會使寄主細菌生長減慢或無法生長。因此，必須有適當的調控機制來控制外源基因的表現。 我們所用的載體 pQE31 在 T5 promoter 與外源基因插入位址之間，具有一段 lac operon 中的 lacO 序列，可利用 lac repressor 結合其上來調控 T5 promoter 的啟動，只有在 inducer (例如 IPTG) 加入時，才會啟動轉錄的進行，而 lac repressor 的來源則必須靠寄主提供。由於此質體為 multiple copies，一般大腸桿菌菌株中 lac repressor 的含量不足以有效地進行調控，縱使未加入 inducer，也會有外源蛋白質的表現，萬一外源蛋白質對寄主造成毒害，使之無法生長，我們可能連表現質體都無法選殖到，更無法達成我們的實驗目的了。 我們所選用的寄主菌株 JM109 所具有的 lacI^q，能夠過量表現  (overproduce) lac repressor，因此可較有效地控制 T5 promoter 的啟動。 然而，若是連 JM109 這一類帶有 lacI^q 之菌株都發生問題時，就必須再更換其它的寄主菌株；例如 M15[pREP4]，此菌株除了染色體上的 lacI 基因外，還帶有能持續表現 lac repressor 的質體，應可解決 lac repressor 量不足的問題。

2.6.1

氯化鈣法

利用冰冷的 CaCl₂ 製備 competent cells，以傳統方法進行質體的轉形。

儀器用具：

37℃ 培養箱

42℃ 水浴

冰浴

藥品試劑：

0.1 M CaCl₂ 置冰浴中

2 M glucose：

取 18 g glucose 溶於水中，並調體積至 50 mL，無菌過濾，分裝後置 -20℃ 貯存。

2 M Mg²⁺：

取 20.3 g MgCl₂ · 6H₂O 及 24.65 g MgSO₄ · 7H₂O 溶於水中，並調體積至 100 mL，無菌過濾之，分裝小瓶置 -20℃ 貯存。亦可以 MgCl₂ 完全取代 MgSO₄。

SOB 液體培養基：

2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl，高壓滅菌，使用前加入 2 M Mg²⁺，使最終濃度為 10 mM。

SOB 固體培養基：

2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.5% Bacto agar，高壓滅菌，倒 plate 前加入 2 M Mg²⁺ 使最終濃度為 10 mM。

SOC/Amp 固體培養基：

SOB 中另外添加 20 mM glucose 及 100 mg/mL ampicillin。

SOC 液體培養基： SOB 中加入 20 mM glucose (使用前加入)。

大腸桿菌菌株： JM109

2.5 節 之 #1~#5 接合反應液

方法步驟：

1) 進行轉形實驗前 16~20 h，自 -70℃ 取出貯存的菌種，以劃單一菌落方式將菌株 JM109 接種在 SOB 固體培養基上，在 37℃ 培養。

2) 取 40 mL SOB 培養基裝入 125 mL 已滅過菌之三角瓶 (請記得加入 Mg²⁺)。 另取 1 mL SOB 加於微量離心管中。 由 SOB 固體培養基上選 4~6 個約 2~3 mm 大小的單一菌落接入 1 mL SOB 中，震盪將菌體打散後，加入 40 mL SOB 中，於 37℃ 震盪培養約 2~3 h，直至細胞數約為 4~7×10⁷/mL。 可於接菌 2 h 後每隔 20~30 min 測 A₆₀₀ 估計。

◆ 請由前面實驗 (1.3.3 節) 所作的生長曲線決定之。

3) 收集菌液於離心管中，置冰浴中 10~15 min。

4) 以 750~1,000 g 離心 12~15 min (4℃)。

5) 倒去上清，並盡量將液體倒乾，或以微量吸管頭吸乾淨。

6) 沉澱加入 1/3 菌液體積冰冷的 0.1 M CaCl₂，稍加震盪，混合均勻，置冰浴中 10~15 min。

7) 同上 4), 5) 之操作。再重複 6), 4), 5) 之操作，以使反應更完全，增加成功率。

8) 加入 1/25 菌液體積冰冷的 0.1 M CaCl₂，稍加震盪使混合均勻。

◆ Competent cells 製備完成！

9) DNA 樣品 (<10 mL) 先裝於微量離心管中，置冰浴中預冷，另取一微量離心管，標上 #0，不加入任何 DNA (作為 negative control)，亦置冰浴中預冷。每個樣品加入 200 mL 菌液，震盪混合後，置冰浴中 20~40 min。

