B3-1

     

  酵素化學實驗  B3 酵素操作方法   1 分析  2 純化  3 電泳  4 轉印  

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 1

  基本分析方法  1.1  1.2  1.3

 

B3 目錄

 

酵素化學實驗中,兩種最基本的分析方法,就是蛋白質定量,以及該酵素的專一性催化反應。本實驗課程從頭到尾都要用到這兩種分析方法,請自琢磨出精準的定量技術。

 

 

1.1

蛋白質定量法

 
 

以 96 孔的微量滴定盤,進行蛋白質的定量;有以下兩種常用的方法。

 
 

1.1.1  Bradford 定量法:

 
 

Bradford 法是利用蛋白質與 Coomassie Brilliant Blue G-250 結合呈色來定量。

 
 

儀器

 

37℃ 恆溫箱

 

ELISA 光度計 (Dynatech MR 5000)

 

ELISA 96 槽微量滴定盤 (Nunc 442404)

 

 

試劑用具:

 

Coomassie Blue dye (1/4×, Bio-Rad 500-0006) 以 Tris 稀釋四倍  

7.0  mL

 

50 mM Tris buffer, pH 7.4 (Buffer A)   

4.0  mL

 

蛋白質標準品 (bovine serum albumin, BSA, 100 mg/mL)  

1.5  mL

 

未知樣本 (含未知濃度的蛋白質)   

0.8  mL

 

大頭針或噴火槍

 

微量滴定盤 (microtiter plate, Nunc 442404) 在盤面上編好樣本位置 (圖 1.1) 

 
 

 

 

先準備一組系列 BSA 標準品:

 

Label

BSA (mL)

Buffer A (mL)

最終濃度 (mg/mL)

操作注意

#5

500

0

100

混合均勻

#4

400

100

80

混合均勻

#3

300

200

60

混合均勻

#2

200

300

40

混合均勻

#1

100

400

20

混合均勻

#0

0

500

0

混合均勻

 

並以未知樣本準備數種濃度的未知樣本 (X1, X2 …)

 
 

方法:

 

(1) 每槽取 50 mL 標準品 (#0, #1 .... #5) 或未知樣本 (X1, X2),以二重複加入 96 孔微量滴定盤中。

 

(2) 每槽再加 200 mL dye (1/4×),在全部樣本槽加完前,不要中斷添加;整個操作時間不要拖太久,同時小心避免氣泡產生。

 

本步驟是實驗成敗的關鍵!

 

(3) 輕拍滴定盤的一側,使添加的各成份均勻混合,注意 Dye Reagent 因密度較大,很容易沉積在下方。

 

圖 1.2  顯示這三個連續動作 (1)→(2)→(3)。

 

◆ 這時若還有氣泡,小心用大頭針刺破,大量時可用火燄燒破之。

 
 

 
 

(4) 靜置室溫 10 min。

 

(5) 以 ELISA reader 測 570 nm (或 595 nm) 吸光。

 

(6) 作圖畫出標準校正線,並決定未知樣本的濃度。

 
 
 

1.1.2  BCA 定量法:

 
 

BCA (bicinchoninic acid) 法是利用蛋白質對兩價銅離子 (Cu2+) 進行還原,所生成的 Cu+ 可以 BCA 專一性地呈色而定量。

 
 

儀器:

 

儀器用具 同上

 
 

試劑用具:

 

一般緩衝液同上,另需下列物品:

 

BCA reagent kit (Pierce 23225):含 Reagent A (BCA) 及 Reagent B (CuSO4)

 

事先將 Reagent A 和 Reagent B 以 50:1 比例均勻混合,每盤要 20 mL。

 

先準備一組系列 BSA 標準品 (BSA 2 mg/mL):

 

以 Tris 稀釋成一系列濃度:2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 mg/mL

 
 

方法:

 

(1) 在一微量滴定盤上,各標準品每濃度取 20 mL 以二重複加入預定槽內。

 

(2) 每槽加 200 mL 上述之混合 Reagent,全部樣本槽加完前不要中斷。

 

◆ 所有操作之注意要點同上。

 

(3) 輕拍滴定盤的一側,使添加的各個成份均勻混合。

 

(4) 靜置 37℃ 反應 10 min。

 

(5) 以 ELISA reader 測 562 nm (或 570 nm) 吸光。

 

(6) 作圖畫出標準校正線,並決定未知樣本的濃度。

 
       

 

 

     

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1.2

澱粉磷解脢活性分析

B3 目錄

 

澱粉磷解脢催化澱粉磷解之可逆反應,本實驗測量其澱粉合成方向所產生之磷酸,磷酸標準曲線之線性範圍在 0.5~5 mM 間,再現性良好。

 
 

儀器:

 

同上節

 

 

試劑

 

醋酸緩衝液 (0.2 M, pH 5.5):

 

