目 錄

酵素純化方法

酵素分析方法

問 題 集

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1 酵素純化實驗室

2 蛋白質抽取

3 色層分析法

4 其它純化方法

5 純化策略

 

2.1  如何開始?

2.2  材料來源

2.3  均質及抽取

2.4  鹽析及沉澱

   2.4.1 鹽析分劃法

   2.4.2 有機溶劑沉澱法

   2.4.3 其它處理法

 

   

  2  蛋白質抽取

酵素的純化過程,約可分為三個階段:

(1) 粗蛋白質 (crude protein)︰ 採樣 → 均質打破細胞 → 抽出全蛋白,多使用 鹽析沉澱法;可以粗略去除蛋白質以外的物質。

(2) 部分純化 (partially purified)︰ 初步的純化,使用各種 管柱層析法

(3) 均質酵素 (homogeneous)︰ 目標酵素的進一步精製純化,可用 製備式電泳 HPLC

圖 2.1 列出其相關的純化及分析方法。

2.1  酵素純化階段與各種分析方法

  ■ 各種純化與分析方法   自行組合各種純化方法

 

 2.1  如何開始?

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先考慮以下諸點      

   ask:

 a.  要純化那一個蛋白質?

 b.  為何要純化此蛋白質?

 c.  由何種材料純化?   

 d.  由那一個生長期?   

 e.  如何純化此蛋白質?   

 5W

What ?

Why ?

Where?

When ?

How ?

   5 純化策略

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 2.2  材料來源

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a. 材料取得

抽取酵素的材料來源通常不外 動物植物 微生物,或可用動植物的細胞或組織培養。採樣時,應考慮在那一個生長期、在那一個器官或組織中,有最高的酵素含量。 材料的採集會大大影響實驗的成敗,遇到材料採集有困難,或者材料品質不穩定時,更是花費時間、精神。 一定要控制穩定的材料來源

  

 

b. 材料的差異性很大

植物細胞比起動物細胞,構造上有許多差異,在材料的選擇上,應特別注意。植物的細胞壁相當堅硬,要用相當大的力量去打破。 其細胞內的區隔較動物細胞複雜,有很大的液泡,內藏低 pH 的溶液以及蛋白質等『有害』物質。 另含有葉綠体及澱粉粒,亦是植物細胞的特徵。不同來源的材料,各有特定的採集或抽取問題,大多需要自行嘗試解決

 

c. 材料貯藏

材料採集後馬上進行抽取,是為上上策;但很多情況下,材料必須冰凍貯存一段時期後,才進行抽取;則應在採集後,儘速置於 -20℃,若能先以液態氮冰凍後貯於 -70℃則更佳。 冰箱 的除霜循環,可能對細胞造成傷害,要特別小心。 解凍時要越快越好,但避免局部過熱。 有些酵素材料可乾燥起來保存,在無水狀況下,酵素可免受蛋白脢或水分子晶体的破壞;一般用冷凍乾燥法,或製成 丙酮粉末

 

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 2.3  均質及抽取

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a. 打破細胞

目標酵素若在細胞之內,則抽取的第一步驟,就是先打破細胞,有難有易。例如動物的紅血球,只要改變滲透壓即可脹破,但植物的 癒創組織 就很堅固,要用海砂用力研磨。 有些實驗要使用細胞內的胞器 (organelle) 進行,則需以較溫和的方法打開細胞後,再用密度離心法分離各胞器;此步驟難度較高,要參考文獻多試方法。

CSU: 細胞均質方法

b. 打破細胞的方法

就一般材料而言,可能用到的方法列舉如下: 

(1) 乾式: 不用加緩衝研磨液,直接研磨成乾粉。

液態氮研磨: 材料在液態氮中凍結,以研砵打碎材料後研磨成粉。

磨粉機: 類似果汁機,原本使用在乾磨中藥藥材。

球磨機 (ball mill): 以小球增加研磨面積,多用在研磨酵母菌粉。

(2) 溼式: 都要在低溫下研磨。

均質器: 玻璃或鐵氟龍材質,是較溫和的研磨方法。

果汁機 (Waring blender): 每打一分鐘,要間歇數分鐘降溫,重複進行數次。

Polytron: 高速電動研磨機,效率極高,目前最常用的均質器。

研砵: 磨成細粉後的材料,再加入海砂或玻璃砂助磨;傳統而實用。

玻璃球 (glass bead)︰ 以很細的玻璃球混在樣本中,用力振盪,可打破酵母菌。 

超音波震盪 (ultrasonication): 以超音波打破細胞,多用在微生物材料。

French press: 將樣本加壓快速通過細孔,以剪力破壞細胞。

 

c. 提高抽出率

分泌性的酵素,多散佈在材料中,只要研磨均勻,大多可抽取得到。 但在均質前,通常都要把材料先切成碎片 (增大表面積),才容易進行抽取。 很多情況下,要先以磨粉機或果汁機打碎,否則抽出率不會很高。 材料亦可以液態氮急速冷卻,則組織變得很脆,可以磨得很細,提高抽出率,且可防止酵素活性喪失。 注意有些材料不能研磨過度,以免細胞破得太碎。

