目 錄

酵素純化方法

酵素分析方法

問 題 集

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1 蛋白質定量法

2 酵素活性測定法

3 電泳檢定法

4 分子量決定法

5, 6, 7 其他工具 

分子消光係數

蛋白質的分子消光係數

Bradford 定量法

各種定量法的比較

精確度與準確度

酵素活性的測定

Hexokinase 的耦合反應

PC synthase 的例子

SDS 如何作用

Pulse-chase 的例子

弱酸如何成為緩衝分子？

如何導出 H-H 公式

緩衝液使用注意事項

Mercaptoethanol

DTT

細胞內外酵素分佈

各種蛋白脢

影響泳動率因素

膠體聚合反應

膠體聚合成網狀構造

古典的直立式電泳

常用的呈色方法

結果不佳十大原因

二次元電泳

免疫呈色機制

三明治免疫分析法

以 SDS-PAGE 定分子量

以膠體過濾法定分子量

製作梯度電泳膠片

胺基酸直接定序

蛋白質微量分析及檢定 F7.2

蛋白質的微量分析

蛋白質體研究

■ 分子消光係數

溶液中的分子會吸收光線中某波長的能量，吸光的多寡與溶液的濃度 c 有關。

純質分子的消光能力是其特定的性質，為一常數 E，不同的分子有不同的 E 值。

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■ 蛋白質的分子消光係數

蛋白質因為其芳香基團之故，在 280 nm 有吸光；因其骨架的 -C=O 基團，在 200 nm 有吸光。

會吸光的基團大多有電子的共振，其中最常見的是芳香族的基團，有 共軛雙鍵 (-C=C-C=C-) 的共振；每種蛋白質分子中的芳香基團含量不一，因此在 280 nm 的吸光能力就有很大差別，也因此各有不同的消光係數。

而 -C=O 基團是在 200 nm 附近有吸光，所有的蛋白質在此波長下，都有很強吸光，因為蛋白質骨架上的 -C=O 基團數量很多，而且不會因為蛋白質的胺基酸組成不同而有所差異。其精確度與準確度都很好，但因為 200 nm 波長的光線來源不穩定，而且會受到空氣中氧分子的干擾，因此較難應用。

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■ Bradford 定量法

CBG 會吸附到蛋白質分子上，並且變成藍色。 

CBG 有點像 指示劑，會在不同的酸鹼度下變色；在酸性下是茶色，在中性下為藍色。當 CBG 接到蛋白質上去的時候，因為蛋白質會提供 CBG 一個較為中性的環境，因此會變成藍色。當樣本中的蛋白質越多，吸到蛋白質上的 CBG 也多，藍色也會增強。因此，藍色的呈色強度，是與樣本中的蛋白質量成正比。

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■ 各種定量法的比較

各種蛋白質的定量方法，各有其優缺點。

靈敏度就是 精確度，是看一種分析法能夠測到的最低量；最低限越低者，表示該分析法越靈敏。 準確度是看該分析方法準不準，會不會有假反應；不該測到的出來了，該測到的卻沒測到。高準確度如 Biuret 法，通常測到的都確實是蛋白質的量，不太會有假結果；低準確度者如 280 nm 吸光的方法，因為樣本蛋白質可能因為不含芳香族基團，而完全測不到。

再來比較 280 nm 與 205 nm 兩種吸光方法，後者既 精確 又 準確，前者 不精確 又 不準確。 因為，蛋白質在 205 nm 的吸光能力非常強，而且所有蛋白質的骨架上，都含有相同比例的 -C=O 基團，不會相差太多。

有關於精確度與準確度，請看下面打靶的例子。

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■ 精確度與準確度

精確度與準確度可以用打靶的例子來說明。

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■ 酵素活性的測定

酵素活性測定的四個要點： SEPt

當設計酵素的反應時，請考慮四個重要因素，可以用 SEPt 四個字母來代表：

S (Substrate)  要使用大量基質，以便把反應推向右邊，通常是十倍的 Km。

E (Enzyme)   酵素量要適中，太高或太低都不好；但是通常酵素量都是待測值。

P (Product)    生成物要能夠方便偵測，否則要進行耦合反應，變成可測量的物質。

t (time)           反應的時間要恰當，並且固定下來；而酵素的反應速率 vo = P / t。

另外，要考慮反應溶液中的 pH 及溫度，不過這兩個因素通常也都固定。

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■ Hexokinase 的耦合反應

耦合反應可以有很多方式，能夠達到精確與準確者最好。

上面的 hexokinase，所得到的 Glc-6-P 無法直接以光度計偵測，因此要再以 Glc-6-P dehydrogenase 把 Glc-6-P 轉換成 6-P-gluconic acid，同時耦合著 NADH 的產生，NADH 的生成會造成 340 nm 吸光的變化，藉以偵測。

