B3-2

     

  酵素化學實驗  B3 酵素操作方法   1 分析  2 純化  3 電泳  4 轉印  

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 2

  澱粉磷解脢純化方法   2.1  2.2  2.3  2.4

 

B3 目錄

 

澱粉磷解脢的純化方法,主要依循張長泉在 1987 所發表論文之步驟 (Agric. Biol. Chem. 51: 187-195)。 材料甘藷 (Ipomoea batatas) 為台農 57 號成熟新鮮塊根,購自一般市場;台農 57 號是在民國 49 年利用台農 27 號甘藷為母本,與 Nancy Hall 為父本雜交育成。一般的純化過程,通常是先以 硫酸銨分劃 出蛋白質,再以 膠體過濾離子交換 層析法分離;也可進一步使用 製備式電泳,直接割出所要的蛋白質色帶。

 

 

2.1

粗抽取及硫酸銨分劃:

 
 

儀器:

 

製簽用具、果汁機或均質機、紗布

 

高速冷凍離心機

 

透析袋 及攪拌器

 

 

試劑用具:

 

緩衝液 A (5 × stock):

 

Tris  (50 mM × 5) (BDH 10315P) 30.3 g

加水 800 mL 溶解,以 6 N HCl 調整 pH 成為 7.4 後,加水至 1 L。使用時加水稀釋 5 倍,並加入 b-mercaptoethanol (Sigma) 使其最終濃度為 1 mM。

(Tris = Tris [hydroxymethyl]methylamine, 其 pH 受溫度的影響很大)

 

 

緩衝液 B

 

緩衝液 A 再加入 1% (w/v) polyvinylpolypyrrolidone, PVP (Sigma)。

 

 

緩衝液 C

 

緩衝液 A 再加入 NaCl 成為 0.15 M 濃度。

 

 

硫酸銨 (ammonium sulfate)

 

硫酸銨 (Merck 101211) 於烘乾去除水分後,直接使用於蛋白質鹽析法。

 
 

方法:

 

(1) 取新鮮甘藷塊根,洗淨後去皮,製簽後約重 100 g,加入 150 mL 冰冷緩衝液 B,使用果汁機在 4℃ 下均質,高速攪拌 1 min,停止冷卻 1 min,重複 5 次。

 

(2) 均質液以四層紗布過濾,取濾液離心 30 min (Hitachi RPR-12, 8,000 rpm);收集上清液即得粗抽取液 (XT),測量其體積,記得要留 0.1 mL 做為樣本。

 

◆ 各種離心機之性能各有不同,請自行調整適當的時間及轉速。

 

(3) 取上清液於冰浴下緩緩加入硫酸銨,並不時攪拌,達到所要的飽和度 (如 20%),所加的重量要查表 (表 2.1);繼續攪拌平衡 10 min 後,離心 30 min 同上。

 

(4) 收集沈澱,溶在最少體積的緩衝液 A,並測量其最終體積若干。同時測量上清液體積,繼續以硫酸銨沈澱之,加到下一個飽和濃度 (如 40%)。

 

(5) 如此重複收集各分劃,共有五個沈澱,如上述分別以緩衝液 A 溶解後,分置於五個透析袋中,對緩衝液 C 透析過夜;次日同上離心 30 min 後取上清液。

 

(6) 分析活性後,取總活性最高的一個或數個分劃,集中得到粗抽蛋白質 (AS)。

 
 

表 2.1  各百分飽和濃度硫酸銨添加量

0

最終 硫酸銨百分飽和濃度

 

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

90

100

加入 1 L 溶液中之固態硫酸銨 克數

硫酸銨起始百分飽和濃度

0

106

134

164

194

226

258

291

326

361

398

436

476

516

603

697

0

20

0

27

55

83

113

143

175

207

241

276

312

349

387

469

557

20

25

 

0

27

56

84

115

146

179

211

245

280

317

355

436

522

25

30

 

 

0

28

56

86

117

148

181

214

249

285

323

402

488

30

35

 

 

 

0

28

57

87

118

151

184

218

254

291

369

453

35

40

 

 

 

 

0

29

58

89

120

153

187

222

258

335

418

40

45

 

 

 

 

 

0

29

59

90

123

156

190

226

302

383

45

50

 

 

 

 

 

 

0

30

60

92

125

159

194

268

348

50

55

 

 

 

 

 

 

 

0

30

61

93

127

161

235

313

55

60

 

 

 

 

 

 

 

 

0

31

62

95

129

201

279

60

65

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0

31

63

97

168

244

65

70

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0

32

65

134

209

70

75

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0

32

101

174

75

80

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0

34

139

80

90

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0

70

90

100

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0

100

本表數據來自 Methods in Enzymology (1990) Vol. 182, p. 291,而該表原始資料又來自 Data for Biochemical Research (1969) Dawson, R.M.C. et al. (ed), 2nd edition, Oxford Univ. Press.

