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酵素純化方法

酵素分析方法

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1 蛋白質定量法

2 酵素活性測定法

3 電泳檢定法

4 分子量決定法

5, 6, 7 其他工具 

     

蛋白質構造與組成分析: 

5.1  N-端或 C-端胺基酸決定

5.2  胺基酸組成分析

5.3  胺基酸定序法

  5.3.1  cDNA 間推法

   5.3.2  Edman 直接定序法

5.4  胜汰圖譜

   5.4.1  蛋白質的專一性水解

   5.4.2  檢定胜汰群的方法

5.5  其他相關方法

   5.5.1  分子消光係數

   5.5.2  蛋白質分子結構分析

6  免疫學工具的利用 

7  蛋白質科技

 

  5  蛋白質構造與組成分析

以下的檢定方法,需要純度極高的蛋白質,因此最好在一般的層析法純化後,再以製備式電泳得到均質蛋白質。 其中很多反應會與胺基反應,因此樣本中不能含有具胺基的物質 ( Tris 或其它胺基酸),以免干擾反應。 

 5.1  N-端或 C-端胺基酸決定

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現在已經很少只是測定 N-端,通常都直接去定序。

 

a. 一般蛋白質都有固定的 N-端及 C-端,N-端胺基酸可使用 dansylation 標以 dansyl 基團,再以 HCl 水解蛋白質。 除了 dansylation 之外,尚有許多類似的反應可用來檢定 N-端胺基酸 ( 5.1)。

 

 

圖 5.1 以 dansylation 檢定 N-端

 

b. 水解所得的游離胺基酸以 polyamide (TLC plate) 進行 雙向薄層層析 分離,標有 dansyl 的胺基酸在 UV 光下會發出螢光,與已知的 20 dansyl 胺基酸比較,即可推判;亦可用 HPLC 分離胺基酸

 

 

c. 有些蛋白質的 N-端胺基可能經 乙醯化 或其它修飾而阻礙 (blocked),無法進行反應,尤以植物來源的蛋白質為甚;遇此情形,可能要分出胜汰片段來定序,或者以化學反應去除此一修飾

 
 

d. 有些蛋白質含有數條胜汰鏈,由 雙硫鍵 連接起來 (chymotrypsin),因此會有數個 N-端胺基酸。 則要先打斷雙硫鍵,把游離的各段胜汰分開後,再行定序

 
 

e. C-端可用 外切 carboxylpeptidase 一個一個切下來,再進行胺基酸測定,由胺基酸出現的多寡順序,即可得知 C-端序列;但因水解反應不好控制,較不常用

 

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 5.2  胺基酸組成分析

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a. 蛋白質以 6N HCl 4N methanesulfonic acid 在真空 110℃下水解 24 h,水解液以離子交換 HPLC 分開各種胺基酸並分別測定其含量,可得知各胺基酸的百分組成

  

 

b. 由胺基酸百分組成的異同,即可比較兩種蛋白質的相似性,並得知蛋白質構造的性質與特徵。 例如有一種鎘結合蛋白 metallothionein 含有很高量的 Cys,便是以 Cys 與鎘結合

 
 

c. 使用 HCl 水解蛋白質會破壞 tryptophan,並且使 glutamine asparagine 失去胺基,成為 glutamic acid (合稱 Glx) aspartic acid (合稱 Asx),分析時要注意這些事實。同時,樣本及緩衝液中要避免太多胺基的物質 ( Tris),以免干擾 HPLC 分析

  

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 5.3  胺基酸定序法

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胺基酸序列是一個蛋白質最重要而基本的資訊,有兩種方法可求得胺基酸序列。

5.3.1

cDNA 間推法

由蛋白質基因的核甘酸序列,可推得其胺基酸序列,是目前最常用的定序方法 (reverse biochemistry) 此基因一般選殖自 cDNA 庫,在經過群殖、定序等工作,轉譯成蛋白質的胺基酸序列後,就可進行系統性的分析工作;通常以 電腦程式 搜尋比對,例如 PC/GENE (個人電腦用) GCG (工作站) 比較重要或常見的分析項目如下:

a. 序列鑑定

若為未知蛋白質,則進入蛋白質資料庫 (Swiss-Prot) 搜尋,與已知的序列比對;可得知你的蛋白質是已經被發現的,或是一個新的蛋白質。 通常都可比對得類似的蛋白質序列,則可推知此未知蛋白質的可能功能。

 

b. 二級構造分析

由一級胺基酸序列,可預測其二級構造,推得構造與生理功能上的關係。通常三級立体構造無法精確預測,除非有一個已知構造的類似蛋白質可供參考。

 

c. 功能序列分析

許多特定的胺基酸片段,有特定的生理功能,稱為 signature。若能找到某些功能序列,可推測此蛋白質的可能生理角色。 例舉 signature 如:各種進入胞器序列、PEST 降解序列、內質網回收序列 (KDEL) 等。

