Pur 補充幻燈片

當溶液中的酸鹼度逐漸接近某蛋白質的等電點 (例如 5.2) 時，此蛋白質的溶解度會漸漸下降，這是因為蛋白質分子上的淨電荷漸漸趨向零，蛋白質分子之間的互斥力降低所致；此外，這個淨電荷為零的蛋白質分子上，事實上還是有數目相同的正負電荷，這些正負電荷對互相吸引也有貢獻。可以利用這種特性，來沈澱出某已知等電點的蛋白質。

但若溶液中的鹽濃度漸漸提高，則蛋白質的溶解度也會提高，這是因為鹽所解析出來的大量正負離子，會阻斷上述正負電荷間的相吸，因而使得蛋白質溶入水中。當然，越遠離此蛋白質的等電點，這種溶入現象越是顯著。

上面兩圖所說明的，都是這種鹽溶的性質，只是座標表現方式不同，所顯現出來的表達方式稍有不同。

若要分類自然界中的所有分子，可以大略分成極性及非極性兩大類。

極性分子上的電子分佈不均勻，常常造成分子上某些部份的電子密度較大，因而產生偶極性，偶極會有暫時性的正負電荷產生；因此兩個極性分子相遇，可利用其偶極性的正負電荷互相吸引，會有較大的親和力。

反之，非極性的分子上，其電子密度分佈較為均勻，因此不會有偶極產生，事實上非極性分子上不會帶有電荷。非極性的分子，比較喜歡與非極性的分子接近，可以看作因為無法與極性分子接近，被極性分子排斥所造成的非極性間的相互吸引力量。也可以說是分子上電子的短暫分配不均，所形成的凡得瓦爾吸引力。

為何極性分子上的電子密度分佈會較不均勻？若分子內的任何兩個原子之間，其間的陰電性相差太大，例如氫 (陰電性 2.1) 與氧 (3.5)，則氫原子上的電子會被氧原子所吸引，使得氫氧附近的電子分佈不均勻。反之，碳 (2.5) 與氫 (2.1) 之間的陰電性相差較小，因此飽和碳氫化合物都是屬於極性較小的分子。

陰電性是描述一個原子搶電子的能力，陰電性大者容易搶奪其相鄰原子的電子。這是與其原子構造有關，在週期表右方的原子，因為其原子核內的質子數越來越多，正電荷較大，因此吸引電子的能力也較大。因此，分子的化學性質，幾乎都可用電子的爭奪來解釋；而分子或基團的極性大小，也可解釋大半的生物化學現象。

質子 proton 是宇宙中的奇妙粒子，這是一顆光溜溜的粒子；當氫原子丟掉一個電子後，即可得到質子，因此寫作 H⁺。質子可以隨時附著到一個帶有電子密度的基團 (如胺基)，使該基團多帶了一個正電。質子也很容易由某一個基團脫出 (如羧基)，而使該基團成為帶負電。在水環境中，質子數量的多寡就是酸鹼度的指標，會影響分子上各種基團的帶電性質。而巨分子上這些電荷性質的變化，就是生物化學裡許多反應機制的根本肇因。

要純化或分離出某種蛋白質，就要利用蛋白質之間某些性質上的差異，例如它們的形狀、大小、比重等不同。

如上圖的假想例中有 12 個物件，其大小、形狀與比重都不完全相同。若我們要分離出其中的 5 號木球，首先用一大一小兩種篩子，就可去掉 1, 2, 3 號三個較大者，以及 9, 10, 11, 12 號四個較小者。剩下的 4 - 8 號都有相同的大小，但因比重不同，在一個裝有密度梯度溶液 (如甘油梯度) 的量筒中，7 號石頭塊很塊下沈，六號棉球又無法下沈，我們因此可以在中央部份收到木質的 4, 5, 8 號物件。然後把這最後的三個物件放在一斜坡上滾下來，5 號木球會因為形狀的關係滾得最快，而 4 號因為是方塊而幾乎不動，8 號則介於兩者之間慢慢滾下來。我們因此可以分離得到 5 號木球，同時也可分得 4 號及 8 號。