10) 42℃ 加熱 90 s (溫度及時間均需很準確)。

◆ Heat shock！

11) 置冰浴中 2 min。

12) 加入 800 mL SOC，混合後，於 37℃ 震盪培養 30~60 min。

13) 將各管轉形液上下搖動混合均勻。 #5 取 20 mL 至另一離心管中，加入 180 mL SOC (稀釋 10 倍)，混合均勻後，塗佈於 SOC/Amp plate。 #0, #1~#4 各取 200 mL 塗抹在 SOC/Amp plate。 剩餘菌液以 6,000 rpm 離心 1 min，倒去上清，沉澱加入 200 mL SOC，均勻打散後塗抹在另一個 SOC/Amp plate 上。

14) 待培養基表面之菌液完全被吸收後，倒置培養皿於 37℃ 培養 16~20 h 後，觀察各個 plate 上菌落的形狀並計算菌落數。

註解討論：

a. 每 10 mL 培養液可供 4 個轉形反應。

b. 轉形菌液若未全部塗佈於培養基，剩餘菌液以 6,000 rpm 離心 1 min，倒去上清，沉澱加入 1 mL SOC，均勻打散，再以同轉速離心 1 min，倒去上清，再加入 1 mL SOC，打散沉澱，置 4℃ 貯存。長久貯存，則需加入甘油至濃度為 20%，以液態氮快速凍結後置 -70℃ 貯存。

c. 0.1 M CaCl₂ 亦可以 Hanahan (1985) 所提之轉形緩衝液 (100 mM KCl, 45 mM MnCl₂, 10 mM CaCl₂, 3 mM HACoCl₃, 10 mM K-MES, pH 6.3) 取代，對部分菌株可得較高之轉形效率 (transformation frequency)，請參考文獻所列步驟。 (HACoCl₃: hexamine cobalt trichloride)

▲

2.6.2

電穿孔法 (electroporation)

儀器用具：

37℃ 培養箱及冰浴

Electroporation cuvette (electrode gap, 0.1 cm)

Electroporator (IBI geneZapper 或其它廠牌)

藥品試劑：

無菌水 (置冰浴中)

10% glycerol (置冰浴中)

SOB 液體培養基

SOB 固體培養基

SOC 液體培養基

SOC/Amp 固體培養基

大腸桿菌 JM109

Ligation mixtures

方法步驟：

1) 進行轉形實驗的前 16~20 h，將菌種 JM109 接種在 SOB 固體培養基上，並在 37℃ 培養箱中培養。

2) 取 80 mL SOB 培養基裝入 250 mL 滅過菌之三角瓶。 另取 1 mL SOB 加於微量離心管中。由 SOB 固體培養基上選 8 個約 2~3 mm 大小的單一菌落接入 1 mL SOB 中，震盪將菌體打散後，加入 80 mL SOB 中，於 37℃ 震盪培養約 2~3 h，直至細胞數約為 4~7×10⁷/mL。

3) 收集菌液於離心管中，置冰浴中 10 min。

4) 以 750~1,000 g 離心 12~15 min (4℃)。

5) 倒去上清，並盡量將液體倒乾，或以微量吸管頭吸乾淨。

6) 沉澱加入 80 mL 冰冷之無菌水，稍加震盪，混合均勻後以 750~1,000 g 離心 12~15 min (4℃)。

7) 倒去上清，菌體再依序以 40 mL 及 1.6 mL 無菌水同法處理。

8) 菌體以 0.16 mL 冰冷之 10% glycerol 懸濁。

9) 菌液每 80 mL 分裝一管，可直接用於 electroporation，或以液態氮或乾冰快速凍結後置 -70℃ 貯存。

Electroporation：

1) 進行 electroporation 的 DNA 樣品溶液中離子強度不可過高，DNA 需先經過透析或以酒精沉澱處理。透析可如 2.3.1 節 步驟 15) 進行。

