B3-1

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 1

  基本分析方法  1.1  1.2  1.3

B3 目錄

酵素化學實驗中，兩種最基本的分析方法，就是蛋白質定量，以及該酵素的專一性催化反應。本實驗課程從頭到尾都要用到這兩種分析方法，請自琢磨出精準的定量技術。

1.1

蛋白質定量法：

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以 96 孔的微量滴定盤，進行蛋白質的定量；有以下兩種常用的方法。

1.1.1  Bradford 定量法：

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Bradford 法是利用蛋白質與 Coomassie Brilliant Blue G-250 結合呈色來定量。

儀器：

37℃ 恆溫箱

ELISA 光度計 (Dynatech MR 5000)

ELISA 96 槽微量滴定盤 (Nunc 442404)

試劑用具：

Coomassie Blue dye (1/4×, Bio-Rad 500-0006) 以 Tris 稀釋四倍  

50 mM Tris buffer, pH 7.4 (Buffer A)   

蛋白質標準品 (bovine serum albumin, BSA, 100 mg/mL)  

未知樣本 (含未知濃度的蛋白質)   

大頭針或噴火槍

微量滴定盤 (microtiter plate, Nunc 442404) 在盤面上編好樣本位置 (圖 1.1) 

先準備一組系列 BSA 標準品：

並以未知樣本準備數種濃度的未知樣本 (X1, X2 …)

方法：

(1) 每槽取 50 mL 標準品 (#0, #1 .... #5) 或未知樣本 (X1, X2)，以二重複加入 96 孔微量滴定盤中。

(2) 每槽再加 200 mL dye (1/4×)，在全部樣本槽加完前，不要中斷添加；整個操作時間不要拖太久，同時小心避免氣泡產生。

◆ 本步驟是實驗成敗的關鍵！

(3) 輕拍滴定盤的一側，使添加的各成份均勻混合，注意 Dye Reagent 因密度較大，很容易沉積在下方。

圖 1.2  顯示這三個連續動作 (1)→(2)→(3)。

◆ 這時若還有氣泡，小心用大頭針刺破，大量時可用火燄燒破之。

(4) 靜置室溫 10 min。

(5) 以 ELISA reader 測 570 nm (或 595 nm) 吸光。

(6) 作圖畫出標準校正線，並決定未知樣本的濃度。

1.1.2  BCA 定量法：

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BCA (bicinchoninic acid) 法是利用蛋白質對兩價銅離子 (Cu²⁺) 進行還原，所生成的 Cu⁺ 可以 BCA 專一性地呈色而定量。

儀器：

儀器用具 同上

試劑用具：

一般緩衝液同上，另需下列物品：

BCA reagent kit (Pierce 23225)：含 Reagent A (BCA) 及 Reagent B (CuSO₄)

事先將 Reagent A 和 Reagent B 以 50：1 比例均勻混合，每盤要 20 mL。

先準備一組系列 BSA 標準品 (BSA 2 mg/mL)：

以 Tris 稀釋成一系列濃度：2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 mg/mL

方法：

(1) 在一微量滴定盤上，各標準品每濃度取 20 mL 以二重複加入預定槽內。

(2) 每槽加 200 mL 上述之混合 Reagent，全部樣本槽加完前不要中斷。

◆ 所有操作之注意要點同上。

(3) 輕拍滴定盤的一側，使添加的各個成份均勻混合。

(4) 靜置 37℃ 反應 10 min。

(5) 以 ELISA reader 測 562 nm (或 570 nm) 吸光。

(6) 作圖畫出標準校正線，並決定未知樣本的濃度。

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1.2

澱粉磷解脢活性分析：

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B3 目錄

澱粉磷解脢催化澱粉磷解之可逆反應，本實驗測量其澱粉合成方向所產生之磷酸，磷酸標準曲線之線性範圍在 0.5~5 mM 間，再現性良好。

儀器：

同上節

試劑：

醋酸緩衝液 (0.2 M, pH 5.5)：

可溶性澱粉 (1.2%)：

Glc-1-P (32 mM)：

◆ Glc-1-P 會因儲存過久而裂解出磷酸，使用期限為三週左右；不可加熱。

磷酸呈色劑 (ferro-sulfate molybdate)：

◆ 使用前新鮮配製。溶液應為淡褐色，若變質則呈現藍色。

磷酸標準溶液 (20 mM)：

取 0.38 g 磷酸鈉 (Na₃PO₄, Sigma S-1001) 溶於 50 mL Milli-Q 水，保存於室溫。

方法：

(1) 將醋酸緩衝液、可溶性澱粉及 Glc-1-P 以體積比 1:1:1 混合，當作反應基質液。

(2) 取適當濃度之酵素液 10~20 mL，加入 ELISA 盤中之各槽，並加入 75 mL 反應基質液，於 37℃ 反應 10~20 min，各槽要固定相同的反應時間。

(3) 迅速加入 200 mL 呈色劑，於 5 min 內以 ELISA 光度計測 650 nm 的吸光值。

(4) 結果以磷酸濃度表示者，則將上述的吸光值帶入磷酸標準回歸曲線，換算得磷酸濃度。

磷酸標準曲線作法：

(1) 將磷酸標準溶液 (20 mM) 稀釋為 15, 10, 5, 2.5, 1, 0 mM 系列，每濃度 200 mL。

(2) 將上述系列稀釋之磷酸標準溶液與 1.2% soluble starch 及醋酸緩衝液，以體積比 1:1:1 混合均勻，每管有 600 mL。

(3) 上述混合後的磷酸標準溶液各 75 mL，再加入 10 mL 的 H₂O 共得 85 mL，依濃度低至濃度高的順序，加入 ELISA plate 中，製作二重複。

