2.1  如何開始？

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先考慮以下諸點      

   ask:

 a.  要純化那一個蛋白質？

 b.  為何要純化此蛋白質？

 c.  由何種材料純化？   

 d.  由那一個生長期？   

 e.  如何純化此蛋白質？   

 5W

What ?

Why ?

Where?

When ?

How ?

  ◇ 5 純化策略

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 2.2  材料來源：

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a. 材料取得

抽取酵素的材料來源，通常不外 動物、植物 及 微生物，或可用動植物的細胞或組織培養。採樣時，應考慮在那一個生長期、在那一個器官或組織中，有最高的酵素含量。 材料的採集會大大影響實驗的成敗，遇到材料採集有困難，或者材料品質不穩定時，更是花費時間、精神。 一定要控制穩定的材料來源！

b. 材料的差異性很大

植物細胞比起動物細胞，構造上有許多差異，在材料的選擇上，應特別注意。植物的細胞壁相當堅硬，要用相當大的力量去打破。 其細胞內的區隔較動物細胞複雜，有很大的液泡，內藏低 pH 的溶液以及蛋白質等『有害』物質。 另含有葉綠体及澱粉粒，亦是植物細胞的特徵。不同來源的材料，各有特定的採集或抽取問題，大多需要自行嘗試解決。

c. 材料貯藏

材料採集後馬上進行抽取，是為上上策；但很多情況下，材料必須冰凍貯存一段時期後，才進行抽取；則應在採集後，儘速置於 -20℃，若能先以液態氮冰凍後貯於 -70℃則更佳。 冰箱 的除霜循環，可能對細胞造成傷害，要特別小心。 解凍時要越快越好，但避免局部過熱。 有些酵素材料可乾燥起來保存，在無水狀況下，酵素可免受蛋白脢或水分子晶体的破壞；一般用冷凍乾燥法，或製成 丙酮粉末。

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 2.3  均質及抽取：

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a. 打破細胞

目標酵素若在細胞之內，則抽取的第一步驟，就是先打破細胞，有難有易。例如動物的紅血球，只要改變滲透壓即可脹破，但植物的 癒創組織 就很堅固，要用海砂用力研磨。 有些實驗要使用細胞內的胞器 (organelle) 進行，則需以較溫和的方法打開細胞後，再用密度離心法分離各胞器；此步驟難度較高，要參考文獻多試方法。

◆ CSU: 細胞均質方法

b. 打破細胞的方法

就一般材料而言，可能用到的方法列舉如下： 

(1) 乾式： 不用加緩衝研磨液，直接研磨成乾粉。

液態氮研磨： 材料在液態氮中凍結，以研砵打碎材料後研磨成粉。

磨粉機： 類似果汁機，原本使用在乾磨中藥藥材。

球磨機 (ball mill)： 以小球增加研磨面積，多用在研磨酵母菌粉。

(2) 溼式： 都要在低溫下研磨。

均質器： 玻璃或鐵氟龍材質，是較溫和的研磨方法。

果汁機 (Waring blender)： 每打一分鐘，要間歇數分鐘降溫，重複進行數次。

Polytron： 高速電動研磨機，效率極高，目前最常用的均質器。

研砵： 磨成細粉後的材料，再加入海砂或玻璃砂助磨；傳統而實用。

玻璃球 (glass bead)︰ 以很細的玻璃球混在樣本中，用力振盪，可打破酵母菌。 

超音波震盪 (ultrasonication)： 以超音波打破細胞，多用在微生物材料。

French press： 將樣本加壓快速通過細孔，以剪力破壞細胞。

c. 提高抽出率

分泌性的酵素，多散佈在材料中，只要研磨均勻，大多可抽取得到。 但在均質前，通常都要把材料先切成碎片 (增大表面積)，才容易進行抽取。 很多情況下，要先以磨粉機或果汁機打碎，否則抽出率不會很高。 材料亦可以液態氮急速冷卻，則組織變得很脆，可以磨得很細，提高抽出率，且可防止酵素活性喪失。 注意有些材料不能研磨過度，以免細胞破得太碎。

d. 抽取 緩衝液

均質用的緩衝液体積，通常加入樣本体積的兩倍量以上，以四或五倍為宜，但事先磨成粉末的，有時要加到十倍以上才能均勻懸濁之。 可把緩衝液分成二或三次分批抽取，可增加抽出率。

e. 注意干擾物質

植物材料的均質過程要特別小心，因植物細胞在打破後，會劇烈降低其 pH 值。 很多植物材料有含酚化合物 phenolic compounds，在空氣中很快氧化成褐色色素，因吸附性強故難以去除。含量較少者可在緩衝液加入 b-mercaptoethanol，降低催化其生成的酵素 phenol oxidase；量多時則以 PVPP (polyvinyl polypyrrolidone) 吸附之 (圖 2.2)。 植物本身所含的色素也很難去除，可能會干擾純化步驟。