2) Cuvettes 自包裝中取出後，置冰浴中至少 5 min。

3) 將菌液置於冰浴中，加入 DNA 樣品，混合後，小心將溶液吸至 cuvette 之凹槽中，將 cuvette 置冰浴中。

4) 進行 electroporation 時，將 cuvette 由冰浴中取出，將四週水份擦乾，置於反應槽中，並接上電極線。

5) 以 2.5 kV, 21 mF 進行 electroporation。

◆ 注意！高電壓！

6) 取出 cuvette，立即加入 1 mL SOC。

7) 吸出菌液移至微量離心管中，於 37℃ 震盪培養 45 min。

8) 取 200 mL 菌液塗佈於 SOC/Amp plate。置 37℃ 培養 16~20 h。

9) 觀察 plate 上菌落的形狀並計算菌落數。

2.7

重組質體的檢定

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檢定載體上是否接上外來的 DNA 片段，常因質體不同而有不同方法，一般常利用外來 DNA 片段的插入導致載體某表現形的喪失 (insertional inactivation) 來作為篩選的依據；或者可利用插入的 DNA上帶有宿主所缺少的表現型進行篩選。若載體與插入 DNA 皆無適當的篩選依據，則可將菌落中的質體抽出後，以限制脢作用後進行電泳分析。而我們實驗中所用的質體 pQE31，並沒有簡易快速篩選重組質體的方法可用，因此需要利用 GUS 之抗體進行 colony hybridization，尋找可表現出 GUS 之轉形株 (2.7.1)；或在培養基中加入 GUS 之基質，轉形株若可表現出 GUS，則可將基質分解使菌落呈現藍色 (2.7.2)；或以質體快速抽取法，篩選帶有正確分子量質體的轉形株 (2.7.3)。三種方法都請同學練習，得到的正反應株均必須再抽取質體進行限制脢分析，以進一步確認質體之正確性  (2.7.4)。

2.7.1

Colony hybridization

前一天進行轉形得到的各轉形株，以 nitrocellulose 濾膜覆蓋菌落後再掀起，可使菌落附著在濾膜上。將濾膜移置含有 IPTG 的培養基上，利用 IPTG 進入菌體後，可與 lac repressor 結合，使 lac repressor 不會結合在 pQE31 質體上的 lacO 序列，則其上游之 T5 promoter 可啟動進行其下游基因的轉錄，合成出之 mRNA 可再經轉譯而表現出蛋白質。若轉形株帶有的質體為接合了 gus 基因的重組質體，則應可在 IPTG 的誘導表現條件下表現出 GUS 蛋白質。 將經誘導表現後的菌落溶菌後，菌體所釋出的蛋白質可被固定在 nitrocellulose 紙上，則可以 GUS 之抗體進行免疫偵測，尋找可以表現 GUS 的菌落。

儀器用具：

平端鑷子

玻璃乾燥器 (desiccator)，裡面放置一杯 chloroform，蓋緊蓋子，使其內充滿 chloroform 蒸氣。

藥品試劑：

Nitrocellulose 濾膜

LB/Amp/IPTG plate (LB plate 添加 100 mg/mL ampicillin, 0.2 M IPTG)

Chloroform

Lysis buffer:

100 mM Tris-HCl, pH 7.8; 150 mM NaCl; 5 mM MgCl₂; 1.5% bovine serum albumin (或 0.25% gelatin); 1 mg/mL DNase I; 40 mg/mL lysozyme 取 18 g glucose 溶於水中，並調體積至 50 mL，無菌過濾，分裝後置 -20℃ 貯存。