在實際生活裡，我們當然不會用如此笨拙的方法來分離這些東西，但其基本原理與蛋白質的分離與純化非常類似；我們的確利用蛋白質間分子量、分子形狀及密度的不同，或者分子所帶電荷不同，來作酵素的純化分離工作。

■ 以電腦管理文獻資料


	科學文獻的查詢與存取，因為電腦及軟體的應用，變得非常有效而且有趣。
	電腦在文獻管理上的進步速度非常快速，而且越來越方便。目前已經能夠在電腦上隨時查到即期的重要期刊文獻，而且由於 Acrobat 溜覽器的引入，馬上可以在螢幕上看到與紙本期刊完全一樣的內容，列印出來的品質也相當真實。同時，個人資料庫的建立，也有許多好用的軟體。例如，Reference Manager 或 EndNote 可以把你所找到的文獻，自動輸入你的個人資料庫，然後在你寫論文的時候，把所引用的文獻一一插入，並且以所要發表期刊的格式自動列出 reference list。查資料時，網站的利用是極為重要的事；請把網站搜尋的本事練好，上網搜尋看似簡單，事實上需要一點尋寶的能力與經驗，隨便亂逛可找不到好東西。以下是一些有用的網站，有空請進入一覽，必能有所收穫。 ◆ 生化科學 http://biochemlinks.com/ ◆ 生物技術 http://www.accessexcellence.org/ ◆ 生物技術教育 http://www.ncbe.reading.ac.uk/ ◆ 化學連結 http://www.shef.ac.uk/~chem/chemdex/
	▲ 回原主題 ▲ TOP	XP1100a2

■ 等電點與環境的關係


	蛋白質的等電點是決定其帶電性質的重要指標。
	蛋白質的帶電性質決定於其環境的酸鹼度，當環境的 pH = 6 時，則某 pI = 5 的蛋白質將會帶負電，因為環境的 pH 高於其 pI。這幾乎是蛋白質最重要的性質，將會影響其分子構形、酵素活性，以及很多實驗上的操作，如離子交換法、電泳、等電焦集法、鹽溶等。若環境的 pH = pI，則此蛋白質的淨電荷將為零，因為沒有來自相同電荷的斥力，此種蛋白質間將會互相凝聚起來，漸漸沈澱下來。因此，有些蛋白質可以在其自身的等電點下沈澱，也是一種純化的方法；但須注意，也有些蛋白質在其 pI 下沈澱之後，就不容易再溶解回來，也會因此而損失；蔗糖合成脢就是如此。
	▲ 回原主題 ▲ TOP ■ 環境 pH 的影響	XP2410a1

■ 鹽濃度影響蛋白質溶解度


	蛋白質的溶解度，受到溶液中的酸鹼度及離子濃度影響很大。
	當溶液中的酸鹼度逐漸接近某蛋白質的等電點 (例如 5.2) 時，此蛋白質的溶解度會漸漸下降，這是因為蛋白質分子上的淨電荷漸漸趨向零，蛋白質分子之間的互斥力降低所致；此外，這個淨電荷為零的蛋白質分子上，事實上還是有數目相同的正負電荷，這些正負電荷對互相吸引也有貢獻。可以利用這種特性，來沈澱出某已知等電點的蛋白質。但若溶液中的鹽濃度漸漸提高，則蛋白質的溶解度也會提高，這是因為鹽所解析出來的大量正負離子，會阻斷上述正負電荷間的相吸，因而使得蛋白質溶入水中。當然，越遠離此蛋白質的等電點，這種溶入現象越是顯著。上面兩圖所說明的，都是這種鹽溶的性質，只是座標表現方式不同，所顯現出來的表達方式稍有不同。
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■ Like dissolves like


