Protocols 2 Purification

B3-2

酵素化學實驗 B3 酵素操作方法 1 分析 2 純化 3 電泳 4 轉印

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澱粉磷解脢純化方法 2.1 2.2 2.3 2.4

B3 目錄

澱粉磷解脢的純化方法，主要依循張長泉在 1987 所發表論文之步驟 (Agric. Biol. Chem. 51: 187-195)。材料甘藷 (Ipomoea batatas) 為台農 57 號成熟新鮮塊根，購自一般市場；台農 57 號是在民國 49 年利用台農 27 號甘藷為母本，與 Nancy Hall 為父本雜交育成。一般的純化過程，通常是先以硫酸銨分劃出蛋白質，再以膠體過濾或離子交換層析法分離；也可進一步使用製備式電泳，直接割出所要的蛋白質色帶。

2.1

粗抽取及硫酸銨分劃：

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儀器：

製簽用具、果汁機或均質機、紗布

高速冷凍離心機

透析袋及攪拌器

試劑用具：

緩衝液 A (5 × stock)：

Tris (50 mM × 5)	(BDH 10315P)	30.3	g

加水 800 mL 溶解，以 6 N HCl 調整 pH 成為 7.4 後，加水至 1 L。使用時加水稀釋 5 倍，並加入 b-mercaptoethanol (Sigma) 使其最終濃度為 1 mM。
(Tris = Tris [hydroxymethyl]methylamine, 其 pH 受溫度的影響很大)

緩衝液 B：

緩衝液 A 再加入 1% (w/v) polyvinylpolypyrrolidone, PVP (Sigma)。

緩衝液 C：

緩衝液 A 再加入 NaCl 成為 0.15 M 濃度。

硫酸銨 (ammonium sulfate)：

硫酸銨 (Merck 101211) 於烘乾去除水分後，直接使用於蛋白質鹽析法。

方法：

(1) 取新鮮甘藷塊根，洗淨後去皮，製簽後約重 100 g，加入 150 mL 冰冷緩衝液 B，使用果汁機在 4℃ 下均質，高速攪拌 1 min，停止冷卻 1 min，重複 5 次。

(2) 均質液以四層紗布過濾，取濾液離心 30 min (Hitachi RPR-12, 8,000 rpm)；收集上清液即得粗抽取液 (XT)，測量其體積，記得要留 0.1 mL 做為樣本。

◆ 各種離心機之性能各有不同，請自行調整適當的時間及轉速。

(3) 取上清液於冰浴下緩緩加入硫酸銨，並不時攪拌，達到所要的飽和度 (如 20%)，所加的重量要查表 (表 2.1)；繼續攪拌平衡 10 min 後，離心 30 min 同上。

(4) 收集沈澱，溶在最少體積的緩衝液 A，並測量其最終體積若干。同時測量上清液體積，繼續以硫酸銨沈澱之，加到下一個飽和濃度 (如 40%)。

(5) 如此重複收集各分劃，共有五個沈澱，如上述分別以緩衝液 A 溶解後，分置於五個透析袋中，對緩衝液 C 透析過夜；次日同上離心 30 min 後取上清液。

(6) 分析活性後，取總活性最高的一個或數個分劃，集中得到粗抽蛋白質 (AS)。

表 2.1 各百分飽和濃度硫酸銨添加量

0℃		最終硫酸銨百分飽和濃度
		20	25	30	35	40	45	50	55	60	65	70	75	80	90	100
		加入 1 L 溶液中之固態硫酸銨克數
硫酸銨起始百分飽和濃度	0	106	134	164	194	226	258	291	326	361	398	436	476	516	603	697	0
	20	0	27	55	83	113	143	175	207	241	276	312	349	387	469	557	20
	25		0	27	56	84	115	146	179	211	245	280	317	355	436	522	25
	30			0	28	56	86	117	148	181	214	249	285	323	402	488	30
	35				0	28	57	87	118	151	184	218	254	291	369	453	35
	40					0	29	58	89	120	153	187	222	258	335	418	40
	45						0	29	59	90	123	156	190	226	302	383	45
	50							0	30	60	92	125	159	194	268	348	50
	55								0	30	61	93	127	161	235	313	55
	60									0	31	62	95	129	201	279	60
	65										0	31	63	97	168	244	65
	70											0	32	65	134	209	70
	75												0	32	101	174	75
	80													0	34	139	80
	90														0	70	90
	100															0	100
本表數據來自 Methods in Enzymology (1990) Vol. 182, p. 291，而該表原始資料又來自 Data for Biochemical Research (1969) Dawson, R.M.C. et al. (ed), 2nd edition, Oxford Univ. Press.