 

d. 抽取 緩衝液

均質用的緩衝液体積,通常加入樣本体積的兩倍量以上,以四或五倍為宜,但事先磨成粉末的,有時要加到十倍以上才能均勻懸濁之。 可把緩衝液分成二或三次分批抽取,可增加抽出率。

 

e. 注意干擾物質

植物材料的均質過程要特別小心,因植物細胞在打破後,會劇烈降低其 pH 值。 很多植物材料有含酚化合物 phenolic compounds,在空氣中很快氧化成褐色色素,因吸附性強故難以去除。含量較少者可在緩衝液加入 b-mercaptoethanol,降低催化其生成的酵素 phenol oxidase;量多時則以 PVPP (polyvinyl polypyrrolidone) 吸附之 (圖 2.2)。 植物本身所含的色素也很難去除,可能會干擾純化步驟。

 

圖 2.2  多酚化合物的生成與防止

f. 膜上蛋白質

有些酵素附著在細胞壁或細胞膜上,不能以普通緩衝液溶出。 則可先把材料製成 丙酮粉末 (acetone powder),再加入緩衝液時,稍具水溶性的蛋白質就會溶出;但有時須在緩衝液中,加入 界面活性劑 (detergent),溶出嵌在細胞膜中的蛋白質。 常用的有 sodium deoxycholate 或 Triton,因後者屬非離子性分子,較不影響酵素活性及純化步驟,多使用之。

 

g. 去除混濁物

均質後可以離心分開可溶與不溶部分,離心不易分開的,可再用過濾法;過濾時可加助濾劑,如 矽藻土 (celite)。 離心後,在上清表面可能會有一層浮皮,多為脂質,可撈掉或以紗布過濾掉。

 

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 2.4  鹽析及沉澱法

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鹽析沉澱法可分離出樣本中的蛋白質。 蛋白質在水溶液中的 溶解度,會因溶液中其它鹽類濃度的改變而增減,可利用來沉澱蛋白質。 其原理是因於蛋白質分子表面電荷的改變,或者分子上 極性 非極性 區域與水分子間作用結果

2.4.1

鹽析分劃法

各種蛋白質沈澱方法的原理及應用,在以下各節以圖解 (圖 2.3, 2.4, 2.5) 說明之,並整理在最後的 表 2.1

a. 鹽溶 (salting in)

(1) 等電點 (pI) 為蛋白質電荷性質的指標 ,若緩衝液的 pH 調至此蛋白質的 pI,則蛋白質分子的淨電荷為零,分子間的排斥力下降,凝聚成大粒子沉澱下來。此時若增加緩衝液的離子濃度 (如加入 NaCl),則蛋白質的溶解度會漸漸上升,稱為 鹽溶

(2) 可能是鹽類離子包圍蛋白質表面,與分子上的帶電基團或極性區域作用,進而增加水合效果所造成的。

(3) 利用前者在蛋白質 pI 沉澱的特性,可純化該酵素,但需注意有些酵素 在其 pI 沉澱 後,不容易再溶解。

 

等電點與環境的關係

鹽濃度影響蛋白質溶解度

圖 2.3  鹽溶 salting in 方法的原理圖解

b. 鹽析 (salting out)

(1) 蛋白質分子表面上 非極性區域 附近的水分子,被迫滯留在此區域附近,以便藉此把蛋白質分子溶入水中。

(2) 若外加入大量離子 (如硫酸銨),則這些滯留的水分子會被抽出,與新加入的離子產生水合,因而暴露出蛋白質上的非極性區;蛋白質分子間,因此得以非極性基團互相結合,造成大的沉澱粒子,稱 鹽析

 

圖 2.4  鹽析 salting out 方法的原理圖解

c. 硫酸銨 (ammonium sulfate)

(1) 硫酸銨是一 中性鹽,對蛋白質有相當好的 安定作用。 又因為其離子容積較大,吸走水分子的能力也大,成為有效的鹽析工具。

(2) 通常硫酸銨的添加以 百分飽和度 來表示 (不是濃度百分比),例如大部分蛋白質可在 80% 硫酸銨飽和度下沉澱。 因為硫酸銨加入的體積很大,會改變最後的總體積,很難由濃度百分比來計算,因此使用百分飽和度作為沈澱蛋白質的度量。

(3) 飽和度隨溫度變化稍有差異,25℃下的飽和濃度為 4.1 M,即每公升加入 767 克固体硫酸銨;0-100% 之間各飽和度的添加量要查表,而不是以 767 克直接乘以其百分比值 (%)。