	近朱者赤、近墨者黑，物以類聚，不論人類或是分子皆同。
	若要分類自然界中的所有分子，可以大略分成極性及非極性兩大類。極性分子上的電子分佈不均勻，常常造成分子上某些部份的電子密度較大，因而產生偶極性，偶極會有暫時性的正負電荷產生；因此兩個極性分子相遇，可利用其偶極性的正負電荷互相吸引，會有較大的親和力。反之，非極性的分子上，其電子密度分佈較為均勻，因此不會有偶極產生，事實上非極性分子上不會帶有電荷。非極性的分子，比較喜歡與非極性的分子接近，可以看作因為無法與極性分子接近，被極性分子排斥所造成的非極性間的相互吸引力量。也可以說是分子上電子的短暫分配不均，所形成的凡得瓦爾吸引力。為何極性分子上的電子密度分佈會較不均勻？若分子內的任何兩個原子之間，其間的陰電性相差太大，例如氫 (陰電性 2.1) 與氧 (3.5)，則氫原子上的電子會被氧原子所吸引，使得氫氧附近的電子分佈不均勻。反之，碳 (2.5) 與氫 (2.1) 之間的陰電性相差較小，因此飽和碳氫化合物都是屬於極性較小的分子。陰電性是描述一個原子搶電子的能力，陰電性大者容易搶奪其相鄰原子的電子。這是與其原子構造有關，在週期表右方的原子，因為其原子核內的質子數越來越多，正電荷較大，因此吸引電子的能力也較大。因此，分子的化學性質，幾乎都可用電子的爭奪來解釋；而分子或基團的極性大小，也可解釋大半的生物化學現象。
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■ 介質粒子粗細的影響


	介質粒子越細，色析法的解析力就越佳，但流動相的流速也就越慢。
	介質粒子的大小，好像電視銀幕的解析度，粒子越小，解析力越好。粒子小可以降低粒子之間的空間，這些空間太大是降低解析力的原因之一 (見下圖)。但因為粒子塞滿了所有空間，使得溶離液流過的速度變慢；流速太慢反而會導致解析力變差。
	▲ 回原主題 ▲ TOP	XP3220d1

■ 介質粗細也影響流動


	上圖誇張管柱內粒子的大小，以說明對解析力或流速的影響。
	粒子之間的空間，是造成解析力不好的原因之一；將粒子變小，可降低此空間，也因此可增加解析力。
	▲ 回原主題 ▲ TOP	XP3220d2

■ 如何選擇介質


	若解析力差不多，儘快讓你要的蛋白質早點出來。
	通常你都可以選擇多種膠體，但經常都是優劣互見。但若無特別考量，請選擇可讓你的蛋白質早一點出來的膠體介質。當你要分別純化上圖紅色或青色兩個色帶時，你的選擇如何？實際去試試看，可能是最簡便的方法。
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■ 膠柱的裝填方法


	多練習膠柱的裝填，並注意所有預先設定的條件。
	預先算準所需要的膠體，好好平衡在指定的緩衝液，並且把該膠體及管柱，事先保存在操作的溫度下；這樣的預備工作，幾乎已經成功一半了。
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■ 管柱操作通則


	實驗之前請仔細檢討並且把握住這些條件。
	雖然理論不能替代實際操作，但若能在操作之前後都有以上的考慮，則將會使成功機率大增。其中，膠體『緊密裝填』可能是最重要的考慮因素。
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■ Donnan Effect 與 pH 變化


	離子交換介質表面的微環境會比緩衝液高或低一個 pH 單位。
	例如上左圖的陰離子交換擔體，因為本身帶有正電，因此會吸引緩衝液中的 OH^- 離子，造成擔體表面的局部高 pH。若有一樣本蛋白質的 pI 為 6，則使用 pH 為 7 的緩衝液，將使得此蛋白質帶有負電荷，可以吸附到上述陰離子交換介質。而當此樣本蛋白質吸附到擔體時，微環境的 pH 事實上是 8 (比緩衝液多一個 pH)，因此會帶更多負電，更容易吸附到介質上。因此在這種情況下，所使用的緩衝液 pH 只要比樣本蛋白質的 pI 稍高或低 1 pH 單位即可，以免吸附太強而難以溶離下來。
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■ 陰離子交換法的分離