這個反應雖然也可以偵測基質葡萄糖的消失量，但通常都不這樣做。 因為酵素反應使用大量的基質，而要測得大量物質的小量變化，是較為不靈敏的方式。測量生成物的生成，是較為有利的；因為剛開始時，生成物的量為零，稍有一點點反應發生，即可靈敏地偵測到。 例如由 0 到 1 或 2 的變化，相當容易看到；而由 10000 變成 9999 甚至 9990，都不是極為明顯。

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■ PC synthase 的例子

不得已才使用放射性基質，同時分離反應物與生成物也相當麻煩。

Phytochelain synthase (PCS) 不得不用放射性基質 (GSH)，再測量生成物中有多少放射性 Gly；因為兩個 GSH 經 PCS 連接成 PC2 後，會放出一個 Gly 分子，而 GSH 的放射性是標示在 Gly 上面。麻煩的是，基質 GSH 與產物 PC2, Gly 都還混在一起，必須把放射性 GSH 與放射性 Gly 分開，通常都相當不易。 本案例可利用 GSH 與 Gly 在電荷性質上的差異，以離子交換介質吸附掉具有陰電性的 GSH。

更複雜的是，樣本中若有 carboxypeptidase，則會把 GSH 的 C-端 Gly 切下來，是一種假反應。

你能否以 PCS 為對象，設計一個更方便的活性分析方法？

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■ SDS 如何作用

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SDS 是一種界面活性劑，可以吸附到蛋白質的非極性區域。

原態蛋白質都有一定的分子構形 (左圖)，若加入 SDS 並且加熱，則 SDS 分子上的非極性區 (黃色尾巴)，會與蛋白質上的非極性區結合，並且使蛋白質變性，成為一線狀長條分子，上面佈滿 SDS 分子。SDS 分子的極性區 (洋紅色圓點)，則露在外面，以增加親水性。這樣的蛋白質，幾乎不會有活性；但注意有些蛋白脢在 SDS 中還具有極佳的活性，如 protease K。

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■ Pulse-chase 的例子

Pulse-chase 也是一種概念，可以應用在各種實驗的設計。

有一條透明水管，裡面有水在流，你如何能測得其流速？

若此時水管內出現一顆氣泡，看著氣泡的移動，你大概可以猜出流速；但可能不很保險，因為氣泡可能移動得較慢，也可能被卡住。若你在源頭處換到另外一種洋紅色的水，則看著洋紅色水柱的移動，你就可以準確地測量流速。事實上，洋紅色的水不須一直追加，只要有一點可以辨識位置的量，可再換回原來無色的水。把水換成洋紅色的動作，稱為 pulse；再換回無色的水稱為 chase。最常用的 pulse 是使用放射線物質。

很多實驗都可以用如此的概念來設計，以便觀察到進行中的現象，請不要忘記這個原則。

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■ 弱酸如何成為緩衝分子？

弱酸可以放出質子，也可以吸納質子，因此可以調節環境中的質子濃度。

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■ 如何導出 H-H 公式

緩衝分子的作用，與其分子上基團的解離常數 (pKa) 有密切關係。

H-H 公式的 pH 即環境所測得的酸鹼度，pKa 為該緩衝分子的解離常數再取負指數；例如醋酸的 Ka = 10^-5 (意指每十萬個醋酸分子中，有一個分子會解離，是弱酸的特性)，則此 pKa = 5。 若環境的 pH 剛好 5，則依 H-H 公式︰5 = 5 + log([A^-]/[AH])，右項 log([A^-]/[AH]) 必須為零，而 log1 = 0，即 [A^-]/[AH] = 1，即 [A^-] = [AH]。這表示在 pH = 5 時，醋酸分子的組成中，有一半是在未解離的狀態 [AH]，而另一半是已解離狀態 [A^-]。在此情形下醋酸有最大的緩衝能力，因為不管外來的 pH 如何變化，都有足夠的 [A^-] 或 [AH] 去吸附或釋出質子。以滴定法做實驗，也證實醋酸在 pH = 5 時，外加的酸或鹼都不易改變其整體酸鹼度。

因此，一種緩衝液的 緩衝範圍，與其 解離常數 有極大關係；pKa 等於 5 的弱酸，其緩衝範圍就在 4-6 之間。為何如此奇妙？ 當然利用 H-H 公式可以上面的解釋說明之，但總合起來說，還是根基於解離常數的數學遊戲，以此來描述自然現象，沒有特別神奇的地方。