 
 

若你要把 100 mL 的粗抽取液以 20% 硫酸銨飽和度沈澱蛋白質,則以上表可查出 0% 到 20% 的飽和度要 106 g 硫酸銨 (每升),因此要加入 10.6 g 硫酸銨。 離心取得沈澱後,上清要重新量體積,因為上清體積一定會比 100 mL 要大 (為什麼?);然後再根據此一體積,繼續進行下一步驟分劃 (如 20~40% 飽和度)。請注意不同溫度的添加量不一樣,要另外查該溫度下的添加表。

 
       

 

 

     

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2.2

膠體過濾法:

B3 目錄

 

膠體過濾法 是依據樣本分子的大小差異來進行分離的,本實驗使用 Sephacryl S-300 作為分離介質,對大部分的蛋白質均適用,但要提高鹽濃度以克服其吸附力。

 
 

儀器:

 

層析管柱 (Pharmacia C16 column, 100 cm) 最好附有 adapter (AC16)

 

蠕動幫浦 (Pharmacia peristaltic pump P-1)

 

分劃收集器 (fraction collector, GilsonPharmacia)

 

細胞離心機Centriprep (Amicon)

 
 

試劑:

 

Sephacryl S-300 (Pharmacia 17-0599-01)

 

緩衝液 C (緩衝液 A 再加有 0.15 M NaCl)

 

 

方法:

 

管柱裝填 

 

(1) 預先將管柱洗淨、晾乾後備用,也要熟悉整隻管柱的拆裝方法。

 

(2) 架起管柱,以水平儀調整管柱,使之與地面垂直。

 

(3) 於管柱中加入約一半高度的緩衝液 C,測試管柱是否有漏水現象;若沒有漏水,則讓緩衝液流出,只留約 5 cm 高的緩衝液 C;以塞子暫時堵住下方出口。

 

(4) 取出所要使用的膠體,好除去所含的 20% 酒精,並平衡在緩衝液 C 中;膠體的處理方法,請參閱講義 B2 酵素純化方法 3.2.4

 

◆ 若是在室溫中進行層析法,一定要等膠體的溫度完全回復室溫才可裝填。

 

(5) 將所要裝填之膠體搖盪均勻,不要有未散之硬塊,也避免氣泡產生,若有氣泡產生則以超音波震盪器 (sonicator) 趕出,並以抽氣去除之。

 

(6) 將上述混合均勻之膠體,以玻棒沿管壁流暢倒入管柱,並且避免使得氣泡陷在膠柱中;可在裝填後,以手電筒在膠柱後方打燈光檢查之。

 

(7) 利用重力自然沈降 1~2 min 後,移去管柱下方軟管的塞子,利用流速加快沈降,注意不可使管柱上方的液相完全乾去。

 

(8) 待膠體已沈降完全,用塞子止住下方軟管,並且以緩衝液加滿管柱。

 

(9) 取出管柱的 adapter 並接好軟管及蠕動幫浦管路,並使整個幫浦及軟管內,完全充滿緩衝液,不得有任何氣泡陷在裡面。

 

(10) 小心將 adapter 放入管柱內,往下推至膠面上方,檢查有無氣泡留滯在 adapter 下面,然後鎖緊 O-ring。此時 adapter 與膠面間有一小段充滿緩衝液的空間。

 

(11) 移去管柱下方軟管的塞子,用幫浦注入緩衝液 C 流洗兩個管柱體積。

 

(12) 暫時停止幫浦輸送,用塞子止住下方軟管,放鬆幫浦使管路呈流通狀態,稍微旋開 adapter 的 O-ring,將 adapter 緩慢往下壓,液體會從幫浦上端軟管流回去,當壓至膠面時,即旋緊 O-ring,鎖上幫浦門,並移去管柱下方軟管的塞子。