	以二次元電泳展示粗抽取樣本中，所有蛋白質的分布情形。
	上面二次元電泳的第一次元是等電焦集法 (IEF)，第二次元是 SDS-PAGE，幾乎可以把細胞中所有的蛋白質全部分離開來，上圖只顯示出 pI < 7 的蛋白質。設若要分離一個 pI = 6 的蛋白質 (上面紅圈者)，使用 pH 7 的緩衝液，則幾乎上圖所有的蛋白質都可以吸附上去，然後再以鹽梯度一一溶離出來。上面長方形洋紅色框中的蛋白質，都會一起溶離出來，要再以其他的方法分離之。
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■ 質子的吸附或脫離


	質子的吸附或脫離，是造成生物分子帶有正或負電荷的主因。
	質子 proton 是宇宙中的奇妙粒子，這是一顆光溜溜的粒子；當氫原子丟掉一個電子後，即可得到質子，因此寫作 H⁺。質子可以隨時附著到一個帶有電子密度的基團 (如胺基)，使該基團多帶了一個正電。質子也很容易由某一個基團脫出 (如羧基)，而使該基團成為帶負電。在水環境中，質子數量的多寡就是酸鹼度的指標，會影響分子上各種基團的帶電性質。而巨分子上這些電荷性質的變化，就是生物化學裡許多反應機制的根本肇因。
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■ 溶離體積會影響解析度


	溶離體積越大，分離效果較好，但樣本濃度變稀。
	同樣 0 - 0.5 M 的 NaCl 梯度，可以因為體積不同，而拉出不太一樣的結果。上圖的總體積只有 100 mL，看起來較為陡峭，但兩個溶離峰似乎沒有分得很好；下圖體積共有 300 mL，可以分得很開，但是但樣本變得很稀 (因為要分佈在 300 mL 範圍中)。因此，似乎中央的溶離方式比較折衷，兩峰之間分開了，而且不會太稀。
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■ 拉鹽梯度的兩種方式


	離子交換法多以鹽梯度進行溶離，有兩種梯度做法。
	連續梯度需要梯度製造器 (左圖)，分別裝有高限及低限溶液，則可拉出由低到高的連續梯度。階段梯度則依序換各種濃度的緩衝液，成為樓梯般的段落，不須梯度製造器。不管用哪一種，管柱內膠面上方不可以有液體存在 (右圖)；這個多餘的體積，稱為無效空間 (dead volume)，會破壞做好的梯度。
	▲ 回原主題 ▲ TOP	XP3340b

■ 離子交換法操作要點


	離子交換操作的關鍵在於膠體是否平衡好。
	離子交換法是所有層析法中，最多樣、有效、方便的分離方法，但其機制也較為複雜且容易出錯，請把握以上各操作要點。
	▲ 回原主題 ▲ TOP	XP3340a