CH3COONa (RDH 32319) 13.37 g
CH3COOH (RDH 33209) 2.13 mL

加水至 1,000 mL 置於 4℃ 保存。

 

 

可溶性澱粉 (1.2%):

 
Soluble starch (Sigma S-2630 或 Nakalai 321-22)  1.2 g

取 1.2 g 可溶性澱粉先以 50 mL 水懸濁之,以微波爐短暫加熱 30 s,俟完全溶解後放冷,再加水至 100 mL,置室溫儲存,若有發霉則須丟棄。

 
 

Glc-1-P (32 mM):

 
a-D-Glucose-1-phosphate  (Sigma G-7000) 0.98 g

加水至 100 mL 置於 4℃ 保存。

 

◆ Glc-1-P 會因儲存過久而裂解出磷酸,使用期限為三週左右;不可加熱。

 
 

磷酸呈色劑 (ferro-sulfate molybdate):

 
Ammonium molybdate    (Sigma A-7302) 0.4  g
H2SO(6 N, 硫酸原液為 36 N) (Merck)  6.8 mL
H2O (Milli-Q) 33.2 mL
FeSO4·7H2O (Sigma F-7002) 2.0 g

將 ammonium molybdate 以 6 N 硫酸溶解,加 Milli-Q 水完全溶解後,再加入 FeSO4·7H2O 避光下混合均勻;使用前新鮮配置。

 

◆ 使用前新鮮配製。溶液應為淡褐色,若變質則呈現藍色。

 
 

磷酸標準溶液 (20 mM):

 

取 0.38 g 磷酸鈉 (Na3PO4, Sigma S-1001) 溶於 50 mL Milli-Q 水,保存於室溫。

 

 

方法:

 

(1) 將醋酸緩衝液、可溶性澱粉及 Glc-1-P 以體積比 1:1:1 混合,當作反應基質液。

 

(2) 取適當濃度之酵素液 10~20 mL,加入 ELISA 盤中之各槽,並加入 75 mL 反應基質液,於 37℃ 反應 10~20 min,各槽要固定相同的反應時間。

 

(3) 迅速加入 200 mL 呈色劑,於 5 min 內以 ELISA 光度計測 650 nm 的吸光值。

 

(4) 結果以磷酸濃度表示者,則將上述的吸光值帶入磷酸標準回歸曲線,換算得磷酸濃度。

 
 

磷酸標準曲線作法:

 

(1) 將磷酸標準溶液 (20 mM) 稀釋為 15, 10, 5, 2.5, 1, 0 mM 系列,每濃度 200 mL。

 

(2) 將上述系列稀釋之磷酸標準溶液與 1.2% soluble starch 及醋酸緩衝液,以體積比 1:1:1 混合均勻,每管有 600 mL。

 

(3) 上述混合後的磷酸標準溶液各 75 mL,再加入 10 mL 的 H2O 共得 85 mL,依濃度低至濃度高的順序,加入 ELISA plate 中,製作二重複。

 

(4) 加入呈色劑 200 mL 後,測 650 nm 吸光讀值,選取讀值小於 1.5 之結果平均。

 

(5) 以磷酸濃度為 x 軸,650 nm 吸光值為 y 軸,製作標準曲線,並迴歸求斜率。

 

 y  =  ____  x  +  _____                           式  (I)

 
 

磷酸濃度 mM

0

1

2.5

5

10

15

20

A650 (1)

 

 

 

 

 

 

 

A650 (2)

 

 

 

 

 

 

 

Average

 

 

 

 

 

 

 

 
       

 

 

     

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1.3

澱粉磷解脢 動力學 分析:

B3 目錄

 

澱粉磷解脢的催化反應乃一 雙基質反應,因此在探討酵素對基質的親和度 (Km) 及反應速率 (Vmax) 時,必須固定其中一種基質濃度 (如澱粉),改變目標基質的濃度 (如 Glc-1-P),利用 Lineweaver-Burk 雙倒數作圖,求出對此基質之 Km 及Vmax

 
 

儀器試劑:

 

同上節

 

 

方法:

 

酵素動力學基本操作: 

 

(1) 取適當濃度的酵素液 10 mL,加入 ELISA plate 中。

 

(2) 加入基質液與醋酸緩衝液的混合液 (Glc-1-P:soluble starch:acetate buffer = 25 mL:25 mL:25 mL) 共 75 mL,立刻置於 37℃ 恆溫培養箱,反應 20 min。

 

(3) 加入呈色劑 200 mL 中止反應並呈色,於 1 min 內以 ELISA 光度計測量 650 nm 的吸光值;吸光值在 1.5 內迴歸呈線性。

 

(4) 每槽反應所需時間須精確控制相同。

 
 

最適酵素濃度:

 

(1) 取酵素液做系列稀釋,可做 1:5, 1:10, 1:20, 1:50, 1:100 等,視酵素濃度而定。

 