 

d. 一般性質分析

由胺基酸序列可推出此蛋白質的等電點、分子量、抗原決定基片段、各種蛋白脢的水解點等有用資料。

 

5.3.2

Edman 直接定序法

一個一個把胺基酸切下來直接定出其種類

a. Edman 反應

類似 dansylation N-端標示反應,但是使用 PITC (phenylisothiocyanate) 在蛋白質的 N-端進行修飾反應,生成 PTH 衍生物;Edman 反應後的 N-端胺基酸可以被切下來,以 HPLC 檢定為何種胺基酸。 剩餘的蛋白質部份可以繼續第二輪 Edman 反應,通常可進行二、三十個循環 ( 5.2)

 

 

圖 5.2  Edman degradation

b. 自動定序

目前都以 自動定序儀 進行,並且把樣本蛋白質固定在薄膜上,更為方便靈敏。 可在電泳後轉印到纖維紙上,切出所要的色帶,直接上機定序。最近也開始利用 質譜儀 直接定序,相當快速。

Applied Biosystem

c. 定序之前的基本資料

(1) 檢查蛋白質的分子量及四級構造,若有異質多元体,要先分出均質單元体

(2) 若有分子內或分子間 雙硫鍵 連結,應先還原之,以解開三級構造

(3) 有無碳水化合物、脂質等修飾物質,或具有 prosthetic group

(4) 分子量太大的蛋白質應如何切成小片,並分離得各胜汰片段,分別定序。

 

d. 直接定序的問題

(1) 蛋白質要先切成胜汰

由於定序只能進行二、三十個循環,而蛋白質通常有數百個胺基酸之多,因此長條蛋白質要先切成許多小片段,分離出各個小片段後再進行定序。

(2) 要用兩套胜汰比對

但定出各獨立片段的序列後,無法得知各片段之先後次序關係。因此要以兩種不同專一性的蛋白脢,製作兩組不同的小片段,兩組的切點不同,以便在分別定序後互相比對重疊部份,找出兩片段的連接點 (見下節)

胺基酸直接定序

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 5.4  圖譜

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a. 專一性蛋白脢

可對蛋白質的特定胺基酸進行水解,得到一群不同長短的胜汰片段。  兩個不同蛋白質經同一蛋白脢水解,所得的兩胜汰群,其胜鏈數目、各段胜汰的胺基酸組成與長短均不相同,可鑑定此二蛋白質的相似程度。 反之,不同專一性的蛋白脢會切在不同的胺基酸上,對同一蛋白質會切出不同的胜汰圖譜 (如下圖 5.3)。

 

b. 快速得知蛋白質的部分序列

由於細胞生物學的蓬勃發展,對未知蛋白質的探索激增,研究人員多使用胜定序的方法,快速檢定目標蛋白質的身份;或可定出未知蛋白質的一段胺基酸序列,反譯為核酸序列做為群殖的探針;或合成人工胜進行單專一性抗体的製備。 以下的流程可作為一般的例子:

 

 

5.4.1

蛋白質的專一性水解

樣本蛋白質要先經變性處理,把胜開,才能以蛋白水解之。

圖 5.3  以兩種蛋白脢水解同一蛋白質

a. 專一性內切脢

例舉如下:

Trypsin (Lys, Arg);   

Chymotrypsin (Phe, Tyr, Trp);

Sa protease (Asp, Glu)

 

b. 化學反應法

CNBr (Met)

 

5.4.2

檢定胜群的方法

最近由於微量定量方法的進步,以下方法除了可以分離出胜汰片段外,也可以收集各分劃或剪出色帶,送自動定序分析,是很重要的分離檢定技術。

a. 電泳/層析雙向圖譜

胜汰片段先經高電壓濾紙電泳後,轉九十度再進行濾紙層析,則可分出各個胜汰片段;也可使用薄層層析,比較方便、快速;這是標準的方法。

 

b. HPLC

利用 HPLC 的高解析力,快速分離各段胜汰,多使用反相層析管柱。

 

c. SDS-PAGE

由完全水解所切得的胜汰片段,可以 SDS-PAGE 來分析;電泳後也可進行轉印,再用抗体做免疫染色。

 

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 5.5  其他相關方法

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5.5.1

分子消光係數

若有均質的酵素,則可將已知吸光度 (280 nm) 的液体樣本,經冷凍乾燥後求其蛋白質的乾重,推得 分子消光係數,以做為蛋白質定量的依據。 請參考前文 1.3 ,利用分子消光係數來定量蛋白質的方法。

 

5.5.2

蛋白質分子結構分析

 

 

 

a.  X 光繞射分析是探討蛋白質分子結構的最根本方法,但須先做出蛋白質結晶,對大分子蛋白質而言相當不易。 近來多以分子選殖方法,以表現蛋白質進行結晶繞射分析

 

 

b. 使用溶液狀態的蛋白質進行 NMR (核磁共振) 分析,可得溶液狀態的分子構造。但因為需要大量電腦運算,分子量過大者不易處理

 

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本網頁最近修訂日期: 2003/05/23