2 活性測定

2 酵素活性測定法︰
2.1 催化反應：		TOP ▲
a. 反應設計原則	大部分酵素反應方式，都可包括在圖 2.1 的大綱中；建立酵素活性測定步驟時，請注意以下原則︰ (1) 測定生成物的產生量，比測基質 (反應物) 的消失量，更方便且靈敏；儘量避免測定生成物。 (2) 反應流程儘量簡單，太複雜的操作過程，增加工作量及成本，且容易造成失誤。 (3) 複雜的反應，可能產生某些意外的生成物 (或 pH 改變)，回饋抑制酵素反應 (以負號表示)。 (4) 反應條件要有利於指定反應方向的進行，可以移除生成物 (以籃框表示)，或接上耦合反應。 (5) 小心樣本中有無其他酵素 (或抑制劑) 干擾，會因為消耗反應物或生成物，而加強或減弱目標酵素的活性，造成假象。

圖 2.1 酵素活性分析及偵測原則
b. 反應基質及酵素濃度	在試管中進行的酵素活性分析，與在生物体內的酵素反應，有相當的差距；為使反應達最大活性 (Vmax)，或往指定方向進行，所使用基質濃度為十倍 Km。反應的最適 pH、溫度、時間等條件，均需以實驗求得；尤其酵素的用量影響結果甚鉅，要事先找出最適當的使用濃度。
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2.2 酵素活性分析：		TOP ▲
酵素活性的偵測，通常是固定在一段時間 (t) 內，觀察生成物的產量 (P)。因此反應進行一定時間後需中止反應，再進行生成物的定量。而 P/t 即為此酵素的反應速率 (vo)，也就是酵素活性。但若可連續記錄反應過程，則有無中止反應並不重要。
2.2.1 酵素活性測定方法	反應一段時間 (t) 後中止反應，測生成物量 (P) 即得活性 (P/t)。以下為各種測定生成物的方法，任何物理、化學甚或生物方法都可使用。
a. 直接測定生成物	所有去氫脢均可測定 NAD⁺ 與 NADH 間的變化量，即為去氫脢的活性；例如酒精去氫脢催化下式之正反向反應： Ethanol ＋ NAD⁺ → Acetaldehyde ＋ NADH ＋ H⁺ 反應液中 NADH 在 340 nm 波長有吸光變化 (如圖 2.2)。	■ 酵素活性的測定

圖 2.2 NADH 吸光光譜
b. 耦合反應法	若生成物 (P) 無法直接測得，設法把生成物再進行耦合反應，變成可測量的產物 (Q)；很多酵素可耦合到上述去氫脢的反應，則可測 340 nm 波長變化。 S → P → Q	■ Hexokinase 的耦合反應
c. 化學測定法	若生成物具有化學活性，則可直接進行化學反應；例如蔗糖以轉化脢 (invertase, IT) 水解成果糖及葡萄糖，可測定生成物還原糖的還原力。
c. 化學測定法
d. 放射線測定法	若基質分子中含放射性核種，酵素反應後追蹤生成物的放射線量，即可知酵素活性。麻煩的是，要分離開反應物及生成物，有時不太容易；可用 HPLC、濾紙色析法 (PPC) 或離子交換法等。	■ PC synthase 的例子
e. 測壓法 (manometry)	若生成物為氣体，則可測定氣体体積之增加量；尤其有氧氣生成時，可用 Warburg 氏呼吸計測之。
f. 電極	有些電極可直接測定反應的變化；例如若有 pH 或氧濃度的改變，則可用 pH 計或氧電極。酵素電極把酵素固定在薄膜上進行反應，然後直接測定反應物的改變，相當方便；但多用在工業或醫療界有大量樣本待檢測者。
g. HPLC 檢定法	若產物無法以其他任何方便的方法檢測時，最終可用 HPLC 來分析產物，但相當費時。
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2.2.2

