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酵素純化方法

酵素分析方法

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1 蛋白質定量法

2 酵素活性測定法

3 電泳檢定法

4 分子量決定法

5, 6, 7 其他工具 

     

4.1  膠体過濾法

4.2  梯度電泳法

4.3  其他分子量測定方法

   4.3.1  超高速離心法

    4.3.2  由胺基酸序列計算分子量

    4.3.3  質譜儀分析

 

蛋白質構造分析

免疫學工具

蛋白質科技

 

  4  分子量決定法

分子量是蛋白質的重要性質之一,有許多種測定法,最好用數個方法相互佐證。

 4.1  膠体過濾法

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a. 分子構形的影響:

膠体過濾法 是依 分子体積 的大小來進行分離,因此若兩種蛋白質的分子量相同,構形較為鬆散者將會提早溶離出來,表現出較高的分子量。

  以膠體過濾法定分子量

b. 標準蛋白質 (molecular weight marker)

膠体過濾法需先用已知分子量的標準蛋白質進行層析,求出標準校正線,再以內插法求得樣本的分子量。 近來商品供應有標準分子量的蛋白質混合液,使用上較方便。標準蛋白質 的取用參考 (kD):

Thyroglobulin (669, 330); ferritin (440); catalase (232); immunoglobulin G (160); lactate dehydrogenase (140); serum albumin (67); ovalbumin (43); lactalbumin (14.4)

  Molecular weight 沒有單位,而 molecular mass 才有 Dalton (D) 的單位

c. 特殊樣本的偵測

若樣本或標準品蛋白質,能以專一性的活性分析來定位,或有特殊波長的吸光 (如 peroxidase 在 405 nm 有 heme 吸光),則更方便而確實。

 

d. Blue Dextran 2000

是一種 藍色 高分子聚醣 (分子質量約 2,000 kD),無法進入膠体孔內,會在 void volume (Vo) 溶離出來;其藍色可用來檢查管柱的裝填是否完善。 Blue Dextran 對蛋白質有相當強的吸附性,不要與樣本混合在一起進行膠体過濾。 溶離緩衝的液離子濃度要保持在 0.1-0.2 M (添加NaCl),以克服膠体介質對蛋白質的吸附力。

 

e. 管柱條件要保持琠w

(1) 以膠体過濾法測定蛋白質的分子量時,連同標準品及樣本蛋白質,前後要做數次管柱操作。 在這期間管柱的操作條件要保持恆定,不宜中途重新裝填,因膠体的 Vo 可能會改變

(2) 以 HPLC FPLC 型的膠体過濾法進行分子量測定,可省去很多時間,而且準確,是最佳的選擇

 

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 4.2  梯度電泳法

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a. 原態或變性

梯度電泳 又可分為 disc-PAGE 及 SDS-PAGE。 SDS-PAGE 雖然是測定變性蛋白質的次体分子量,但若緩和樣本處理時的變性條件,則亦有可能看到多元体分子。

製作梯度電泳膠片 

b. 樣本 等電點 的影響

原態梯度電泳雖然是依樣本分子量的差異來進行分離,但若蛋白質分子不帶淨電荷,甚或因 pI 太高而帶相反電荷,則梯度 disc-PAGE 法並不適用。 梯度 SDS-PAGE 則無電荷上的問題,結果較為可靠。

以 SDS-PAGE 定分子量

c. 標準蛋白質 (marker)

梯度電泳也跟膠体過濾一樣,要與 標準分子量 的蛋白質比較, 才能定出樣本的分子量。 但因電泳的解析力較佳,故可把所有的標準蛋白質混合起來,一起進行電泳,在同一塊膠片上比較。

  

d. 結果判定

我們以梯度 disc-PAGE 定原態分子量,對 pI 較低的蛋白質 (4-6 之間),確實有相當高的準確度,但最好再用膠体過濾法確認。 進行梯度電泳時,要比一般電泳多跑一些時間,染料跑出去也無妨,因為蛋白質會卡在較密的膠体中,更增加解析力。但在正式論文中,請不要以膠體電泳法做為檢定分子量的唯一依據,也避免把標準分子量標在膠片上,以免引起爭議

 

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 4.3  其他分子量測定方法

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4.3.1

超高速離心法

 
 

a. 沉降係數 巨分子在密度梯度的介質中進行超高速離心時,其沉降速率 (S) 分子量分子密度 分子形狀 有關,因此可用來測定分子量

超高速離心的沉降係數

 

b. 超高速離心法也可做為一種酵素製備方法,在 酵素純化方法 中有詳細說明

 

4.3.2

由胺基酸序列

計算分子量

 

 

a. 許多蛋白質已可得知其核酸 (cDNA) 序列,由此可推得其胺基酸序列,以電腦計算得此胺基酸序列的分子量,即為該蛋白質的分子量

 

 

b. 注意若此蛋白質為醣蛋白,或有其它修飾基團 (),則實際分子量應該會更大些;但若有 轉譯後修飾 (post-translational modification),則分子量又會小些

 

4.3.3

質譜儀分析

質譜儀 可偵測各種不同大小質量的分子,故可以用來測定蛋白質的分子量;對較短的蛋白質甚至可以決定其胺基酸的序列,後者仍在開發階段,漸趨成熟   介紹課程 生物質譜學』  論文 Mass Spectrometry: An Essential Tool in Proteome Analysis (Plant Physiol, 2000)

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本網頁最近修訂日期: 2002/07/26