		若你要把 100 mL 的粗抽取液以 20% 硫酸銨飽和度沈澱蛋白質，則以上表可查出 0% 到 20% 的飽和度要 106 g 硫酸銨 (每升)，因此要加入 10.6 g 硫酸銨。離心取得沈澱後，上清要重新量體積，因為上清體積一定會比 100 mL 要大 (為什麼？)；然後再根據此一體積，繼續進行下一步驟分劃 (如 20~40% 飽和度)。請注意不同溫度的添加量不一樣，要另外查該溫度下的添加表。

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		酵素化學實驗 B3 酵素操作方法 1 分析 2 純化 3 電泳 4 轉印
到目錄	2.2	膠體過濾法：	▲
B3 目錄
		膠體過濾法是依據樣本分子的大小差異來進行分離的，本實驗使用 Sephacryl S-300 作為分離介質，對大部分的蛋白質均適用，但要提高鹽濃度以克服其吸附力。

		儀器：
		層析管柱 (Pharmacia C16 column, 100 cm) 最好附有 adapter (AC16)
		蠕動幫浦 (Pharmacia peristaltic pump P-1)
		分劃收集器 (fraction collector, Gilson 或 Pharmacia)
		細胞離心機、Centriprep (Amicon)

		試劑：
		Sephacryl S-300 (Pharmacia 17-0599-01)
		緩衝液 C (緩衝液 A 再加有 0.15 M NaCl)

		方法：
		管柱裝填：
		(1) 預先將管柱洗淨、晾乾後備用，也要熟悉整隻管柱的拆裝方法。
		(2) 架起管柱，以水平儀調整管柱，使之與地面垂直。
		(3) 於管柱中加入約一半高度的緩衝液 C，測試管柱是否有漏水現象；若沒有漏水，則讓緩衝液流出，只留約 5 cm 高的緩衝液 C；以塞子暫時堵住下方出口。
		(4) 取出所要使用的膠體，好除去所含的 20% 酒精，並平衡在緩衝液 C 中；膠體的處理方法，請參閱講義 B2 酵素純化方法 3.2.4。
		◆ 若是在室溫中進行層析法，一定要等膠體的溫度完全回復室溫才可裝填。
		(5) 將所要裝填之膠體搖盪均勻，不要有未散之硬塊，也避免氣泡產生，若有氣泡產生則以超音波震盪器 (sonicator) 趕出，並以抽氣去除之。
		(6) 將上述混合均勻之膠體，以玻棒沿管壁流暢倒入管柱，並且避免使得氣泡陷在膠柱中；可在裝填後，以手電筒在膠柱後方打燈光檢查之。
		(7) 利用重力自然沈降 1~2 min 後，移去管柱下方軟管的塞子，利用流速加快沈降，注意不可使管柱上方的液相完全乾去。
		(8) 待膠體已沈降完全，用塞子止住下方軟管，並且以緩衝液加滿管柱。
		(9) 取出管柱的 adapter 並接好軟管及蠕動幫浦管路，並使整個幫浦及軟管內，完全充滿緩衝液，不得有任何氣泡陷在裡面。
		(10) 小心將 adapter 放入管柱內，往下推至膠面上方，檢查有無氣泡留滯在 adapter 下面，然後鎖緊 O-ring。此時 adapter 與膠面間有一小段充滿緩衝液的空間。
		(11) 移去管柱下方軟管的塞子，用幫浦注入緩衝液 C 流洗兩個管柱體積。
		(12) 暫時停止幫浦輸送，用塞子止住下方軟管，放鬆幫浦使管路呈流通狀態，稍微旋開 adapter 的 O-ring，將 adapter 緩慢往下壓，液體會從幫浦上端軟管流回去，當壓至膠面時，即旋緊 O-ring，鎖上幫浦門，並移去管柱下方軟管的塞子。
		(13) 緩衝液 C 以預定流速之 150% 流速流 (約 45 mL/h) 洗膠體；一般而言，膠體過濾膠體流洗 1~2 管柱體積，其它膠體約 3~5 體積。
		(14) 檢查膠面是否因高壓流洗而下降，若降低則重複步驟 (12) 把 adapter 往下壓。