(4) 加入呈色劑 200 mL 後，測 650 nm 吸光讀值，選取讀值小於 1.5 之結果平均。

(5) 以磷酸濃度為 x 軸，650 nm 吸光值為 y 軸，製作標準曲線，並迴歸求斜率。

 y  =  ____  x  +  _____                           式  (I)

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1.3

澱粉磷解脢 動力學 分析：

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B3 目錄

澱粉磷解脢的催化反應乃一 雙基質反應，因此在探討酵素對基質的親和度 (K_m) 及反應速率 (V_max) 時，必須固定其中一種基質濃度 (如澱粉)，改變目標基質的濃度 (如 Glc-1-P)，利用 Lineweaver-Burk 雙倒數作圖，求出對此基質之 K_m 及V_max。

儀器試劑：

同上節

方法：

酵素動力學基本操作： 

(1) 取適當濃度的酵素液 10 mL，加入 ELISA plate 中。

(2) 加入基質液與醋酸緩衝液的混合液 (Glc-1-P：soluble starch：acetate buffer = 25 mL：25 mL：25 mL) 共 75 mL，立刻置於 37℃ 恆溫培養箱，反應 20 min。

(3) 加入呈色劑 200 mL 中止反應並呈色，於 1 min 內以 ELISA 光度計測量 650 nm 的吸光值；吸光值在 1.5 內迴歸呈線性。

(4) 每槽反應所需時間須精確控制相同。

最適酵素濃度：

(1) 取酵素液做系列稀釋，可做 1:5, 1:10, 1:20, 1:50, 1:100 等，視酵素濃度而定。

(2) 依上述基本操作流程，做二重複實驗，測量上面不同稀釋的酵素在作用 20 min 後，產生 650 nm 吸光值的變化。

(3) 選取吸光值最接近 1.5 者，即為最適稀釋濃度。

SP 對 soluble starch 結合能力 (固定 Glc-1-P 濃度)：

(1) 將 1.2% soluble starch 系列稀釋成 0.8%, 0.6%, 0.4%, 0.2%, 0.1% 及 0% (blank) 共計七種濃度，每個濃度需 200 mL。

(2) 取 500 mL Glc-1-P (32 mM) 與 500 mL 醋酸緩衝液混合均勻。

(3) 取上述最適濃度之酵素液 10 mL，加入 ELISA plate 中 7 槽 × 2 排，共計 14 槽。

(4) 依濃度由低至高的順序，將各濃度的 soluble starch 各 25 mL，加入 ELISA plate 中，製作二重複。

(5) 加入步驟 (2) 所述之混合液 50 mL，立刻置於 37℃ 恆溫培養箱，反應 20 min 後呈色，方法如基本操作流程。

(6) 所得之吸光值代入上面方程式 (I) 可得磷酸濃度 ^a。

(7) 酵素反應速率定義 ^b 為每分鐘的 Pi 生成量 (mmole)。 因此磷酸濃度 (A mM) 可換算為反應速率公式如下：

反應速率    =  A mM × 25 mL / 20 min

=  A × 10^-3 M × 25 mL / 20 min

=  25 A × 10^-3 mmole / 20 min

=  1.25 A × 10^-3 mmole / min                                   式 (II)

(8) 以 soluble starch 濃度之倒數為 x 軸 (1/%) ^c，反應速率倒數為 y 軸 (min/mmole) ^d 作圖，迴歸可得一直線。 其 x 截距為 -1/K_m ^e，y 截距為 1/V_max ^f。

-1/ K_m ^e = _____ ,  K_m = _____ ;  1/ V_max ^f = _____ ,  V_max = _____

SP 對 Glc-1-P 結合能力 (固定 soluble starch 濃度)：

(1) 將 32 mM Glc-1-P 做系列稀釋成 16, 12, 8, 4, 2 及 0 (blank) 共計 7 種濃度，每個濃度須 200 mL。

(2) 取 500 mL soluble starch (1.2%) 與 500 mL 醋酸緩衝液混合均勻。

(3) 取上述最適濃度之酵素液 10 mL，加入 ELISA plate 中 7 槽 × 2 排共計 14 槽。

(4) 依濃度低至濃度高的順序，將各種濃度的 Glc-1-P 各 25 mL，加入 ELISA plate 中，製作二重複。

(5) 加入步驟 (2) 所述之混合液 50 mL，立刻置於 37℃ 恆溫培養箱，反應 20 min。呈色方法如基本操作流程。

(6) 所得之吸光值代入方程式 (I) 可得磷酸濃度 ^g。

(7) 代入 (II) 之公式，換算反應速率 ^h。

(8) 以 Glc-1-P 濃度之倒數為 x 軸 (1/mM) ⁱ，反應速率之倒數為 y 軸 (min/mmole) ^j 作圖，迴歸可得一直線。其 x 截距為 -1/ K_m ^k，y 截距為 1/ V_max ^l。

-1/ K_m ^e = _____ ,  K_m = _____ ;  1/ V_max ^f = _____ ,  V_max = _____