中止酵素反應的方法

注意任何中止反應的方法均不得破壞生成物，或干擾儀器測定。

a. 用 3-5% TCA (三氯乙酸) 改變 pH，使酵素變性沉澱，再離心去除沉澱取上清。

b. 急速加熱 (100℃水浴) 10 min，注意有些蛋白質 (如 RNase) 仍然無恙。

c. 用 1% SDS 中止反應，注意 protease K 等在 SDS 下仍有活性。

d. 若該酵素需二價離子，則加入 EDTA 中止反應。

e. 若該酵素有專一性抑制劑，則可加入抑制劑。

f. 若使用放射性基質，可加入大量不具放射性 (cold) 的基質，看來放射性的生成物不再產生，但酵素反應實際上並沒有停止。

■ SDS 如何作用

■ Pulse-chase 的例子

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2.2.3 連續測定法	連續測定法可不用刻意中止酵素反應，但通常要使用儀器同步監控生成物。
a. 連續測定法	若酵素反應，在其催化過程中可以一邊進行觀察，則可連續測定反應的情形，不須中止反應，上述酒精去氫脢即可連續監視 340 nm 波長的變化。若生成物無法直接觀測，則可接續一耦合反應，把生成物轉變為容易觀察的物質。
b. 連續的耦合反應	耦合反應在連續測定法應用相當多，但由於耦合反應更複雜，甚至成為一個迷你的代謝途徑；這種複雜的反應中有較多試劑與產物，許多不必要的副反應可能出現，干擾反應結果；要作好對照的控制組，以免有假結果出現。
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2.3 維持酵素活性：		TOP ▲
酵素是有活性的分子，而可能隨時失去活性；應該考慮各種最佳的環境與條件，以便使酵素保持在最安定的狀態。酵素的緩衝液是最關鍵的因素。
2.3.1 緩衝液	緩衝液可維持溶液的恆定酸鹼度及離子濃度，兩者都會影響酵素的活性。 ■ 弱酸如何成為緩衝分子？ ■ 如何導出 H-H 公式
a. 緩衝液有其使用範圍	各種緩衝液都有其適用的 pH 範圍，表 2.1 列出常用的緩衝液。	Serva
表 2.1 各種常用緩衝液及其使用範圍

b. 添加物都有作用	經常在緩衝液中加入一些物質，以增加酵素安定或保持活性 (表 2.2)。
表 2.2 緩衝液各種添加物質的作用及其使用濃度

c. 溫度的影響	緩衝液用來維持溶液恆定的 pH，但需注意有些緩衝液的 pH 受溫度影響很大 (如 Tris)；故製備緩衝液時，要考慮此緩衝液將要在什麼溫度下使用。	■ 緩衝液使用注意事項
d. 濃度的影響	改變緩衝液的濃度，對其 pH 可能有影響。緩衝液的種類不同，酵素活性的表現也會有差異，有些酵素甚至失去活性。圖 2.4 列出各種不同實驗情況下，緩衝液的使用濃度範圍。