		層析操作：
		(1) 取樣本以幫浦注入管柱，膠體過濾法的樣本體積約為膠體體積的 3% 以內；注意樣本的溫度與膠體不能相差太多。
		◆ 樣本體積不能太大，因此要先以 Centriprep 離心濃縮之；濃縮後之 Centriprep 要保存在 20% 酒精中，下次使用前要先洗去酒精。
		(2) 在注入樣本後，以預定流速進行溶離，膠體過濾層析法即開始進行，要馬上啟動分劃收集器；所有溶離物質，應在大約 1.5 倍管柱體積之內流出。
		(3) 收集所得的樣本可進行蛋白質定量及活性分析，收集具有高活性的蛋白質峰，保存部分樣本後，進行下一個純化步驟。

		原態分子量測定：
		(1) 膠體過濾管柱可做為原態分子量測定之用，但須以標準蛋白質做好校正曲線。
		◆ 標準蛋白質 (Bio-Rad 151-1901): Thyroglobulin (670); bovine gamma globulin (158); chicken ovalbumin (44); equine myoglobin (17); vitamin B-12 (1.35) kD
		(2) 同時也要把純質的目標酵素加入標準蛋白質中，一起進行膠體過濾。
		◆ 你目前的澱粉磷解脢含有大量雜質，通常無法做為目標酵素樣本，因此須由助教供應較純質的澱粉磷解脢。
		(3) 跑完膠體過濾後，測定蛋白質以找出各標準蛋白質峰，並測定酵素活性峰，決定目標酵素的溶離位置，以內插求出澱粉磷解脢的分子量。

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到目錄	2.3	離子交換法：	▲
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		DEAE (diethylaminoethyl) 是一種陰離子交換基團，通常也使用聚醣類為固相介質。

		儀器：
		層析管柱 (Pharmacia C26 × 40) 需附有 adapter (AC26)
		蠕動幫浦 (Pharmacia peristaltic pump P-1)
		分劃收集器 (fraction collector, Gilson 或 Pharmacia)
		梯度製造器 (Pharmacia gradient mixer MX-1)

		試劑：
		DEAE Sephacel (Pharmacia 17-0500-01; DEAE Sepharose)
		緩衝液 A、緩衝液 C 及固体 NaCl

		方法：
		(1) DEAE Sephacel 的裝填方法大致同膠體過濾法，裝填於較為粗短的管柱中 (C26 × 40)，膠體體積約為 50 mL，並以緩衝液 C 流洗，使平衡至 pH 為 7.4。
		◆ DEAE 膠體最好在管柱外先以緩衝液 C 徹底平衡好，再生一定要完全！
		(2) 將來自膠體過濾的樣本，注入管柱之後以緩衝液 C 流洗兩個管柱體積，此時不應有蛋白質流洗出；但流出液也應加以收集，以免因失誤而損失。
		(3) 在緩衝液 A 中加入 NaCl 使其濃度達 0.5 M，成為高限流洗液；而緩衝液 C 中已具有 0.15 M NaCl，為低限流洗液。
		(4) 在梯度製造器的兩端，各加入高低限鹽溶液 250 mL，與幫浦連線，進行梯度流洗，同時也啟動分劃收集器，每 5 mL 收集一管。
		◆ 注意低限溶液是加在靠近管柱那一邊，添加時兩邊暫時不要流通。
		(5) 待梯度製造器中的溶液用盡，加入 100 mL 高限流洗液，洗出殘餘蛋白質。
		(6) 收集 L-SP 活性區，濃縮後以便繼續進行純化步驟。

