Protocols 4 Blotting

B3-4

酵素化學實驗 B3 酵素操作方法 1 分析 2 純化 3 電泳 4 轉印

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蛋白質電泳轉印及相關應用 4.1 4.2 4.3

B3 目錄

蛋白質電泳膠片經轉印於轉印膜表面後，可以進行免疫染色法、蛋白質 N-端序及酵素活性染色等。轉印膜 PVDF (polyvinylidene difluoride) 是一種疏水性材質，蛋白質可藉由本身的疏水性部分與其結合。

4.1

蛋白質電泳轉印法：

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儀器：

電泳轉印槽 (Hoefer TE22)

轉印紙 (Millipore Immobilon, PVDF)、濾紙 (Whatman 3 mm)

電源供應器

試劑：

轉印緩衝液 (blotting buffer, 10×)：

Tris	(Sigma T-1530)	30.3	g
Glycine	(Sigma G-7126)	144.0	g

加水至 800 mL，pH 調至 8.3 後，加水至 1,000 mL。原態膠體 (native-PAGE) 的轉印緩衝液稀釋十倍後直接使用；SDS-PAGE 轉印時，則轉印緩衝液中含有 10% (v/v) 甲醇。

注意：若轉印後要進行蛋白質定序，請改用 CAPS 轉印緩衝液。

標準蛋白質組合：

預先染色之低分子量標準 (Novex SeeBlue Pre-stained standard)

Protein:	Molecular Mass (Da)
Myosin	250,000
Bovine serum albumin	98,000
Glutamate dehydrogenase	64,000
Alcohol dehydrogenase	50,000
Carbonic anhydrase	36,000
Myoglobin	30,000
Lysozyme	16,000
Aprotinin	6,000
Insulin B chain	4,000

方法：

(1) 將所要轉印之 SDS-PAGE 或 native-PAGE 膠片浸於轉印緩衝液 (1×) 中，平衡 20~30 min。通常 SDS-PAGE 中的蛋白質分子量較小，因此要加入 10% 的甲醇於轉印緩衝液中，以避免小分子蛋白質過度擴散或穿過轉印膜。

(2) 轉印膜 PVDF 切割成比膠片稍大，因膠片平衡後體積會略漲。 PVDF 為疏水性，必須先以 100% 甲醇短暫溼潤後，再浸入轉印緩衝液 (1×) 中備用。

(3) 取兩張稍大的濾紙，於轉印緩衝液中浸潤備用。取出轉印卡夾，先墊一張多孔性海綿，鋪上一張濾紙，再小心鋪上膠片，勿陷入任何氣泡，鋪上轉印膜，再蓋上一層濾紙及海綿，再把整個膠片卡夾裝好。

(4) 置入已裝有轉印緩衝液 (1×) 的轉印槽中，注意 PVDF 那面朝正極，膠片面朝負極。除去卡夾外面的氣泡，氣泡的存在將使轉印效率變差。

(5) 以 400 mA 進行轉印，於 4℃ 中轉印 60 min 後中止。取出轉印膜，浸在尿素洗液中洗 1 h 以上；尿素可洗去 SDS-PAGE 樣本蛋白質分子上的 SDS，同時可以將蛋白質分子部分恢復原態，以增加抗體確認機率。

(6) 在電泳過程中若有 pre-stained 的標準蛋白質，可作為轉印效率的參考。

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酵素化學實驗 B3 酵素操作方法 1 分析 2 純化 3 電泳 4 轉印

電泳後把蛋白質轉印至 PVDF 轉印膜上，利用專一性抗體對膜上的蛋白質抗原做專一性結合，再用二次抗體對上述抗體進行專一性的結合；而因二次抗體上連結有呈色酵素 (多用 horse radish peroxidase, HRP 或 alkaline phosphatase, AP)，可呈色而得以偵測。二次抗體也可連結 biotin，再藉由 streptavidin 架橋與 biotinylated alkaline phosphatase 結合 (ABC system)，一個 avidin 可與四個 biotin 結合；這種免疫染色步驟可達放射性顯像的靈敏度，且其專一性也可增強。

儀器：

平台震盪器及塑膠染色盤

試劑：

明膠-NET：

Gelatin	0.25%	(Merck 4070)	2.50	g
NaCl	0.15 M	(Merck 6404)	8.75	g
EDTA·2Na	5 mM	(Merck 8418)	1.80	g
Tween 20	0.05%	(Merck 822184)	0.50	mL
Tris	50 mM	(Sigma T-1530)	6.05	g

加水 800 mL 並加熱至 gelatin 溶解，調 pH 至 8.0，再加水至 1,000 mL。

PBS (phosphate buffer saline) 5×：

NaCl	0.13 M × 5	(Merck 6404)	38.0	g
NaH₂PO₄	0.01 M × 5	(Wako)	7.8	g

加水 800 mL 溶解，用 NaOH 調成 pH 7.0，加水至 1,000 mL，成為 5×PBS。

PBST (phosphate buffer saline & Tween)：

PBS 5× 稀釋至 1× 並加入 0.05% (v/v) Tween 20，即成為 PBST。

Urea-PBST：

Urea	6 M	(Sigma U-1250)	36	g

加入 PBST 加熱溶解後，以 PBST 定量至 100 mL。

一次抗體：

通常要免疫大白兔或小白鼠自行製備一次抗體，一般抗體的使用濃度在 1:1,000 至 1:5,000 之間，視抗體效價而定，使用前以上述明膠 -NET稀釋之。抗體的製備方法，請參見 B2 酵素分析方法 6 免疫學工具的利用。