 

(13) 緩衝液 C 以預定流速之 150% 流速流 (約 45 mL/h) 洗膠體;一般而言,膠體過濾膠體流洗 1~2 管柱體積,其它膠體約 3~5 體積。

 

(14) 檢查膠面是否因高壓流洗而下降,若降低則重複步驟 (12) 把 adapter 往下壓。

 
 

層析操作: 

 

(1) 取樣本以幫浦注入管柱,膠體過濾法的樣本體積約為膠體體積的 3% 以內;注意樣本的溫度與膠體不能相差太多。

 

◆ 樣本體積不能太大,因此要先以 Centriprep 離心濃縮之;濃縮後之 Centriprep 要保存在 20% 酒精中,下次使用前要先洗去酒精。

 

(2) 在注入樣本後,以預定流速進行溶離,膠體過濾層析法即開始進行,要馬上啟動分劃收集器;所有溶離物質,應在大約 1.5 倍管柱體積之內流出。

 

(3) 收集所得的樣本可進行蛋白質定量及活性分析,收集具有高活性的蛋白質峰,保存部分樣本後,進行下一個純化步驟。

 
 

原態分子量測定: 

 

(1) 膠體過濾管柱可做為原態分子量測定之用,但須以標準蛋白質做好校正曲線。

 

◆ 標準蛋白質 (Bio-Rad 151-1901): Thyroglobulin (670); bovine gamma globulin (158); chicken ovalbumin (44); equine myoglobin (17); vitamin B-12 (1.35) kD

 

(2) 同時也要把純質的目標酵素加入標準蛋白質中,一起進行膠體過濾。

 

◆ 你目前的澱粉磷解脢含有大量雜質,通常無法做為目標酵素樣本,因此須由助教供應較純質的澱粉磷解脢。

 

(3) 跑完膠體過濾後,測定蛋白質以找出各標準蛋白質峰,並測定酵素活性峰,決定目標酵素的溶離位置,以內插求出澱粉磷解脢的分子量。

 
       

 

 

     

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2.3

離子交換法:

B3 目錄

 

DEAE (diethylaminoethyl) 是一種 陰離子交換 基團,通常也使用聚醣類為固相介質。

 
 

儀器:

 

層析管柱 (Pharmacia C26 × 40) 需附有 adapter (AC26)

 

蠕動幫浦 (Pharmacia peristaltic pump P-1)

 

分劃收集器 (fraction collector, GilsonPharmacia)

 

梯度製造器 (Pharmacia gradient mixer MX-1)

 
 

試劑:

 

DEAE Sephacel (Pharmacia 17-0500-01; DEAE Sepharose)

 

緩衝液 A緩衝液 C 及固体 NaCl

 

 

方法

 

(1) DEAE Sephacel 的裝填方法大致同膠體過濾法,裝填於較為粗短的管柱中 (C26 × 40),膠體體積約為 50 mL,並以緩衝液 C 流洗,使平衡至 pH 為 7.4。

 

◆ DEAE 膠體最好在管柱外先以緩衝液 C 徹底平衡好,再生一定要完全

 

(2) 將來自膠體過濾的樣本,注入管柱之後以緩衝液 C 流洗兩個管柱體積,此時不應有蛋白質流洗出;但流出液也應加以收集,以免因失誤而損失。

 

(3) 在緩衝液 A 中加入 NaCl 使其濃度達 0.5 M,成為高限流洗液;而緩衝液 C 中已具有 0.15 M NaCl,為低限流洗液。

 

(4) 在梯度製造器的兩端,各加入高低限鹽溶液 250 mL,與幫浦連線,進行梯度流洗,同時也啟動分劃收集器,每 5 mL 收集一管。

 

◆ 注意低限溶液是加在靠近管柱那一邊,添加時兩邊暫時不要流通。

 

(5) 待梯度製造器中的溶液用盡,加入 100 mL 高限流洗液,洗出殘餘蛋白質。

 

(6) 收集 L-SP 活性區,濃縮後以便繼續進行純化步驟。

 
 

沒有梯度製造器時:

 