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■ 緩衝液使用注意事項

緩衝液的 pH 可能受到 溫度 與 濃度 的影響。

最常用的兩種緩衝液是 Tris 及磷酸，但都有一些應該注意的地方。 Tris 受到溫度的影響非常大，應該以將要使用的 pH 為調配標準，而且配 Tris 緩衝液要用特殊的電極。 磷酸緩衝液配成高濃度的 stock solution 時，要注意在低溫下很容易結晶出來，並且稀釋使用時 pH 會有點改變。 另外，很多實驗不能用某些緩衝液；例如親和吸著劑的耦合反應中，或者你的轉印色帶要切出來進行胺基酸定序，都不能用 Tris 或其他含有胺基的物質；澱粉磷解脢的活性分析中，因為是測量所釋出的磷酸，因此也不能用磷酸緩衝液。

使用每一種緩衝液，都要詳細研究它的特性與限制，以免影響實驗結果。

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■ Mercaptoethanol

雖然可以幫助抗氧化作用，但要小心使用 b-mercaptoethanol。

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■ DTT

兩種可以抗氧化作用的添加物。

作用都類似 b-mercaptoethanol，而且不會有副作用，但價格較高。

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■ 細胞內外酵素分佈

要考慮你的酵素，是屬於那一種蛋白質。

不同的蛋白質，會有不同的處理方法。 例如，胞膜上的酵素就相當麻煩，在安定性與活性分析上，就有相當的不同；其純化方法，也與水溶性酵素有很大差異。

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■ 各種蛋白脢

依酵素的 作用機制，蛋白脢可分為四大類，各有其特點。

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■ 影響泳動率因素

影響電泳膠片中，樣本泳動率的因素很多。

內在的影響因素，主要是樣本分子的『分子量、帶電性』兩種性質。

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■ 膠體聚合反應

是一種 自由基 的 連鎖反應，把一個一個單元體連接成長鏈。

Ammonium persulfate (APS) 容易從分子中央裂解，成為對稱的兩半，平分原來的共價鍵，並形成 自由基 (上圖的紅色點代表自由基)。 此自由基開始攻擊一個 acrylamide 單元體，使後者成為自由基形式，再接續攻擊第二個單元體，因而串連起來；如此一直連接下去，即可成為長鏈巨分子。 Bis 是兩個 acrylamide 連在一起，若上述連鎖反應中含有少量 Bis，則有可能接到一個 Bis 分子，此長鏈將在此分叉，形成網狀構造 (請看下圖)。

TEMED 是催化劑，可以暫時保留自由基，以便充分供應連鎖反應所要的自由基。而有些電泳中，含有 SDS，即為 SDS-PAGE。

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■ 膠體聚合成網狀構造

膠體是一種立體的網狀構造，網目的大小會影響樣本的泳動率。

調配 acrylamide 及 Bis 的濃度，可以控制 膠體網目 的大小，也因此可以控制樣本分子的泳動率；以此來達到最佳的分離效果。 Acrylamide 的百分比較高者，其網目較小，可以分析較小的分子，通常解析力會較佳；但網目也不能太小，以免蛋白質的巨分子都跑不下來。

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■ 古典的直立式電泳

農化系生化實驗課最早所使用的 直立式柱狀 電泳槽裝置。

雖然現在商品已經有很多方便的平板電泳設備，但若能親自體驗一次早期自製的垂直式柱狀電泳，則對電泳的發展，以及電泳原理的體會，將會有更深的認識。

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■ 常用的呈色方法

每種染色方法，都有其機制與原理，以及其特定的用途。

最常用的是 Coomassie Blue R-250 以及硝酸銀染色法，可染出一般蛋白質色帶；另外，酵素化學實驗以活性染色來染 澱粉磷解脢。 在細胞生物學的研究上，自動放射呈像法 autoradiography 極為常用。

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■ 結果不佳十大原因

電泳做不好，通常有很多原因，相當複雜。

像膠體完全不能凝結這種大問題，反而比較好解決。有時看起來一切似乎都很正常，只是結果不甚漂亮，例如膠片上色帶不集中，或是色帶有拖尾或瀰散，就較難以找出真正問題。 通常，問題都發生在各種 試劑的準備，要不是濃度不對，就是 pH 有問題，或者藥品已經失效 (APS, TEMED, Bis)。 若能確定所有的藥品都沒問題，用這些藥品所配製出來的各種溶液也沒問題，則應該已經是成功一半了。

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■ 二次元電泳

二次元電泳可以分析極為複雜的樣本。

最近興起的 proteome research，都想一下子把一個細胞的所有蛋白質全部分離開來，挑選其中有意義的色點，取出來直接進行分析其成分。因此，二次元電泳變得很重要，因為它的確可以達到分離的效果。通常第一次元都用等電焦集法，第二次元用 SDS-PAGE。要把二次元電泳跑好比較困難，至少平常的電泳要跑得很好才行。