明膠 NET 液：

50 mM Tris-HCl, 0.25% gelatin; 0.15 M NaCl; 5 mM EDTA; 0.05% Tween-20, pH 8.0

PBS：10 mM Na phosphate, pH 7.0; 0.15 M NaCl

PBST：10 mM Na phosphate, pH 7.0; 0.15 M NaCl; 0.05% Tween 20

一次抗體：Anti-GUS antibody

二次抗體：Goat anti-mouse IgG, HRP-conjugated

DAB 呈色液：

Diaminobenzidine (DAB) 5 mg 溶於 PBS 中，調體積至 100 mL，加入 10 mL H₂O₂。

方法步驟：

1) 前一天轉形的培養皿，當菌落長至約 0.5 mm 大小時，將培養皿移至 4℃ 放置 1 h。

2) 準備一張無菌的硝化纖維濾膜，以鉛筆在邊緣標上組別。

◆ 請戴手套後再拿取濾膜！

3) 打開培養皿蓋子，以兩支扁平鑷子將濾膜兩邊夾住，輕輕覆蓋在菌落上方，儘可能避免有氣泡產生。

◆ 注意！濾膜覆蓋上去後就不要再移動！

4) 等濾膜完全溼透後，以針頭在濾膜邊緣戳洞做記號 (至少做三個記號)。小心把濾膜掀起，菌落朝上放置在 LB/Amp/IPTG plate 上。蓋上蓋子，在 37℃ 培養 2~4 h，以誘導啟動 T5 promoter，表現其下游基因。

5) 將培養皿蓋子打開，培養皿移至充滿 chloroform 蒸氣的乾燥器中，置放 30 min。

6) 取一個空 petri dish 或適當大小容器，加入 20 mL lysis buffer。 把已經過 chloroform 溶菌之濾膜浸入 lysis buffer，在室溫震盪 30 min。

7) 將濾膜以 PBS 浸洗搖盪 10 min，再更換 PBS 繼續浸洗 10 min。

8) 將濾膜浸於明膠 NET 溶液中，室溫搖盪 1 h。

9) 濾膜以 PBST 浸洗兩次，每次 10 min。

10) 一次抗體以明膠 NET 溶液適當稀釋，再將濾膜浸入，於室溫搖盪1 h。

11) 濾膜以 PBST 浸洗兩次，繼以 PBS 浸洗一次，每次 10 min。

12) 將濾膜置於二次抗體溶液中 (以明膠 NET 稀釋)，於室溫搖盪 1 h。

13) 濾膜以 PBST 浸洗兩次，繼以 PBS 浸洗一次，每次 10 min。

14) 以 DAB 溶液進行呈色反應。觀察呈色情形，當訊號可明顯與背景區別時，將濾膜以水浸洗數次，以中止呈色反應。

15) 將濾膜置於濾紙或吸水紙上乾燥後與原培養皿對照，標出有正反應的菌落位置。濾膜以膠膜護貝，避光貯存。

16) 選取數個正反應菌落，以劃單一菌落的方式分別接種在 LB/Amp plate 上，置 37℃ 培養直至菌落長出。亦同時接種於 3 mL LB/Amp 培養液，於 37℃ 震盪培養過夜，以抽取質體，進行限制脢分析。

註解討論：

a. 前一天進行轉形後，為何不直接將菌液塗抹在含有 IPTG 的培養基？

b. gus 基因原本就存在 E. coli 中，難道宿主菌株不會產生 GUS？

▲

2.7.2

Histochemical detection

操作原理與 colony hybridization 相同，但是將濾膜移置於含有 IPTG 及 5-bromo-4-chloro-3-indolyl b-D-glucuronide (X-Gluc) 的培養基。 X-Gluc 可被 GUS 作用而釋出藍色的產物，若轉型株所帶的質體接有 gus 基因的重組質體，則應可在 IPTG 的誘導條件下表現出蛋白質，若此重組蛋白質具有 GUS 活性，可將進入菌體的 X-Gluc 分解而使菌落呈藍色。

儀器用具：

平端鑷子

藥品試劑：

Nitrocellulose 濾膜

LB/Amp/IPTG/X-Gluc plate (LB plate 添加 100 mg/mL ampicillin, 0.2 M IPTG, 50 mg/mL X-Gluc)

