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1 蛋白質定量法 |
2 酵素活性測定法 |
3 電泳檢定法 |
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5, 6, 7 其他工具 |
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4.1 膠体過濾法 4.2 梯度電泳法 4.3 其他分子量測定方法 4.3.1 超高速離心法 4.3.2 由胺基酸序列計算分子量 4.3.3 質譜儀分析
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5 蛋白質構造分析 6 免疫學工具 7 蛋白質科技
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4 分子量決定法︰ |
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分子量是蛋白質的重要性質之一，有許多種測定法，最好用數個方法相互佐證。 |
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4.1 膠体過濾法： |
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a. 分子構形的影響： |
膠体過濾法 是依 分子体積 的大小來進行分離，因此若兩種蛋白質的分子量相同，構形較為鬆散者將會提早溶離出來，表現出較高的分子量。 |
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b. 標準蛋白質 (molecular weight marker) |
膠体過濾法需先用已知分子量的標準蛋白質進行層析，求出標準校正線，再以內插法求得樣本的分子量。 近來商品供應有標準分子量的蛋白質混合液，使用上較方便。標準蛋白質 的取用參考 (kD)： Thyroglobulin (669, 330); ferritin (440); catalase (232); immunoglobulin G (160); lactate dehydrogenase (140); serum albumin (67); ovalbumin (43); lactalbumin (14.4) |
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c. 特殊樣本的偵測 |
若樣本或標準品蛋白質，能以專一性的活性分析來定位，或有特殊波長的吸光 (如 peroxidase 在 405 nm 有 heme 吸光)，則更方便而確實。 |
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d. Blue Dextran 2000 |
是一種 藍色 高分子聚醣 (分子質量約 2,000 kD)，無法進入膠体孔內，會在 void volume (Vo) 溶離出來；其藍色可用來檢查管柱的裝填是否完善。 Blue Dextran 對蛋白質有相當強的吸附性，不要與樣本混合在一起進行膠体過濾。 溶離緩衝的液離子濃度要保持在 0.1-0.2 M (添加NaCl)，以克服膠体介質對蛋白質的吸附力。 |
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e. 管柱條件要保持恒定 |
(1) 以膠体過濾法測定蛋白質的分子量時，連同標準品及樣本蛋白質，前後要做數次管柱操作。 在這期間管柱的操作條件要保持恆定，不宜中途重新裝填，因膠体的 Vo 可能會改變。 |
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4.2 梯度電泳法： |
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a. 原態或變性 |
梯度電泳 又可分為 disc-PAGE 及 SDS-PAGE。 SDS-PAGE 雖然是測定變性蛋白質的次体分子量，但若緩和樣本處理時的變性條件，則亦有可能看到多元体分子。 |
■ 製作梯度電泳膠片 |
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b. 樣本 等電點 的影響 |
原態梯度電泳雖然是依樣本分子量的差異來進行分離，但若蛋白質分子不帶淨電荷，甚或因 pI 太高而帶相反電荷，則梯度 disc-PAGE 法並不適用。 梯度 SDS-PAGE 則無電荷上的問題，結果較為可靠。 |
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c. 標準蛋白質 (marker) |
梯度電泳也跟膠体過濾一樣，要與 標準分子量 的蛋白質比較， 才能定出樣本的分子量。 但因電泳的解析力較佳，故可把所有的標準蛋白質混合起來，一起進行電泳，在同一塊膠片上比較。 |
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d. 結果判定 |
我們以梯度 disc-PAGE 定原態分子量，對 pI 較低的蛋白質 (4-6 之間)，確實有相當高的準確度，但最好再用膠体過濾法確認。 進行梯度電泳時，要比一般電泳多跑一些時間，染料跑出去也無妨，因為蛋白質會卡在較密的膠体中，更增加解析力。但在正式論文中，請不要以膠體電泳法做為檢定分子量的唯一依據，也避免把標準分子量標在膠片上，以免引起爭議。 |
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4.3 其他分子量測定方法： |
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超高速離心法 |
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a. 沉降係數： 巨分子在密度梯度的介質中進行超高速離心時，其沉降速率 (S) 與 分子量、分子密度 與 分子形狀 有關，因此可用來測定分子量。 |
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b. 超高速離心法也可做為一種酵素製備方法，在 酵素純化方法 中有詳細說明。 |
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由胺基酸序列 計算分子量 |
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a. 許多蛋白質已可得知其核酸 (cDNA) 序列，由此可推得其胺基酸序列，以電腦計算得此胺基酸序列的分子量，即為該蛋白質的分子量。 |
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b. 注意若此蛋白質為醣蛋白，或有其它修飾基團 (輔脢)，則實際分子量應該會更大些；但若有 轉譯後修飾 (post-translational modification)，則分子量又會小些。 |
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質譜儀分析 |
質譜儀 可偵測各種不同大小質量的分子，故可以用來測定蛋白質的分子量；對較短的蛋白質甚至可以決定其胺基酸的序列，後者仍在開發階段，漸趨成熟。 ◆ 介紹課程 『生物質譜學』 ◆ 論文 Mass Spectrometry: An Essential Tool in Proteome Analysis (Plant Physiol, 2000) |
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本網頁最近修訂日期： 2002/07/26