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■ 免疫呈色機制

免疫染色的基理極為單純，但有很多不同應用方式。

當樣本蛋白質被印到轉印紙之後 (上面紅色三角)，用其專一性抗體 (青色) 進行專一性辨認並結合，再用二次抗體 (綠色) 與標誌物的連結體標示 第一抗體；對這些標誌物進行檢定，如測量放射線、酵素呈色、電顯檢視等，就可以定位出抗原的位置。 

上右圖是以酵素為例，加入基質被酵素催化產生有色的不溶性生成物，並且沈澱堆積在抗原色帶的地方。常用的標誌酵素是 horse radish peroxidase (HRP) 與 alkaline phosphatase (AP)。 這些標誌酵素也可以用 螢光呈色方法，可大大提高偵測靈敏度。

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■ 以 SDS-PAGE 定分子量

生物技術核心實驗 BCT 的蛋白質純化過程結果，並以免疫呈色追蹤目標酵素 GUS。

BCT 最後一個階段是把所表現的酵素 GUS 進行純化，分別進行粗抽取 (XT)、膠體過濾 (GF)、離子交換 (IEX)、親和層析法 (AF) 等。由左邊的 Coomassie Blue 染色圖可看到 GUS 越來越純；右圖的免疫染色，都只顯現出一條主要的 GUS 色帶。結果也顯示，GUS 的單體分子量約在 70 kD 左右。

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■ 以膠體過濾法定分子量

生物技術核心實驗 BCT 以膠體過濾定出目標酵素 GUS 的原態分子量 260 kD。 

把 GUS 與標準分子量組合一起進行膠體過濾法，定出其溶離體積並與標準蛋白質比較後，內插可求出 GUS 的原態分子量為 260 kD。與上述單元體分子量 70 kD 比較，可推斷其四級構造為四元體。

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■ 製作梯度電泳膠片

梯度電泳膠片的製作相當困難，現在多有商品成品供應。

在實驗室自行製作梯度電泳膠片，需要相當的技巧與經驗，往往膠體還沒灌滿，就已經開始凝結；反之，把 APS 用量調很低，就遲遲不得凝結；即使能夠順利凝結，梯度也可能不甚均勻。 因此需要很多練習與嘗試失敗，才能有所成果。幸而現在商品多有已經預鑄好的梯度膠片，可省去很多時間與失敗經驗。但除非絕對必要，並不一定要用梯度電泳。

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■ 胺基酸直接定序

傳統胺基酸定序要製備兩套不同切點的胜汰片段。

雖然可由 cDNA 推得蛋白質的胺基酸序列，但小規模的胺基酸定序仍有其應用與重要性。即使現在的自動定序儀，也還是用 Edman degradation 來定序，只是更加自動化，並且更靈敏、準確。 最近 proteome research 的發展，更要求快速檢定電泳後蛋白質色帶的胺基酸序列。除了傳統的 Edman degradation 外，也開始用 Mass 質譜儀 來進行定序。

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■ 蛋白質微量分析及檢定 (大圖)

蛋白質得微量分離與分析系統，目的是快速得到指定蛋白質的身份。

可以把上面的各點，整理成以下四類工作：

● 微量純化系統：

(1) 電泳及轉印   (2) 二次元電泳   (3) 膠體內水解   (4) 微量分離系統

● 微量分析系統

● 生物資訊系統

● 抗體工具製備

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■ 三明治免疫分析法

這種三明治法也是一種常用的 ELISA 抗原檢定方式。

把抗體 (1) 固定在固相上，若加入的樣本中含有 抗原，則此 抗原 會被專一性地留在固相，同時洗去其它雜質；然後加入第二抗體 (2)，此抗體也會與該 抗原 有專一性結合；接著用對抗第二抗體 (2) 的二次抗體-酵素連結體 (2nd Ab-Enz) 與抗體 (2) 結合，則可測定樣本中 抗原 的量。因為只有當樣本中含有 抗原 時，第二抗體與酵素的連結體才會留在固相上；因此測定固相上所留的酵素量，即可得知樣本中的 抗原 量 (呈正比)。

此法的專一性很高，因為樣本進行了兩次專一性辨認 (抗體 1 與抗體 2)，因此背景值會很低。但是，樣本的 抗原 必須是 多價抗原，並可以誘生得兩種以上的抗體；另外，抗體 1 與抗體 2 必須來自不同動物來源，以免後來的 2nd Ab-Enz 連結體連接到抗體 1 上去。 當然，你可以直接在抗體 2 上面連接酵素，則不須 2nd Ab-Enz 連結體，但此種連結反應較難自己進行。

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■ 蛋白質的微量分析

科技的發達使得蛋白質的分析技術越來越靈敏，微量樣本即可得到所要結果。

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■ 蛋白質體研究

由基因體所衍生出來的蛋白質體，是研究細胞生理與病理的重要工具。

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