方法步驟：

1) 前一天進行轉形的培養皿，當菌落長至約 0.5 mm 大小時，將培養皿移至 4℃ 放置至少 1 h。

2) 準備一張無菌的硝化纖維濾膜，以鉛筆在邊緣標上組別。

◆ 請戴手套後再拿取濾膜！

3) 打開培養皿蓋子，以兩支扁平鑷子將濾膜兩邊夾住，輕輕覆蓋在菌落上方，儘可能避免有氣泡產生。

◆ 注意！濾膜覆蓋上去後就不要再移動！

4) 等濾膜完全溼透後，以針頭在濾膜邊緣戳洞做記號 (至少做三個記號)。 小心把濾膜掀起，菌落朝上放置在 LB/Amp/IPTG/X-Gluc plate 上。蓋上蓋子，在 37℃ 培養，若轉形株帶有接上 gus 的質體，菌落應在 1~2 h 內轉呈藍色。 原培養皿則置回 37℃ 使菌落再長出。

5) 將濾膜與原培養皿對照，標出有藍色菌落位置。 選取數個菌落，以劃單一菌落的方式分別接種在 LB/Amp/plate 上，置 37℃ 直至菌落長出。 亦同時接種於 3 mL LB/Amp 培養液，於 37℃ 震盪培養過夜，以抽取質體，進行限制脢分析。

註解討論：

a. 前一天進行轉形後，為何不直接將菌液塗抹在含有 IPTG 及 X-Gluc 的培養基？

b. gus 基因原本就存在 E. coli 中，難道宿主菌株不會產生 GUS？

■ 結果參考『概說』Slide 4 

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2.7.3

質體快速檢定法

這個方法是以 phenol 及 chloroform 溶菌後直接進行電泳分析，並未將質體 DNA 與宿主細菌染色體 DNA 分離，得到的 DNA 也不能用限制脢作用。但因其快速簡便，所以可藉之於短時間內檢定大量轉形株中質體 DNA 的相對分子量，以初步篩選帶有重組質體的轉形株。

藥品試劑：

LB/Amp plates (LB plate 添加 100 mg/mL ampicillin)

1×NET (20 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 0.1 mM EDTA, pH 8.0)

PCI (25:24:1)

RNase A (1 mg/mL)

1% agarose gel

方法步驟：

1) 由前一天轉形所得的轉形株中，挑選 12~24 個單一菌落，在 LB/Amp plate 上劃數道短的橫線或斜線，同時也須要接種帶有載體 pQE31 之菌株，於 37℃ 培養過夜或直至菌體長出。

2) 以接種環將菌體刮下，懸濁在 30 mL 1×NET 中，震盪混合均勻。

◆ 不要忘了 pQE31/JM109！

3) 加入 30 mL PCI，劇烈震盪。

4) 以 12,000 rpm，離心 3 min (室溫)。

5) 將上層液吸至另一支乾淨離心管，加 1 mL RNase A 及 3 mL 10× 追蹤染劑，以 50 V 進行電泳分析。 由於樣品中有細菌染色體 DNA，所以在加入樣品槽時需十分小心，否則 DNA 極易流失在電泳緩衝液中。 電泳後，可由質體 DNA 的泳動率知其相對分子量大小。

6) 選取帶有質體分子量大於 pQE31 之菌落，接種於 3 mL LB/Amp 液體培養基，於 37℃ 震盪培養過夜，以抽取質體，進行限制脢分析。

▲

2.7.4

重組質體之檢定

2.7.4.1

重組質體之限制脢分析

儀器用具：

微量離心機

冰浴

真空乾燥濃縮機 (SpeedVac)

Mupid II 迷你電泳槽及鑄膠器

UV transilluminator

防護面罩

拍立得相機

藥品試劑：

如 2.1 節所列各試劑

限制脢：BamHI, HindIII (20 U/mL, BioLabs)

10×NE Buffer BamHI (0.1 M Tris-HCl, pH 7.9; 0.1 M MgCl₂; 1.5 M NaCl; 10 mM dithiothreitol)

100×BSA (10 mg/mL bovine serum albumin) 使用前稀釋十倍成 10×

無菌水

方法步驟：

1) 由 2.7.1、2.7.2 或 2.7.3 中得到的正反應株，接種於 3 mL LB/Amp 培養基，於 37℃ 震盪培養過夜後，以 2.1 之方法抽取質體。