■ 色層焦集法圖解


	硬是把你擠到你應該停留的地方。
	大部分男生都上過成功嶺，有些女生好像也有去過；不過，以後聽說就沒有了。可惜之至，否則你可能在排隊的時候，突然體會到色層焦集法的原理。有一年某生甲第三天才去報到，全連都已經整理好隊伍了，依照高矮整齊排成一列。班長命令甲生插到隊伍中去排隊，條件是左邊的人比他高，右邊的人比他矮。甲生馬上依此條件進入隊伍，不管甲生從隊伍何處插入，只要遇到身高比他高的，他就往右移動；遇到比他矮的，就往左移，則一定能夠找到一個位置，符合班長的條件。很快地，甲生就在一個位置安定下來。而班長的資料顯示，甲生左邊的人是 169 公分，而甲生右邊的人是 167 公分，班長問也不問甲生，馬上填入甲生身高資料為 168 公分；而甲生的身高是 168.3 公分，在誤差範圍之內。色層焦集法與等電焦集法都是依如此原理運作的，兩者都可以在膠柱或膠片上預先形成一個 pH 連續梯度；而樣本分子就像甲生，在此 pH 梯度中，找到與自己 pI 相當的位置；在此位置因為 pH = pI 之故，樣本不帶有電荷而無法移動，會被焦集成一色帶，並停留在自己 pI 的位置。
	▲ 回原主題 ▲ TOP ■ 等電焦集法	XP3350a

■ 生化分子的反應基團


	細胞內的反應基團都不是很強。
	有機化學裡的強烈反應基團，通常都不會出現在一般的生物分子上。像 KCN 的強反應性物質，對大部分細胞而言根本就是劇毒。最常見的都是一些中等程度的基團，如胺基或酸基等，者兩種基團也是組成胺基酸的重要反應基團，對蛋白質的性質影響極大。雖然如此，這些中低反應性的基團，還是可以被利用來作為連接用的基團，例如胺基與酸基就可以連成胜汰鍵，是蛋白質的生合成方式。我們也可以利用這些基團，把配體耦合到擔體上去。
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■ 專一性結合力量的構成


	有兩大類力量，構成分子之間的專一性吸引力。
	一是兩個分子之間，其構形有如積木般的互補，會因為凡得瓦爾力的關係，產生專一性吸引力 (見下圖)。另一則為兩分子之間，因為某些基團間產生了二級鍵，所造成的吸引力。通常兩個分子間的專一性吸引力的形成，這兩大類力量都會有貢獻。親和性結合力量的大小，可以用解離常數來表示，一般解離常數至少在 10^-6 以上才算有足夠的親和力 (也就是說一百萬對結合分子中，只有一對會解離開來)。
	▲ 回原主題 ▲ TOP	XP3410a1

■ 構形互補的吸引力


	凡得瓦爾力是造成兩個互補平面之間產生專一性吸引力的主因。
	凡得瓦爾力是分子間微弱且短暫的吸引力，多發生在非極性的分子之間；雖然極性分子之間也會有凡得瓦爾吸引力，但其重要性則不若其它二級鍵。繞在原子最外圍的電子依一定的軌道運轉，而此電子在軌道球面上的分佈通常是均勻的。當兩個原子漸漸接近時，這兩個原子上的電子會相互影響其分佈情形；若其中一個原子的電子分佈非常短暫地發生不均勻現象，則會導致短暫的偶極性產生 (d⁺．d^-)，而這短暫的偶極性馬上誘導另一個原子上的電子，也產生電子分佈不均的現象，但偶極剛好相反 (d^-．d⁺)。這兩個相反的偶極，便可以產生極微弱且短暫的吸引力，即稱為凡得瓦爾力。凡得瓦爾力的存在太短暫，因此很容易就散掉；為了達致最大的凡得瓦爾力，兩個原子核之間，要保持在一最適距離；太近則因電子相斥而減弱，太遠則電子間的吸引力又不夠。這個最適距離，即為該原子的凡得瓦爾半徑。又因為凡得瓦爾力實在很弱，因此要集合數十個凡得瓦爾力才能發揮作用。兩個巨分子間的接面，若其上的對應原子們，每一對都能保持在凡得瓦爾半徑上，則此二巨分子便可產生相當強的親和力量；這只有當兩個巨分子間的接觸面，剛好成為積木般的互補形狀時，才能達成。這種巨分子間的親和力，造就了非常多的細胞生理特性與功能，極為重要。
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■ 例子：純化胰蛋白脢


