5 構造分析

酵素純化方法

酵素分析方法

1 蛋白質定量法

2 酵素活性測定法

3 電泳檢定法

4 分子量決定法

5, 6, 7 其他工具

　

　

　

5 蛋白質構造與組成分析：

5.1 N-端或 C-端胺基酸決定

5.2 胺基酸組成分析

5.3 胺基酸定序法

5.3.1 cDNA 間推法

5.3.2 Edman 直接定序法

5.4 胜汰圖譜

5.4.1 蛋白質的專一性水解

5.4.2 檢定胜汰群的方法

5.5 其他相關方法

5.5.1 分子消光係數

5.5.2 蛋白質分子結構分析

6 免疫學工具的利用

7 蛋白質科技

　

5 蛋白質構造與組成分析︰
以下的檢定方法，需要純度極高的蛋白質，因此最好在一般的層析法純化後，再以製備式電泳得到均質蛋白質。其中很多反應會與胺基反應，因此樣本中不能含有具胺基的物質 (如 Tris 或其它胺基酸)，以免干擾反應。
5.1 N-端或 C-端胺基酸決定：		TOP ▲
現在已經很少只是測定 N-端，通常都直接去定序。
	a. 一般蛋白質都有固定的 N-端及 C-端，N-端胺基酸可使用 dansylation 標以 dansyl 基團，再以 HCl 水解蛋白質。除了 dansylation 之外，尚有許多類似的反應可用來檢定 N-端胺基酸 (圖 5.1)。

圖 5.1 以 dansylation 檢定 N-端
	b. 水解所得的游離胺基酸以 polyamide (TLC plate) 進行雙向薄層層析分離，標有 dansyl 的胺基酸在 UV 光下會發出螢光，與已知的 20 種 dansyl 胺基酸比較，即可推判；亦可用 HPLC 分離胺基酸。
	c. 有些蛋白質的 N-端胺基可能經乙醯化或其它修飾而阻礙 (blocked)，無法進行反應，尤以植物來源的蛋白質為甚；遇此情形，可能要分出胜汰片段來定序，或者以化學反應去除此一修飾。
	d. 有些蛋白質含有數條胜汰鏈，由雙硫鍵連接起來 (如 chymotrypsin)，因此會有數個 N-端胺基酸。則要先打斷雙硫鍵，把游離的各段胜汰分開後，再行定序。
	e. C-端可用外切脢 carboxylpeptidase 一個一個切下來，再進行胺基酸測定，由胺基酸出現的多寡順序，即可得知 C-端序列；但因水解反應不好控制，較不常用。
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5.2 胺基酸組成分析：		TOP ▲
	a. 蛋白質以 6N HCl 或 4N methanesulfonic acid 在真空 110℃下水解 24 h，水解液以離子交換 HPLC 分開各種胺基酸並分別測定其含量，可得知各胺基酸的百分組成。
	b. 由胺基酸百分組成的異同，即可比較兩種蛋白質的相似性，並得知蛋白質構造的性質與特徵。例如有一種鎘結合蛋白 metallothionein 含有很高量的 Cys，便是以 Cys 與鎘結合。
	c. 使用 HCl 水解蛋白質會破壞 tryptophan，並且使 glutamine 及 asparagine 失去胺基，成為 glutamic acid (合稱 Glx) 及 aspartic acid (合稱 Asx)，分析時要注意這些事實。同時，樣本及緩衝液中要避免太多胺基的物質 (如 Tris)，以免干擾 HPLC 分析。
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5.3 胺基酸定序法：		TOP ▲
胺基酸序列是一個蛋白質最重要而基本的資訊，有兩種方法可求得胺基酸序列。
5.3.1 cDNA 間推法	由蛋白質基因的核甘酸序列，可推得其胺基酸序列，是目前最常用的定序方法 (reverse biochemistry)。此基因一般選殖自 cDNA 庫，在經過群殖、定序等工作，轉譯成蛋白質的胺基酸序列後，就可進行系統性的分析工作；通常以電腦程式搜尋比對，例如 PC/GENE (個人電腦用) 或 GCG (工作站)。比較重要或常見的分析項目如下：
a. 序列鑑定	若為未知蛋白質，則進入蛋白質資料庫 (Swiss-Prot) 搜尋，與已知的序列比對；可得知你的蛋白質是已經被發現的，或是一個新的蛋白質。通常都可比對得類似的蛋白質序列，則可推知此未知蛋白質的可能功能。
b. 二級構造分析	由一級胺基酸序列，可預測其二級構造，推得構造與生理功能上的關係。通常三級立体構造無法精確預測，除非有一個已知構造的類似蛋白質可供參考。
c. 功能序列分析	許多特定的胺基酸片段，有特定的生理功能，稱為 signature。若能找到某些功能序列，可推測此蛋白質的可能生理角色。例舉 signature 如：各種進入胞器序列、PEST 降解序列、內質網回收序列 (KDEL) 等。
d. 一般性質分析	由胺基酸序列可推出此蛋白質的等電點、分子量、抗原決定基片段、各種蛋白脢的水解點等有用資料。