圖 2.2  多酚化合物的生成與防止

f. 膜上蛋白質

有些酵素附著在細胞壁或細胞膜上，不能以普通緩衝液溶出。 則可先把材料製成 丙酮粉末 (acetone powder)，再加入緩衝液時，稍具水溶性的蛋白質就會溶出；但有時須在緩衝液中，加入 界面活性劑 (detergent)，溶出嵌在細胞膜中的蛋白質。 常用的有 sodium deoxycholate 或 Triton，因後者屬非離子性分子，較不影響酵素活性及純化步驟，多使用之。

g. 去除混濁物

均質後可以離心分開可溶與不溶部分，離心不易分開的，可再用過濾法；過濾時可加助濾劑，如 矽藻土 (celite)。 離心後，在上清表面可能會有一層浮皮，多為脂質，可撈掉或以紗布過濾掉。

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 2.4  鹽析及沉澱法：

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鹽析沉澱法可分離出樣本中的蛋白質。 蛋白質在水溶液中的 溶解度，會因溶液中其它鹽類濃度的改變而增減，可利用來沉澱蛋白質。 其原理是因於蛋白質分子表面電荷的改變，或者分子上 極性 或 非極性 區域與水分子間作用結果。

2.4.1

鹽析分劃法

各種蛋白質沈澱方法的原理及應用，在以下各節以圖解 (圖 2.3, 2.4, 2.5) 說明之，並整理在最後的 表 2.1。

a. 鹽溶 (salting in)

(1) 等電點 (pI) 為蛋白質電荷性質的指標 ，若緩衝液的 pH 調至此蛋白質的 pI，則蛋白質分子的淨電荷為零，分子間的排斥力下降，凝聚成大粒子沉澱下來。此時若增加緩衝液的離子濃度 (如加入 NaCl)，則蛋白質的溶解度會漸漸上升，稱為 鹽溶。

(2) 可能是鹽類離子包圍蛋白質表面，與分子上的帶電基團或極性區域作用，進而增加水合效果所造成的。

(3) 利用前者在蛋白質 pI 沉澱的特性，可純化該酵素，但需注意有些酵素 在其 pI 沉澱 後，不容易再溶解。

■ 等電點與環境的關係

■ 鹽濃度影響蛋白質溶解度

圖 2.3  鹽溶 salting in 方法的原理圖解

b. 鹽析 (salting out)

(1) 蛋白質分子表面上 非極性區域 附近的水分子，被迫滯留在此區域附近，以便藉此把蛋白質分子溶入水中。

(2) 若外加入大量離子 (如硫酸銨)，則這些滯留的水分子會被抽出，與新加入的離子產生水合，因而暴露出蛋白質上的非極性區；蛋白質分子間，因此得以非極性基團互相結合，造成大的沉澱粒子，稱 鹽析。

圖 2.4  鹽析 salting out 方法的原理圖解

c. 硫酸銨 (ammonium sulfate)

(1) 硫酸銨是一 中性鹽，對蛋白質有相當好的 安定作用。 又因為其離子容積較大，吸走水分子的能力也大，成為有效的鹽析工具。

(2) 通常硫酸銨的添加以 百分飽和度 來表示 (不是濃度百分比)，例如大部分蛋白質可在 80% 硫酸銨飽和度下沉澱。 因為硫酸銨加入的體積很大，會改變最後的總體積，很難由濃度百分比來計算，因此使用百分飽和度作為沈澱蛋白質的度量。

(3) 飽和度隨溫度變化稍有差異，25℃下的飽和濃度為 4.1 M，即每公升加入 767 克固体硫酸銨；0-100% 之間各飽和度的添加量要查表，而不是以 767 克直接乘以其百分比值 (%)。