(4) 各種蛋白質,因其表面的非極性區域分佈不同,各在其特定的硫酸銨飽和濃度下沉澱,一般做為初步的純化。

 

 

硫酸銨飽和濃度表

d. 如何使用硫酸銨

(1) 硫酸銨容易吸收空氣中的水分而結塊,因此使用前最好先把硫酸銨磨碎,平鋪在烤箱 (約 60℃) 內烘過,切勿過熱

(2) 添加硫酸銨時,要在冰浴中進行,不可一次把硫酸銨倒入,而以小量分多次慢慢溶入,並不時攪拌,以免造成局部濃度過高。 硫酸銨全加完後,再攪拌約 10 - 30 min,使溶解完全平衡,然後進行離心,注意所要的是沉澱或上清,要弄清楚!

(3) 最後所得的沉澱溶解在最少量的緩衝液中,或者以沉澱形式保存,均 相當安定;但要記得其中所含的硫酸銨,是否對下一步檢定或純化有影響,可以透析法除去之。

 

2.4.2

有機溶劑沉澱法

 

a. 降低水活性

若在蛋白質溶液中加入有機溶液,如丙酮或乙醇,因 稀釋水濃度 而降低水活性,則蛋白質上親水性區域的水合度降低,開始聚集在一起,產生沉澱。 也可看作有機溶劑降低溶液的介電常數,使蛋白質的溶解度降低。應當注意,有些細胞膜上的蛋白質,本身含有很多疏水性區,在有機溶劑中反而易溶。

 

b. 使用有機溶劑

要先把溫度降至零度左右,緩緩加到蛋白質溶液中,並一邊攪拌使生沉澱。 以丙酮為例,大多以 20-50% (v/v) 濃度來沉澱蛋白質;注意其中的 v/v 乃指加入前的体積;因丙酮與水混合後,体積會稍微縮小。溶液中若有高濃度鹽類,則會影響沉澱行為,以 0.05-0.2 M 離子強度為限度。

 

c. 沉澱收集

此法所得的沉澱粒子較大,以重力沉降即可收得沉澱,但一般仍以離心收集,以增加回收,並可去除丙酮。蛋白質沉澱可涼乾,或在布氏漏斗中以少量乙醚洗過製成粉末;所得沉澱中的有機溶液並不多,通常並不影響下一步驟。

 

圖 2.5  有機溶劑沈澱法的原理圖解

2.4.3

其它處理法

 

a. Polyethylene glycol (PEG)

(1) PEG 是一種水溶性的高分子聚合物,分子量 4,000 以上的 PEG 可以用來沉澱蛋白質,其作用原理類似有機溶液,但使用濃度較低。

(2) 較麻煩的是 PEG 不易由蛋白質沉澱中除去,幸而 PEG 通常並不影響下一步純化步驟。 

 

b. 去除核酸及多醣

(1) 樣本溶液中若有大量核酸,可以加 protamine sulfate 與之產生沉澱,再以離心去除之。

(2) 碳水化合物較難完全去掉,通常期望在蛋白質沉澱時,或往後的層析法能去除。二者都可以用對應的水解作酵素分解,但價錢昂貴。

魚精蛋白 protamine sulfate

c. 特殊處理

有些較特別的酵素,具有特殊性質,可利用在純化上。 例如 RNase 對熱非常安定,可耐得 100℃,因此可把粗酵素液加熱煮沸,除去其它蛋白質。對強酸、強鹼或有機溶劑的特殊安定性,亦可利用之。不過使用這些嚴苛的處理方法時,要特別小心控制好其正確條件。

 

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表 2.1  各種鹽析及沉澱法的比較:

  Salting in 鹽溶 Salting out 鹽析 有機溶劑沉澱  
影響因素

蛋白質分子表面的帶電基團  

蛋白質分子表面的非極性基團

除 hydrophobic 之外的其他作用力  

試劑

NaCl (單價離子)  

硫酸銨 (兩價離子)

甲醇、丙酮等有機溶劑

發生機制

蛋白質在其 pI 下,因淨電荷為零而聚集沉澱;若加入鹽類,會阻礙其聚集而增加溶解度。

硫酸銨的兩價離子,在溶液中搶走附在蛋白質表面 (非極性部分) 的水分子,使得非極性部分相互吸引而聚集沉澱。

降低水活性,使溶液的介電常數下降,增加蛋白質溶質分子之間的作用力,而聚集在一起。  

2.3

2.4

2.5

其它說明

對較低濃度緩衝液進行 透析是 salting in 的反向過程。

1)  非極性蛋白質較早沉澱下來。 

1)  部分蛋白質會變性。

2)  在硫酸銨中蛋白質相當穩定。

2)  有助沉澱的因素:蛋白質分子量大、緩衝液 pH 靠近 pI。

3)  脂溶性蛋白質的溶解度反而增加。

     

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本網頁最近修訂日期: 2004/01/06