5.3.2 Edman 直接定序法	一個一個把胺基酸切下來直接定出其種類。
a. Edman 反應	類似 dansylation 的 N-端標示反應，但是使用 PITC (phenylisothiocyanate) 在蛋白質的 N-端進行修飾反應，生成 PTH 衍生物；Edman 反應後的 N-端胺基酸可以被切下來，以 HPLC 檢定為何種胺基酸。剩餘的蛋白質部份可以繼續第二輪 Edman 反應，通常可進行二、三十個循環 (圖 5.2)。

圖 5.2 Edman degradation
b. 自動定序	目前都以自動定序儀進行，並且把樣本蛋白質固定在薄膜上，更為方便靈敏。可在電泳後轉印到纖維紙上，切出所要的色帶，直接上機定序。最近也開始利用質譜儀直接定序，相當快速。	◆Applied Biosystem
c. 定序之前的基本資料	(1) 檢查蛋白質的分子量及四級構造，若有異質多元体，要先分出均質單元体。 (2) 若有分子內或分子間雙硫鍵連結，應先還原之，以解開三級構造。 (3) 有無碳水化合物、脂質等修飾物質，或具有 prosthetic group。 (4) 分子量太大的蛋白質應如何切成小片段，並分離得各胜汰片段，分別定序。
d. 直接定序的問題	(1) 蛋白質要先切成胜汰：由於定序只能進行二、三十個循環，而蛋白質通常有數百個胺基酸之多，因此長條蛋白質要先切成許多小片段，分離出各個小片段後再進行定序。 (2) 要用兩套胜汰比對：但定出各獨立片段的序列後，無法得知各片段之先後次序關係。因此要以兩種不同專一性的蛋白脢，製作兩組不同的小片段，兩組的切點不同，以便在分別定序後互相比對重疊部份，找出兩片段的連接點 (見下節)。	■ 胺基酸直接定序
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5.4 胜汰圖譜：		TOP ▲
a. 專一性蛋白脢	可對蛋白質的特定胺基酸進行水解，得到一群不同長短的胜汰片段。兩個不同蛋白質經同一蛋白脢水解，所得的兩胜汰群，其胜鏈數目、各段胜汰的胺基酸組成與長短均不相同，可鑑定此二蛋白質的相似程度。反之，不同專一性的蛋白脢會切在不同的胺基酸上，對同一蛋白質會切出不同的胜汰圖譜 (如下圖 5.3)。
b. 快速得知蛋白質的部分序列	由於細胞生物學的蓬勃發展，對未知蛋白質的探索激增，研究人員多使用胜汰定序的方法，快速檢定目標蛋白質的身份；或可定出未知蛋白質的一段胺基酸序列，反譯為核酸序列做為群殖的探針；或合成人工胜汰進行單專一性抗体的製備。以下的流程可作為一般的例子：


5.4.1 蛋白質的專一性水解	樣本蛋白質要先經變性處理，把胜汰鍵解開，才能以蛋白脢水解之。

圖 5.3 以兩種蛋白脢水解同一蛋白質
a. 專一性內切脢	例舉如下： Trypsin (Lys, Arg); Chymotrypsin (Phe, Tyr, Trp); Sa protease (Asp, Glu)
b. 化學反應法	CNBr (Met)
5.4.2 檢定胜汰群的方法	最近由於微量定量方法的進步，以下方法除了可以分離出胜汰片段外，也可以收集各分劃或剪出色帶，送自動定序分析，是很重要的分離檢定技術。
a. 電泳/層析雙向圖譜	胜汰片段先經高電壓濾紙電泳後，轉九十度再進行濾紙層析，則可分出各個胜汰片段；也可使用薄層層析，比較方便、快速；這是標準的方法。
b. HPLC	利用 HPLC 的高解析力，快速分離各段胜汰，多使用反相層析管柱。
c. SDS-PAGE	由完全水解所切得的胜汰片段，可以 SDS-PAGE 來分析；電泳後也可進行轉印，再用抗体做免疫染色。

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5.5 其他相關方法：		TOP ▲
5.5.1 分子消光係數	若有均質的酵素，則可將已知吸光度 (280 nm) 的液体樣本，經冷凍乾燥後求其蛋白質的乾重，推得分子消光係數，以做為蛋白質定量的依據。請參考前文 1.3 節，利用分子消光係數來定量蛋白質的方法。

5.5.2 蛋白質分子結構分析
	a. X 光繞射分析是探討蛋白質分子結構的最根本方法，但須先做出蛋白質結晶，對大分子蛋白質而言相當不易。近來多以分子選殖方法，以表現蛋白質進行結晶繞射分析。
	b. 使用溶液狀態的蛋白質進行 NMR (核磁共振) 分析，可得溶液狀態的分子構造。但因為需要大量電腦運算，分子量過大者不易處理。
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酵素純化方法

酵素分析方法

1 蛋白質定量法

2 酵素活性測定法

3 電泳檢定法

4 分子量決定法

5, 6, 7 其他工具

　

　

　

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6 免疫學工具的利用

7 蛋白質科技

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本網頁最近修訂日期： 2003/05/23