2) 每一株每反應各取 3 mL 質體，另取 pQE31 及 pBlueGus 每反應各 3 mL，分別依下表進行 HindIII及 BamHI 切割。

3) 以 1% agarose gel進行電泳分析，由電泳圖譜挑選帶有 gus DNA片段之重組質體。

◆ 照相後之電泳膠片不要丟掉，可繼續進行 Southern 轉印。

限制脢分析請依照下列表格加入：

# 各管置請於 37℃ 反應至少 1 h。

■ 結果參考『概說』Slide 5 

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2.7.4.2

Southern 轉印分析

在膠體中的 DNA 可利用毛細現象的作用將 DNA 牽引轉印至覆蓋在膠片上的濾膜，經烘烤或 UV 照射後，可使 DNA 固定在膜上，以進行探針之雜合 (hybridization) 反應。

儀器用具：

玻璃缸

玻璃板或吸水海綿

Crosslinker (Stratalinker 1800, Stratagene)

藥品試劑：

10×SSC (1.5 M NaCl; 0.15 M sodium citrate) 或 20×SSC

變性溶液 (1.5 M NaCl; 0.5 N NaOH)

中和溶液 (1 M Tris-Cl; 1.5 M NaCl, pH 7.5)

Nylon membrane 尼龍膜

Whatman 3MM 濾紙

吸水紙

方法步驟：

1) 電泳之洋菜膠片，浸於 0.25 N HCl 中 15 min (當 DNA 分子量不大時，可省去此步驟)；以無菌水潤洗膠片後，將膠片置於變性溶液中，於室溫緩慢震盪 15 min，更換新的變性溶液後再處理 15 min。

2) 以無菌水潤洗膠片，再以中和溶液浸泡 30 min，其間更換一次。

3) 戴手套將尼龍膜剪裁成膠體大小，在角落剪一缺口作記號。另裁剪數張較膠片稍小之 3MM 濾紙。

4) 取一玻璃缸，加入 10×SSC。將一塊長形玻璃板架在缸上，裁剪一張長形 3MM 濾紙，寬度須略大於膠片，將濾紙置於玻璃板上，使濾紙兩端順著玻璃板垂入缸內溶液中。加一些 10×SSC 於濾紙上使其溼透，並趕掉濾紙與玻璃板間的氣泡。

◆ 若有 3~5 cm 厚的乾淨海綿，則可取代玻璃板。可將海綿置於缸中，加入 10×SSC，但不可淹過海綿。海綿濕透後，其上放一張比膠片大的 3MM 濾紙，要趕掉濾紙與海綿間的氣泡。

5) 將處理過的膠片置於濾紙上，趕掉氣泡，小心將尼龍膜蓋在膠片上，不要有氣泡產生。 再依序蓋上兩張以 10×SSC 浸溼的濾紙及兩張乾的濾紙，並以保鮮膜將膠片四週封住。最後覆蓋一疊吸水紙，上面放一塊玻璃板或塑膠板，以重物壓住即可 (圖 3.2)。在室溫下靜置過夜。

6) 轉印後，小心移去重物、吸水紙、3MM 濾紙等，在尼龍膜相對於樣品槽的位置作記號。 將尼龍膜掀開，與膠片接觸面朝上，置於 10×SSC 中緩慢震盪 5 min，以洗去附著在膜上的洋菜膠。 轉印後的膠片可再以 EtBr 染色，視是否轉印完全。

7) 將尼龍膜置於乾淨的濾紙上 (與膠片接觸面朝上)，移至 UV crosslinker 中，進行 crosslinking 以將 DNA 固定在膜上。

8) 乾燥後的尼龍膜即可進行雜合。 若不立即進行雜合，可將尼龍膜夾於兩張濾紙間，置於乾燥箱中存放。 雜合探針的製備與雜合反應將於 3.2.1 及 3.3.2 節中進行。

■ 結果參考『概說』Slide 6 

參考文獻：

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