圖 2.4 緩衝液使用濃度的大概範圍
e. Stock solution	緩衝液可以十倍濃度貯存，高濃度可防止微生物生長，並保持每次實驗所使用藥品的穩定度。注意在稀釋後，溶液的 pH 也許會改變一些，尤其是磷酸緩衝液很容易受到濃度改變所影響。
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2.3.2 試劑的保存	試劑的適當保存非常重要，要依照廠商所指示的溫度貯存。
a. 避免潮解	注意每當試劑由冷藏庫取出時，要等它回到室溫後才能打開，否則水氣會附在藥品的表面，進而潮解或破壞之。
b. 分裝凍藏	常用的冷藏藥品以小量分裝 (aliquot) 後凍藏，是最好的貯藏方式，尤其是溶液狀態的生物活性試劑 (如酵素)，切勿反復凍結-解凍。 ◆ 有些酵素經不起凍藏，一旦結冰後再解凍，活性快速下降。例如本實驗課所純化的澱粉磷解脢請勿凍藏，放在 4℃即可。
c. 甘油凍藏	於低溫 (-20℃) 貯藏的酵素溶液，若保存在 50% 甘油就不會凍結，隨時取用；但須注意所含的甘油，對下一步反應有無影響。
d. 避光防菌	很多試劑要避光貯存，或須放在乾燥器中，避免長霉長菌。
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2.3.3 酵素活性之維持
a. 酵素的安定性不同	酵素在細胞中合成後，有的分泌到細胞外，有的運送到細胞器官中貯存或應用。前者 (分泌性酵素) 因為要在細胞外的惡劣環境中生存，因此較為堅韌，不易受到破壞；反之，細胞內的酵素，都以較濃的濃度集中在保護良好的胞器內或胞膜上，一但抽離細胞暴露在氧氣中，可能很容易失去活性。	■ 細胞內外酵素分佈
b. 酵素失活的原因	可歸類成如下的物理性或化學性原因。 (1) 蛋白質變性：離開細胞的生理環境後，蛋白質可能遇到極端的 pH 條件、不適的溫度或變性劑 (如 SDS 或尿素)，均會使蛋白質的構形破壞。 (2) 酵素活性區破壞：在抽取過程中，若失去 cofactor，或者活性區的關鍵胺基酸被修飾，均可造成。最常見的影響是氧化，尤其是 cysteine 上的 -SH 基很容易被氧化。一般加入 EDTA 除去可活化氧分子的二價離子；或加入抗氧化劑，以自身氧化防止 -SH 基氧化。 (3) 蛋白脢水解：細胞內有許多蛋白脢，細胞被打破後即釋放到酵素溶液中，很快水解酵素。可用蛋白脢的抑制劑防止之，但蛋白脢有數大類，各有不同類的抑制劑；一般使用 PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) 是 Ser 型蛋白脢的抑制劑，但也抑制部分其它類型者；PMSF 在水溶液中很快就會降解。 (4) 酵素抑制劑：在自然界中或以人工合成，發現許多酵素有抑制劑，可以專一性地抑制酵素活性；有可逆性的，也有不可逆的，通常不可逆抑制劑的效果都很強烈。	■ 各種蛋白脢
c. 如何保持活性	若酵素不太穩定，活性不易保持，請參考下列處理方式： (1) 儘快進行純化及各項分析，隨時保持在 4℃或冰浴中。 (2) 讓酵素保存在硫酸銨固体沉澱中，要比溶液狀態安定得多。 (3) 勿讓高純度的酵素，保存在稀濃度溶液中，否則要加 BSA 當安定劑。 (4) 勿隨意凍結或解凍酵素液，可加防凍劑 (如甘油或醣類) 以液態保存。 (5) 冷凍乾燥雖可長期保存酵素，但有些酵素活性可能會因而下降。 (6) 若容易受微生物污染，可經無菌過濾後保存 (當然也會損失一些酵素)。
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2.3.4

酵素活性單位

活性單位 (activity unit) 是酵素活性高低的指標。一個活性單位的定義，是在固定溫及 pH 下，每分鐘可催化 1 mmole 基質的活性。但很多情況下，為了操作或計算的方便，直接用測定產物所得的吸光值，除以單位時間來表示活性，因此活性單位的定義可能不同。有關酵素活性及其基本背景，請複習生物化學中的酵素章節；你在大學所念到的酵素知識，在研究所還是完全適用。

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2.2.4 澱粉磷解脢活性分析	以澱粉磷解脢為範例，說明如何以生物化學方法偵測到其活性。
a. 澱粉磷解反應	注意磷解不是水解，此反應為可逆 (Pi 為無機磷)： (Glc)_n-Glc + Pi → (Glc)_n + Glc-1-P (磷解方向) (Glc)_n + Glc-1-P → (Glc)_n-Glc + Pi (合成方向) 合成方向反應可測無機磷 (Pi) 生成，而 Pi 的檢定有方便的化學呈色反應。反之，磷解方向應如何設計方便的活性分析方法？

圖 2.3 澱粉磷解脢的活性分析及干擾因子
b. 澱粉鏈延長	澱粉磷解脢以可溶性澱粉作為引子 (primer)，催化 Glc-1-P 連接到引子上，成為較長的直鏈澱粉 (amylose)，可用碘液呈色觀察。在原態電泳膠片，澱粉磷解脢活性可用此法染色，直接在膠片上看到酵素活性 (如圖 2.3 A)。	◇ 引子是一小段澱粉分子
c. 小心其它干擾物質	澱粉磷解脢的兩種基質很容易受到其它酵素的作用：可溶性澱粉受到 b-amylase (BA) 澱粉脢快速水解，澱粉磷解脢活性被抑制；Glc-1-P 受 phosphatase (Ph) 磷酸脢的水解，產生游離的磷酸，會誤判為澱粉磷解脢的活性 (圖 2.3 B)。
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