		沒有梯度製造器時：
		(1) 梯度製造器相當昂貴，若無法購置，也可使用階段式梯度；每次用一個鹽濃度流洗一個管柱體積，漸漸提高濃度，如 0.2 M → 0.3 M → 0.4 M → 0.5 M。
		◆ 各種濃度的溶離液是用緩衝液 A 加上適量 NaCl 配置而得。
		(2) 階段式梯度的效果，不見得比連續式梯度差，有時反而會有較佳分離效果。
		(3) 自己製作一個梯度製造器也非難事，用兩個適當大小的塑膠針筒，及一個小型攪拌子即可作成；製作的詳細方法與圖示，可參閱莊榮輝博士論文 p. 65。

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		酵素化學實驗 B3 酵素操作方法 1 分析 2 純化 3 電泳 4 轉印
到目錄	2.4	製備式電泳與電泳溶離：	▲
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		利用原態膠體電泳可直接分離得蛋白質，並以電泳溶離回收該蛋白質。雖然電泳解析力高，可快速分離所要的蛋白質，然而使用時仍有一些限制： (1) 要能確認目標蛋白質在膠體上的位置，可使用活性染色 (如 SP)； (2) 樣本濃度太低者不宜使用，因膠體溶離的回收過程會造成大量損失； (3) 很多蛋白質在原態電泳有拖尾現象，不易定位回收 (如醣蛋白)。

		儀器：
		電泳設備 (Hoefer SE-250 平板式垂直電泳槽)
		間隔條 1.5 mm (不須使用樣本梳)
		溶離設備 (Little Blue Tank 電泳濃縮器 ISCO Model 1750) 附有 4 個溶離槽
		解剖刀 (Feather No. 23)

		試劑：
		電泳膠體溶液的配置及鑄膠方法詳見 3.1 節
		澱粉磷解脢的膠體活性染色試劑詳見 3.5.4 節
		電泳溶離液 stock： 0.2 M Tris-acetate (pH 8.6)



		方法：
		電泳及切割膠片：
		(1) 用 SE-250 鑄膠器以 1.5 mm 間隔條鑄造 6% native-PAGE；如圖 2.1 所示，其分離膠体只佔全高度一半，焦集膠体佔四分之一，則樣本佔其餘四分之一；不用樣本梳，只跑一種樣本。
		(2) 經色析法純化所得 L-SP 樣本，先以限外過濾 (Centriprep YM-30) 濃縮至 3 mL，再加入適量追蹤染料小心注入樣本槽，樣本槽約可容納 15 mL。
		(3) 於 4℃ 冷房中進行，以定電壓 150 V 進行電泳約 1 h。
		(4) 待染料跑出膠片外，停止電源拆開裝置。
		(5) 拆開膠片組合，用解剖刀在膠片左右兩側各切下一條膠體 (寬 0.2 cm) 進行活性染色以確定 L-SP 活性位置 (圖 2.2)。



		電泳溶離：
		(1) 配置電泳溶離液 (0.01 M Tris-acetate)，置冷藏櫃中預冷。
		(2) 按照溶離器 Little Blue Tank 的使用說明書，將溶離小槽裝置妥當，檢查有無漏水；在樣本小槽及溶離大槽各倒入 0.01 M 溶離緩衝液。
		(3) 將切割下的 L-SP 活性膠體切成 0.5 × 0.5 cm 的小塊，放入樣本小槽中，開始電泳溶離；應在冷藏櫃中進行溶離。
		(4) 以等電流方式溶離 (10 mA)，一次溶離約 2 h，取樣時暫時停止電流。
		(5) 將塑膠吸管前端套上 Tycon tube (可避免刺破樣本小槽內的透析膜)，伸入樣本小槽中，小心吸取靠近正極一側底部 100~200 mL 的溶液；連續收集約 3~5 次可回收大部分在膠體中的 L-SP。取樣後，要小心回復原狀，繼續電泳溶離。
		(6) 將溶離小槽中的膠體取一小塊進行活性染色，若無 L-SP 活性則可停止溶離。
		◆ 電泳溶離時不可過熱，以免使酵素失活；也可能因溶離或收集不當而失去酵素。電泳溶離槽的詳細構造，可參閱莊榮輝博士論文 p. 59。

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