(2) 依上述基本操作流程,做二重複實驗,測量上面不同稀釋的酵素在作用 20 min 後,產生 650 nm 吸光值的變化。

 

(3) 選取吸光值最接近 1.5 者,即為最適稀釋濃度。

 
 

稀釋比例

1:5

1:10

1:20

1:50

1:100

1:200

A650 (1)

 

 

 

 

 

 

A650 (2)

 

 

 

 

 

 

 
 

SP 對 soluble starch 結合能力 (固定 Glc-1-P 濃度):

 

(1) 將 1.2% soluble starch 系列稀釋成 0.8%, 0.6%, 0.4%, 0.2%, 0.1% 及 0% (blank) 共計七種濃度,每個濃度需 200 mL。

 

(2) 取 500 mL Glc-1-P (32 mM) 與 500 mL 醋酸緩衝液混合均勻。

 

(3) 取上述最適濃度之酵素液 10 mL,加入 ELISA plate 中 7 槽 × 2 排,共計 14 槽。

 

(4) 依濃度由低至高的順序,將各濃度的 soluble starch 各 25 mL,加入 ELISA plate 中,製作二重複。

 

(5) 加入步驟 (2) 所述之混合液 50 mL,立刻置於 37℃ 恆溫培養箱,反應 20 min 後呈色,方法如基本操作流程。

 

(6) 所得之吸光值代入上面方程式 (I) 可得磷酸濃度 a

 

(7) 酵素反應速率定義 b 為每分鐘的 Pi 生成量 (mmole)。 因此磷酸濃度 (A mM) 可換算為反應速率公式如下:

 

反應速率    =  A mM × 25 mL / 20 min

 

=  A × 10-3 M × 25 mL / 20 min

 

=  25 A × 10-3 mmole / 20 min

 

=  1.25 A × 10-3 mmole / min                                   式 (II)

 

(8) 以 soluble starch 濃度之倒數為 x 軸 (1/%) c,反應速率倒數為 y 軸 (min/mmole) d 作圖,迴歸可得一直線。 其 x 截距為 -1/Km e,y 截距為 1/Vmax f

 
 

Starch (%)

0

0.1

0.2

0.4

0.6

0.8

1.2

A650 (1)

 

 

 

 

 

 

 

A650 (2)

 

 

 

 

 

 

 

Average (A)

 

 

 

 

 

 

 

Pi (mM) a

-

 

 

 

 

 

 

V = mmole/min b

-

 

 

 

 

 

 

 
 

Starch (%)

0

0.1

0.2

0.4

0.6

0.8

1.2

x (1%) c

-

 

 

 

 

 

 

y (min/mmole) d

-

 

 

 

 

 

 

 
 

-1/ Km e = _____ ,  Km = _____ ;  1/ Vmax f = _____ ,  Vmax = _____

 
 

SP 對 Glc-1-P 結合能力 (固定 soluble starch 濃度):

 

(1) 將 32 mM Glc-1-P 做系列稀釋成 16, 12, 8, 4, 2 及 0 (blank) 共計 7 種濃度,每個濃度須 200 mL。

 

(2) 取 500 mL soluble starch (1.2%) 與 500 mL 醋酸緩衝液混合均勻。

 

(3) 取上述最適濃度之酵素液 10 mL,加入 ELISA plate 中 7 槽 × 2 排共計 14 槽。

 

(4) 依濃度低至濃度高的順序,將各種濃度的 Glc-1-P 各 25 mL,加入 ELISA plate 中,製作二重複。

 

(5) 加入步驟 (2) 所述之混合液 50 mL,立刻置於 37℃ 恆溫培養箱,反應 20 min。呈色方法如基本操作流程。

 

(6) 所得之吸光值代入方程式 (I) 可得磷酸濃度 g

 

(7) 代入 (II) 之公式,換算反應速率 h

 

(8) 以 Glc-1-P 濃度之倒數為 x 軸 (1/mM) i,反應速率之倒數為 y 軸 (min/mmole) j 作圖,迴歸可得一直線。其 x 截距為 -1/ Km k,y 截距為 1/ Vmax l

 
 

Glc-1-P (mM)

0

2

4

8

12

16

32

A650 (1)

 

 

 

 

 

 

 

A650 (2)

 

 

 

 

 

 

 

Average (A)

 

 

 

 

 

 

 

Pi (mM) g

-

 

 

 

 

 

 

V = mmole/min h

-

 

 

 

 

 

 

 
 

Glc-1-P (mM)

0

2

4

8

12

16

32

x (1%) i

-

 

 

 

 

 

 

y (min/mmole) j

-

 

 

 

 

 

 

 
 

-1/ Km e = _____ ,  Km = _____ ;  1/ Vmax f = _____ ,  Vmax = _____

 
       

 

建立日期:2001/4/20   更新日期:2002/07/27  © 版權所有