1  蛋白質定量法︰

請注意以下三點蛋白質定量的基本問題。      

a. 蛋白質量與酵素活性不一定成正比

酵素是一種蛋白質，因此測定純質酵素樣本中的蛋白質量，大致可以說是該酵素的含量。 但須注意酵素是具有活性的分子，蛋白質含量很高的，不見得活性就高。

■ 各種定量法的比較

b. 慎選標準品

蛋白質定量需要一已知的標準品，以求得標準曲線；一般採用 白蛋白 (albumin) 或 免疫球蛋白 (immunoglobulin)，使用不同的標準品所得到的結果，會有相當大的差異。

c. 注意干擾因子

樣本中的雜質或緩衝液可能會影響測定，因此濃度較高的樣本，所得結果可能會錯估；通常稀釋倍數較大的樣本，其所含干擾物質少，測定值比較可靠。

 1.1  Biuret 法：

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銅離子在鹼性溶液中，會與蛋白質胜鏈上的 carbonyl 基結合，生成紫色的複合物；兩個 carbonyl 與一個銅離子結合成類似 biuret 的複合体。 其 精確度 較差 (數 mg)，且會受樣本中 硫酸銨 及 Tris 的干擾，但 準確度 較高，不受蛋白質的種類影響。由 Biuret 法更發展出較靈敏的 BCA (bicinchoninic acid) 呈色劑，使精確度大大提升。

■ 精確度與準確度

 1.2  Lowry 法：

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是上述 biuret 法的延伸，當銅離子與胜鏈形成複合物後，可再與 Folin-Ciocalteau 試劑的 phosphomolybdic-phosphotungstate 作用產生藍色物質，更為靈敏 (約 0.1 mg)，但較麻煩，也會受 硫酸銨 及 硫醇化合物 的干擾。 步驟中各項試劑的混合，要特別注意均勻澈底，否則會有大誤差。

 1.3  UV 吸光法：

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a. 胺基酸的 芳香基團 在 280 nm 有吸光，蛋白質胜鏈骨架上的基團在 200 nm 附近有吸光。 由於各種蛋白質所含芳香族胺基酸組成不一，它們在 280 nm 的吸光能力亦不同，可以 分子消光係數 (molar extinction coefficient) 來表示。 

b. 一般以 E (1%, 280 nm) 來表示，大部分蛋白質在 4-15 間 (平均為 10)。 若某蛋白質的 E 值為 10，其溶液在 280 nm 吸光值為 1，則此蛋白質溶液的濃度為 1 mg/mL。可以下式計算︰     吸光值 ＝ E × b × c

      (c 為蛋白質 % 濃度，即每 100 mL 所含蛋白質的克數；b 為光徑 1 cm)

■ 分子消光係數

c. 此法只有在蛋白質純度很高時，才能精確測定；但若將蛋白質的 E 值大概定為 10，則對粗抽取液的略估相當方便：在 280 nm 的吸光值為 1 時，濃度約為 1 mg/mL。

■ 蛋白質的分子消光係數

圖 1.1  各種蛋白質定量方法所依據的原理     ■ 比較蛋白質染色法

目標蛋白質在中央以捲繞的粗線表示，其上並標出蛋白質的脊骨 (-N-C-C-N-C-C-)，連同胺基酸上的各種官能基團 (Lys, Arg, Tyr 等)，都可被利用來作為定量之用。

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