生物技術方法  卷一

▼ 生物技術核心實驗  BCT 

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第○章  
 

ContentsChapter 0 Chapter 1Chapter 2Chapter 3 Chapter 4 . Appendix

 
     
  本核心實驗的主角 - GUS 基因  
     
 

台灣大學園藝系     黃 鵬 林   

 
     
 

 

 
      
 

本實驗課程的目標,係提供初學者 基礎的生物技術觀念,並使初學者熟悉生物技術的基本操作。 本課程於是設計一系列連貫性的實驗,並依操作技術的不同歸類在三個獨立的領域:其一為 DNA,其二為 RNA,其三為蛋白質。 課程的架構,係使用同一個基因,先進行重組 DNA 的操作 (第二章),構築一個表現質體,再利用此表現質體表達出 RNA,來進行北方雜合分析 (第三章),最後利用該表現質體來表現大量的蛋白質,於是可以進行蛋白質的純化與檢定 (第四章)。 為了讓初學者容易得到實驗結果,以建立初學者的信心與興趣,於是選擇大腸桿菌 (E. coli) 之 b-glucuronidase (GUS) 基因 (uidA 或稱 gusA) 作為本實驗課程的主角。 該基因產物為 GUS 蛋白質,相當穩定而不易降解,並為一水解酵素,有簡易的測定方法;且可使用市售的基質 (substrate) 在原位 (in situ) 顯現出酵素的活性,以肉眼即可檢測其產物,非常便利。 基因選定之後,我們於是構築了兩種質體 (如 表 0.1 所示),包括 pBlueGus 及其表現載體 pQG11 (其構築流程顯示於 圖 0.1)。 簡而言之,首先利用 聚合脢連鎖反應 (polymerase chain reaction) 合成 GUS 基因,此基因長度為 1,807 bp,並於 5' 及 3' 端點分別接上 BamHI 及 HindIII 限制脢的切割序列,然後分別使用 pBluescript SK(-) 及 pQE31 為載體及表現載體,經 BamHI 及 HindIII 脢切之後,將 GUS 基因與 pBluescript 連接,或連接至 pQE31 核糖體結合序列 (ribosome binding sequence) 以及連續六個組胺酸 (histidine) 解碼序列 (6xHis) 之下游。為了確保 GUS 基因的忠實度 (fidelity),防止聚合脢連鎖反應合成基因片段出現失誤的可能性,於是在表現載體 pQG11 構築完成之後,利用所表現的蛋白質來測定酵素活性,所使用的檢測法是使用 p-nitrophenyl  b-D-glucuronide 為基質,經反應後於分光光度計測量 415 nm 之吸光。 如此,為了本課程所設計之實驗材料就準備就緒了。

 
      

T0.1

 

 
 

表 0.1 本課程所用之 GUS 基因構築一覽表

 
 

Name

Vector

Insert

Host

Selective antibiotics

pBlueGus

pBluescript SK (-) (2.97Kb)

GUS gene (1.8 Kb) BamHI/HindIII

JM109

Amp

pQG11

pQE31 (3.46 Kb)

GUS gene (1.8 Kb) BamHI/HindIII

JM109

Amp

pQG11

pQE31 (3.46 Kb)

GUS gene (1.8 Kb) BamHI/HindIII

M15 [pREP4]

Amp/Kan

 

F0.1

   
     
 

 
 

(點選上圖可放大)

 
 

圖 0.1  pQG11 表現載體之構築

 
     
 

 參考『概說Slide 2 

 
     

 

參考文獻:

 
 

Jefferson RA, Burgess SM, Hirsh D (1986) b-Glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker. Proc Natl Acad Sci USA 83: 8447-8451

 
 

Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW (1987) GUS fusion: b-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J 6: 3901-3907

 
     
 

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最近修訂日期︰ 2004/03/23