二次抗體連結體：

通常都可以購得上述一次抗體的二次抗體，並且連結有標誌酵素或者標誌物 (如螢光物或者 biotin)；其使用濃度請依照廠商建議，也稀釋在明膠 -NET 中。

◆ 注意二次抗體的種類很多，差別在其純度有高低，以及所對抗的一次抗體種類不同 (如抗 IgG, IgM, IgA 或全部)，或抗體的部位 (如抗整個抗體分子，或者只有 Fc 或 Fab 片段)，同時連結物的種類也很多；請小心以免購買不適用的二次抗體。

AP 緩衝液 (alkaline phosphatase buffer) 5×：

Tris	100 mM × 5	(Sigma T-1530)	6.050	g
NaCl	100 mM × 5	(Merck 6404)	2.920	g
MgCl₂	10 mM × 5	(Sigma M-8266)	0.475	g

加入水至 80 mL 後，以 NaOH 調至 pH 9.5 後，加水定量至 100 mL。使用前要稀釋成 1× 濃度。

A + B 試劑：

A Reagent, streptavidin	(Vectastain)	10	mL
B Reagent, biotinylated alkaline phosphatase	(Vectastain)	10	mL

加入 15 mL NET 稀釋 1,500 倍，混合均勻後，室溫下先放置 30 min 後使用。

NBT 試劑：

Nitro blue tetrazolium	(Sigma N-6876)	0.5	g

溶於 70% DMF (dimethylforamide) 10 mL。

BCIP 試劑：

5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate	(Sigma B-6149)	0.5	g

溶於 100% DMF 10 mL。

AP 呈色劑 (BCIP + NBT)：

BCIP 試劑	33	mL
NBT 試劑	66	mL

呈色前新鮮配置，溶於 10 mL (1×) AP 緩衝液中。

◆ 注意若是使用 HRP 為標誌酵素，則需使用不同的呈色劑：

HRP 呈色劑 DAB：

Diaminobenzidine (DAB)	(Sigma D-5637)	5	mg
H₂O₂(30%)	(Merck 7210)	10	mL

用 100 mL PBS 溶解，必須新鮮製備，不可放過夜；DAB 是致癌物質。

方法：

(1) 尿素洗過的轉印紙再以 PBST 洗三次，每次 10 min。

(2) 加入一次抗體 (適當濃度溶於明膠-NET 中)，室溫下反應 1 h。

◆ 一般抗體的使用濃度是在 1:1,000 至 1:5,000 之間，視抗體效價而定。

(3) 以 PBST 洗 3 次，每次 10 min。

(4) 加入二次抗體 (biotinylated 2nd Ab)，室溫下反應 1 h。二次抗體同樣也溶在明膠-NET 中，使用濃度請參考廠商說明書指定濃度。

(5) 以 PBST 洗 3 次，每次 10 min。

(6) 加入預先混合 30 min 之 A+B 試劑，反應 1 h。

(7) 以 PBST 洗 2 次，每次 10 min。

(8) 以 AP 緩衝液洗 2 次，每次 10 min。

(9) 加入 AP 呈色劑呈色，可在 5~30 min 內得到紫黑色色帶，若天冷可置於 37℃ 烘箱增快反應；在背景顏色尚未變深前，倒去呈色劑，以蒸餾水清洗數次。

(10) 將呈色完成的 PVDF 膜，浸入 100% 甲醇 1 min，可避免呈色基質殘留，因而造成 PVDF 背景顏色加深的困擾。

(11) 免疫染色結果的好壞，取決於每次清洗步驟是否完全且徹底；過於隨便的清洗步驟會造成染色結果不良。

若使用 HRP 為標誌酵素：

與前面 (1) - (5) 的步驟相同，但步驟 (4) 中的二次抗體使用 HRP 的連結體。

(6) 再以 PBS 洗過 2 次後，倒入 HRP 呈色劑 DAB，褐色色帶開始出現。

(7) 呈色約在 10 min 內完成，應當在背景開始加深前中止呈色。

(8) 倒去呈色液，並以蒸餾水清洗數次，取出晾乾後避光保存。

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酵素化學實驗 B3 酵素操作方法 1 分析 2 純化 3 電泳 4 轉印

蛋白質 N-端序列決定法：

蛋白質 N-端定序的檢定採用 Edman degradation 方法，利用蛋白質自動定序儀進行胺基酸的序列分析；整個實驗系統避免使用具有胺基的物質。

儀器及試劑：

轉印用具及試劑如上節，但轉印緩衝液須避免使用含有胺基的 Tris 及 glycine。

轉印緩衝液 (blotting buffer) 1×：

CAPS	10 mM	(Sigma C-2632)	2.22	g

加水 600 mL 溶之，調整 pH 至 11 後，加甲醇 100 mL，再加水至 1,000 mL 攪拌均勻；最後含 10% 甲醇，可視需要調至 20%。
(CAPS = 2-[cyclohexylamino]-1-propanesulfonic acid)

方法：

(1) 轉印的方法與步驟如上所述，單一色帶的蛋白質含量最好有 0.1 mg 以上。

(2) 取出轉印膜，以五分之一濃度的 Coomassie Brilliant Blue R-250 染液短暫染 1 min，或等到色帶剛出現之時，即以 50% 甲醇脫去背景顏色。若蛋白質濃度低，脫色時間需較久；若背景顏色太深，可用 100% 甲醇脫色。染色脫色後，將轉印膜放入二次水中清洗，再放置於陰涼處晾乾。

(3) 將轉印膜上的目標蛋白質色帶切下，以封口袋保存，送往儀器中心定序，所使用的儀器通常為 Applied Biosystems 的 Model 473 A。

(4) 也可以把切下的轉印膜放入水解管中，加入 0.6 mL 水解液 (HCl : TFA = 4 : 1)，抽真空封口後在 140℃ 水解 3 h，水解液可進行胺基酸成分分析。

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