6 抗體工具

6 免疫學工具的利用︰
若能得到酵素的抗体，則對此酵素的研究將有非常大的幫助，因為抗体的專一性很高，可做為專一性的探針，廣泛地應用在 ELISA、免疫沉澱或免疫轉印上。有關抗体的製備及詳細的實驗流程，請參考相關的免疫學文獻 (如 Harlow E, Lane D (1988) Antibodies, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press)，或參閱莊榮輝博士論文的實驗方法第三章；以下以實用角度，說明生產抗体及其應用的注意事項，及常見問題的評估。
6.1 抗原製備：		TOP ▲
a. 蛋白質抗原	與免疫動物的遺傳背景離得越遠的蛋白質，其抗原性越好，都可順利地得到高效價抗血清；通常植物蛋白質都是很強的抗原。	◆ 抗體的網站
b. 小分子抗原	分子量很小的胜汰 (在數千左右者)，本身無法誘生抗体，要先結合到大蛋白質分子 (稱為 carrier，通常用 BSA 或 KHL hemocyanin) 上去。
c. 半抗原	分子量極小的一些小分子 (如黃麴毒素僅有數百)，稱為 hapten (半抗原)，接到 carrier 後也可誘生抗体。
d. 人工合成胜汰抗原	若已知某蛋白質的胺基酸序列，可以人工合成某段胜汰 (大約十幾個胺基酸)，連接到 carrier 後免疫可得抗血清。通常都先以電腦程式 (PC/GENE) 預測抗原性較強的胺基酸序列，選出數段進行免疫，因為可能有些片段不易產生高效價的抗血清。
e. 抗原的純度	抗原純度越高越好，尤其在製備傳統抗血清時，純度不夠可能會有假結果。但製備單株抗体的抗原可不用完全均質，以方便抗原的大量製備；因為在篩選得單株抗体後，可由免疫轉印確認抗体的專一性，去除不對的單株抗体。
f. 抗原的形式	一般蛋白質抗原都以溶液形式處理，但也可自膠片或轉印紙上直接把色帶切割下來，研碎後加佐劑即可免疫。
DNA 抗原	近來可以使用 DNA 產生抗原，在動物體內直接引發免疫反應。首先將目標蛋白質的基因植在某種表現質體中，再以基因槍打入肌肉細胞中，此基因可以在體內表現出目標蛋白質，引發產生抗體或者細胞免疫。
	DNA Vaccine Web
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6.2 免疫流程：		TOP ▲
a. 標準免疫流程	圖 6.1A 是免疫小白鼠的標準流程，在得到可用的抗原後，約需二到三個月的時間來免疫動物。注射的抗原量要適中，過量的抗原，不見得會誘生較好的抗体。最近有商品化的高效能免疫佐劑 (TiterMax)，可以在一個月內誘出抗體，並可減少免疫次數，而其效價也不差。

圖 6.1 免疫及抗體純化流程
b. 其他免疫流程	近來有許多快速免疫方法，例如把抗原加佐劑後，直接打入脾臟，以縮短時間或免疫次數；有些血清效價似乎不錯。不過免疫反應相當複雜，仍有許多科學上的未知現象，若非必要還是採用標準流程。
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6.3 抗体製備：		TOP ▲
a. 傳統抗血清	免疫時間或次數完成後，可試採血看效價如何，多以 ELISA 進行測試。若 ELISA 效價達 5,000 以上 (即血清稀釋 5,000 倍濃度在 ELISA 有 50% 最高呈色)，即可進行全部採血。待血液凝固後，離心取上清即得抗血清；儘量使用懸藍式離心機。
b. 腹水採集	小鼠的全血量很少，但若誘生其腹水，則体積可增大許多。如圖 6.1A 流程中先施打 pristane 減弱小鼠免疫力，再打骨髓癌細胞 NS-1 進其腹腔，可誘生腹水一至數毫升。腹水內多為抗体，可進一步純化。
c. 單株抗体	單株抗体針對單一個抗原決定基具有極高的專一性，是傳統抗血清所無法達致的特點，對蛋白質細微構造的分析很有用處。其製備過程相當複雜，操作順利的話，前後可能需時三個月以上；但若技術與設備均完善，要取得有用的單株抗體並非難事。
d. 免疫球蛋白	無論是得到抗血清或腹水，應當儘快進行免疫球蛋白 (Ig) 的純化，通常只要硫酸銨沉澱即可得到相當純的球蛋白 (圖 6.1B)。要注意這樣所得到的抗体，其中只有一部份是專一性的抗体，因為動物本身有許多原先就存在的抗体。	◆ 細胞融合與單株抗體講義與幻燈片
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6.4 抗体的應用：		TOP ▲
a. 轉印及免疫染色法	是抗体在生化及分子生物學研究上，最重要的貢獻。其詳細說明，請見前文所述。
b. 免疫沉澱法	若把抗体分子接在一固相擔体上 (大多使用 CNBr-Sepharose)，則可用來做為專一性的沉澱劑，把樣本中的抗原分子專一性地沈澱下來 (參閱圖 6.2)。

圖 6.2 擔體免疫沈澱的原理及應用
c. 親和層析法	上述接有抗体的固相擔体，也可用管柱方式進行親和層析，以純化抗原分子，將在酵素純化方法中說明。
d. 雙向免疫擴散法	是古老的免疫學檢定方法，但仍有其應用上的特點；可以檢定抗原及抗体間的專一性反應，並可鑑別兩個抗原分子之間的差異性程度。
e. 酵素免疫分析法 (ELISA)	原理與免疫染色法類似，是利用抗体的專一性去偵測抗原量的多寡，並以酵素為放大信息的標示，因此有相當高的靈敏度；因為使用固相擔体，故操作較為方便，同時可處理大量樣本，但解析力不及電泳轉印的免疫染色法。	■ 三明治免疫分析法 ◆ Vector
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