	先洗去無法吸附的雜質，再溶離下結合在固相擔體上的物質。
	先把胰蛋白脢的抑制劑 CHOM 結合到固相擔體上，當含有胰蛋白脢的樣本 (A) 通過此擔體時，胰蛋白脢會被 CHOM 抓住，而把雜質洗掉 (B)；雜質洗乾淨之後，再以很低的 pH (2.05) 破壞其吸引力，而把胰蛋白脢溶離下來 (C & D)。因為胰蛋白脢在低 pH 下很安定，因此其活性都可以保持住，非常適用此種溶離方式。純化結果可以用電泳來檢定，比較 A 與 B 可以發現，在 B 中有些色帶不見了 (灰色箭頭)，而這些色帶卻在 C 中出現 (深藍色箭頭)，但也多出一個色帶 (淺藍色箭頭)。若把 C 的樣本，同時以 SDS-PAGE 檢定，可以發現只出現一個色帶 (洋紅色箭頭)。請解釋以上這些結果。
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■ 製備式電泳膠片


	最簡單的製備式電泳裝置，可以借用一般的電泳槽。
	製備式電泳操作通常都不會有很大問題，但要注意酵素活性的保持，以及回收率可能會偏低。有些不穩定酵素，根本不適合進行製備式電泳，要先以少量樣本試試看。市面上所推出的製備式電泳裝置很多，尤其是 Bio-Rad 公司，一直在這方面有新產品的研發。
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■ 製備式電泳操作


	製備式電泳直接把所要的蛋白質色帶切下來溶離。
	有幾個方法可以檢定蛋白質的位置： (1) Coomassie Blue 染色法; (2) 活性染色; (3) UV 照射呈像。定位後要把含有目標酵素的膠體切出來，進行電泳溶離，以收穫酵素。
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■ 超高速離心的沉降係數


	在很高的重力下，分子依照其密度的差異，會有不同的沈降速率。
	超高速離心是一種較為不同的分離方式，與層析法、電泳法等所根據的分子性質，都不很一樣；大概只有超高速離心法，是依據分子的密度來分離的。實際上，它有一個特別制定的單位叫 Svedberg unit (S)，用來描述分子的沈降性質；S 除了與分子密度有關外，也與分子量、分子形狀、組成等有關。因此，分子量大的，不一定沈到最底部，例如 RNA 的分子量一般都小於 DNA，但是因為捲繞情況比 DNA 緊密，因此其沉降係數比 DNA 高很多。另外，同一質體的三種構形 (supercoil, linear, open curcular) 雖然都有相同的分子量，但沈降速率有很大差別。
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■ 如何分離這些大小物件？


	像玩具總動員一樣來玩純化的遊戲。
	要純化或分離出某種蛋白質，就要利用蛋白質之間某些性質上的差異，例如它們的形狀、大小、比重等不同。如上圖的假想例中有 12 個物件，其大小、形狀與比重都不完全相同。若我們要分離出其中的 5 號木球，首先用一大一小兩種篩子，就可去掉 1, 2, 3 號三個較大者，以及 9, 10, 11, 12 號四個較小者。剩下的 4 - 8 號都有相同的大小，但因比重不同，在一個裝有密度梯度溶液 (如甘油梯度) 的量筒中，7 號石頭塊很塊下沈，六號棉球又無法下沈，我們因此可以在中央部份收到木質的 4, 5, 8 號物件。然後把這最後的三個物件放在一斜坡上滾下來，5 號木球會因為形狀的關係滾得最快，而 4 號因為是方塊而幾乎不動，8 號則介於兩者之間慢慢滾下來。我們因此可以分離得到 5 號木球，同時也可分得 4 號及 8 號。在實際生活裡，我們當然不會用如此笨拙的方法來分離這些東西，但其基本原理與蛋白質的分離與純化非常類似；我們的確利用蛋白質間分子量、分子形狀及密度的不同，或者分子所帶電荷不同，來作酵素的純化分離工作。
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