(1) 梯度製造器相當昂貴,若無法購置,也可使用階段式梯度;每次用一個鹽濃度流洗一個管柱體積,漸漸提高濃度,如 0.2 M → 0.3 M → 0.4 M → 0.5 M。

 

◆ 各種濃度的溶離液是用緩衝液 A 加上適量 NaCl 配置而得。

 

(2) 階段式梯度的效果,不見得比連續式梯度差,有時反而會有較佳分離效果。

 

(3) 自己製作一個梯度製造器也非難事,用兩個適當大小的塑膠針筒,及一個小型攪拌子即可作成;製作的詳細方法與圖示,可參閱莊榮輝博士論文 p. 65。

 
       

 

 

     

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2.4

製備式電泳 與電泳溶離:

B3 目錄

 

利用原態膠體電泳可直接分離得蛋白質,並以電泳溶離回收該蛋白質。 雖然電泳解析力高,可快速分離所要的蛋白質,然而使用時仍有一些限制: (1) 要能確認目標蛋白質在膠體上的位置,可使用活性染色 (如 SP); (2) 樣本濃度太低者不宜使用,因膠體溶離的回收過程會造成大量損失; (3) 很多蛋白質在原態電泳有拖尾現象,不易定位回收 (如醣蛋白)。

 
 

儀器:

 

電泳設備 (Hoefer SE-250 平板式垂直電泳槽)

 

間隔條 1.5 mm (不須使用樣本梳)

 

溶離設備 (Little Blue Tank 電泳濃縮器 ISCO Model 1750) 附有 4 個溶離槽

 

解剖刀 (Feather No. 23)

 
 

試劑

 

電泳膠體溶液的配置及鑄膠方法詳見 3.1 節

 

澱粉磷解脢的膠體活性染色試劑詳見 3.5.4 節

 

電泳溶離液 stock: 0.2 M Tris-acetate (pH 8.6)

 
 

 

 

方法:

 

電泳及切割膠片

 

(1) 用 SE-250 鑄膠器以 1.5 mm 間隔條鑄造 6% native-PAGE;如圖 2.1 所示,其分離膠体只佔全高度一半,焦集膠体佔四分之一,則樣本佔其餘四分之一;不用樣本梳,只跑一種樣本。

 

(2) 經色析法純化所得 L-SP 樣本,先以限外過濾 (Centriprep YM-30) 濃縮至 3 mL,再加入適量追蹤染料小心注入樣本槽,樣本槽約可容納 15 mL。

 

(3) 於 4℃ 冷房中進行,以定電壓 150 V 進行電泳約 1 h。

 

(4) 待染料跑出膠片外,停止電源拆開裝置。

 

(5) 拆開膠片組合,用解剖刀在膠片左右兩側各切下一條膠體 (寬 0.2 cm) 進行活性染色以確定 L-SP 活性位置 (圖 2.2)。

 
 

 
 

電泳溶離

 

(1) 配置電泳溶離液 (0.01 M Tris-acetate),置冷藏櫃中預冷。

 

(2) 按照溶離器 Little Blue Tank 的使用說明書,將溶離小槽裝置妥當,檢查有無漏水;在樣本小槽及溶離大槽各倒入 0.01 M 溶離緩衝液。

 

(3) 將切割下的 L-SP 活性膠體切成 0.5 × 0.5 cm 的小塊,放入樣本小槽中,開始電泳溶離;應在冷藏櫃中進行溶離。

 

(4) 以等電流方式溶離 (10 mA),一次溶離約 2 h,取樣時暫時停止電流。

 

(5) 將塑膠吸管前端套上 Tycon tube (可避免刺破樣本小槽內的透析膜),伸入樣本小槽中,小心吸取靠近正極一側底部 100~200 mL 的溶液; 連續收集約 3~5 次可回收大部分在膠體中的 L-SP。取樣後,要小心回復原狀,繼續電泳溶離。

 

(6) 將溶離小槽中的膠體取一小塊進行活性染色,若無 L-SP 活性則可停止溶離。

 

◆ 電泳溶離時不可過熱,以免使酵素失活;也可能因溶離或收集不當而失去酵素。電泳溶離槽的詳細構造,可參閱莊榮輝博士論文 p. 59。

 
       

 

建立日期:2001/4/21   更新日期:2002/07/27  © 版權所有