(4) 各種蛋白質，因其表面的非極性區域分佈不同，各在其特定的硫酸銨飽和濃度下沉澱，一般做為初步的純化。

■ 硫酸銨飽和濃度表

d. 如何使用硫酸銨

(1) 硫酸銨容易吸收空氣中的水分而結塊，因此使用前最好先把硫酸銨磨碎，平鋪在烤箱 (約 60℃) 內烘過，切勿過熱。

(2) 添加硫酸銨時，要在冰浴中進行，不可一次把硫酸銨倒入，而以小量分多次慢慢溶入，並不時攪拌，以免造成局部濃度過高。 硫酸銨全加完後，再攪拌約 10 - 30 min，使溶解完全平衡，然後進行離心，注意所要的是沉澱或上清，要弄清楚！

(3) 最後所得的沉澱溶解在最少量的緩衝液中，或者以沉澱形式保存，均 相當安定；但要記得其中所含的硫酸銨，是否對下一步檢定或純化有影響，可以透析法除去之。

2.4.2

有機溶劑沉澱法

a. 降低水活性

若在蛋白質溶液中加入有機溶液，如丙酮或乙醇，因 稀釋水濃度 而降低水活性，則蛋白質上親水性區域的水合度降低，開始聚集在一起，產生沉澱。 也可看作有機溶劑降低溶液的介電常數，使蛋白質的溶解度降低。應當注意，有些細胞膜上的蛋白質，本身含有很多疏水性區，在有機溶劑中反而易溶。

b. 使用有機溶劑

要先把溫度降至零度左右，緩緩加到蛋白質溶液中，並一邊攪拌使生沉澱。 以丙酮為例，大多以 20-50% (v/v) 濃度來沉澱蛋白質；注意其中的 v/v 乃指加入前的体積；因丙酮與水混合後，体積會稍微縮小。溶液中若有高濃度鹽類，則會影響沉澱行為，以 0.05-0.2 M 離子強度為限度。

c. 沉澱收集

此法所得的沉澱粒子較大，以重力沉降即可收得沉澱，但一般仍以離心收集，以增加回收，並可去除丙酮。蛋白質沉澱可涼乾，或在布氏漏斗中以少量乙醚洗過製成粉末；所得沉澱中的有機溶液並不多，通常並不影響下一步驟。

圖 2.5  有機溶劑沈澱法的原理圖解

2.4.3

其它處理法

a. Polyethylene glycol (PEG)

(1) PEG 是一種水溶性的高分子聚合物，分子量 4,000 以上的 PEG 可以用來沉澱蛋白質，其作用原理類似有機溶液，但使用濃度較低。

(2) 較麻煩的是 PEG 不易由蛋白質沉澱中除去，幸而 PEG 通常並不影響下一步純化步驟。 

b. 去除核酸及多醣

(1) 樣本溶液中若有大量核酸，可以加 protamine sulfate 與之產生沉澱，再以離心去除之。

(2) 碳水化合物較難完全去掉，通常期望在蛋白質沉澱時，或往後的層析法能去除。二者都可以用對應的水解作酵素分解，但價錢昂貴。

◇ 魚精蛋白 protamine sulfate

c. 特殊處理

有些較特別的酵素，具有特殊性質，可利用在純化上。 例如 RNase 對熱非常安定，可耐得 100℃，因此可把粗酵素液加熱煮沸，除去其它蛋白質。對強酸、強鹼或有機溶劑的特殊安定性，亦可利用之。不過使用這些嚴苛的處理方法時，要特別小心控制好其正確條件。

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表 2.1  各種鹽析及沉澱法的比較：

蛋白質分子表面的帶電基團  

蛋白質分子表面的非極性基團

除 hydrophobic 之外的其他作用力  

NaCl (單價離子)  

硫酸銨 (兩價離子)

甲醇、丙酮等有機溶劑

蛋白質在其 pI 下，因淨電荷為零而聚集沉澱；若加入鹽類，會阻礙其聚集而增加溶解度。

硫酸銨的兩價離子，在溶液中搶走附在蛋白質表面 (非極性部分) 的水分子，使得非極性部分相互吸引而聚集沉澱。

降低水活性，使溶液的介電常數下降，增加蛋白質溶質分子之間的作用力，而聚集在一起。  

圖 2.3

圖 2.4

圖 2.5

對較低濃度緩衝液進行 透析是 salting in 的反向過程。

1)  非極性蛋白質較早沉澱下來。 

1)  部分蛋白質會變性。

2)  在硫酸銨中蛋白質相當穩定。

2)  有助沉澱的因素：蛋白質分子量大、緩衝液 pH 靠近 pI。

3)  脂溶性蛋白質的溶解度反而增加。

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