目錄基礎免疫學為何要使用單株抗體細胞融合法總 結其 他References

 

  教  學  主  題

 
      
 

細胞融合與單株抗體

 
 

Cell Fusion and Monoclonal Antibodies

 
 

國立臺灣大學生化科技學系微生物與生化所生物化學研究室

 
 

莊 榮 輝   吳 建 興

 
     
 

 
     
 

 目 錄

 
 
 
 

 

   
 

1  基礎免疫學  
 

1A) 脊椎動物的免疫系統可催毀入侵物體

 
 

1B) 後天免疫反應的四個階段

 
 

1C) 後天免疫反應的兩大特點

 
 

1D) 抗體是由 B 細胞所分泌的蛋白質

 
     
 

2  為何要使用單株抗體  
 

2A) 一個抗原分子可能含有許多抗原決定基

 
 

2B) 傳統抗血清對相似抗原會有交叉反應性

 
 

2C) 一個 B 細胞只會生產一種抗體

 
 

2D) B 細胞無法在培養基中生長

 
 

2E) 癌細胞可在培養基中永久生長

 
 

2F) 利用細胞融合法可以結合兩種特性

 
     
 

3  細胞融合法  
 

3A) 小白鼠免疫及脾臟細胞

 
 

3B) 骨髓癌細胞

 
 

3C) 細胞融合

 
 

3D) 細胞融合的注意要點

 
 

3E) 篩選方法

 
 

3F) 抗體生產

 
     
 

總 結  
 

摘要流程圖

 
     
  其他相關技術  
 

噬菌體表現

 
 

DNA 免疫法

 
     
  Reference  
       
 
 
     
 

上課時間

     
 

講習課程

單株抗體 (1)

每學年 下學期開課 (接續下面的實驗課程)

 
 

實驗課程

免疫學技術 (2)

每學年 暑期開課 共 18 週   上課課程表

 
     
 

若有需要製備單株抗體者,請選修上述兩門課程,並請隨時注意生科院 TechComm 公告

 
     
 

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簡要說明單株抗體流程  [mAb basics.ppt] (若你沒有很多時間,請看此檔案)

 
 
 
 

莊榮輝開授相關課程資訊

 
 

 
     
 

1  基礎免疫學

 
     
 

1A) 脊椎動物的免疫系統可催毀入侵物體:

 
 

免疫反應分成 先天後天 兩大系統,又各有兩種方式,分別以 細胞分子 去掃除入侵物。 當入侵物太多時,即由先天免疫系統誘發後天免疫,開啟了更具專一性、更為強大的防禦機制。

 
     
 
 
 

 
 

一些代表性先天免疫防禦細胞或分子:

 
 

干擾素: 遭病毒攻擊的細胞會放出干擾素,干擾素會活化免疫系統

 
 

溶菌脢: 在體表及淚液中溶解細菌細胞壁。

 
 

巨噬細胞: 最基層的免疫細胞,是免疫系統的第一線防禦。

 
 

自然殺手細胞: 可清除體內的癌細胞,是免疫監視系統。

 
 

 

 
 
 
     
 

1B) 後天免疫反應的四個階段:  以下四個階段均可連結至漫畫『細胞大戰

 
     
 

遭遇: 巨噬細胞把抗原分解成小片段,專一地表現給 TH 細胞。

 
 

動員 TH 細胞動員 TK 細胞及 B 細胞,後者生產專一性抗體。

 
 

掃蕩: 抗體及 TK 細胞攻擊入侵的抗原。

 
 

休止: 完成清除抗原後,免疫細胞休息。

 
     
 
 
 

 
 
 
 

1C) 後天免疫反應的兩大特點:

 
     
 

專一性: 由 甲抗原 所誘導的免疫反應只對 甲抗原 有效。

 
 

記憶性: 痊瘉後若 甲抗原 再度入侵,可迅速動員掃蕩之。

 
     
 
 
 

 
 
 
     
 

因為有上述兩種特點,因此當重複感染同一種抗原時,會有下面幾種現象:

 
 

初級反應 primary response: 當抗原首次入侵,細胞經歷以上四個免疫反應階段,產生記憶細胞。

 
 

次級反應 secondary response: 抗原再次入侵,由記憶細胞啟動免疫反應,較快速且強勁

 
 

Class switching: 初級反應先生成 IgM,抗體的親和力較低,次級反應則轉成 IgG,親和力大增。

 
 

親和力成熟 affinity maturation: 同一抗體基因由 IgM 轉成 IgG ,是經由 體細胞突變

 
     
 
 
 

 
 
 
 

1D) 抗體是由 B 細胞所分泌的蛋白質:

 
     
 

抗體分子: 由四條蛋白質長短鍊所組成 (兩重兩輕)

 
 

結合區: 抗體分子上有兩個抗原結合區 (二者相同),結合區的 變異性 很大,以對抗種種抗原。

 
 

專一性: 抗體與抗原結合極具 專一性 ( lock & key 般吻合)  

 
 

抗體種類 IgG 是單一抗體分子,另有 IgM (五元體) IgA (二元體)

 
     
 
 
 

 

 
 
     
 

An Introduction to Immunoglobulin Structure (OMM 網路分子博物館,需要 JMol)

 
 

Lehninger Biochemistry in 3D 請點選 MHC Molecules (蛋白質與 peptide 間的專一性辨認

 
     
 
 
 

 

     
 

抗體的輕鏈與重鏈是由不同的基因所轉譯出來,兩者各由許多基因片段經過重組而成。如上圖輕鏈的基因由 V, J 及 C 三大群所組成,各群擇一組成最後表現出來的 mRNA,然後轉譯成蛋白質。這樣的重組,可形成很多不同的組合,也是抗體能夠對無數抗原產生專一性結合的主因

 
 
 
 

 

     
 

抗體基因以幾種機制來達成其多樣化之目的,以便產生足夠的抗體,來對抗環境種種不同的抗原。(1) 其基因本身,就有許多不同的選擇,可有不同的組合,使得變異區多樣化;(2) 然後,這些基因片段的組合點不很精確,可增加變異性;(3) 這樣所組合出來的基因,又會進行體細胞的突變,在超變異區 (HV) 特別容易突變;(4) 輕重鏈都有以上的變異機制,然後不同輕重鏈又可隨意組合。

 
 
 
 

 

     
 

2  為何要使用單株抗體

 
     
 

2A) 一個抗原分子可能含有許多抗原決定基

 
 

抗原分子上可以誘導出抗體的部位或片段,特稱之為 抗原決定基 (antigenic determinant);一個抗原分子上通常都有許多處抗原決定基,而每個決定基至少都可誘生出一種抗體;因此在傳統抗血清中,都含有許多種不同的抗體,分別對抗這些不同的決定基

 
     
 
 
 

 
 
 
     
 

Antibody Recognition of Antigen (OMM 網路分子博物館,需要 Chime)

 
 

若上面不通,請到 Kuby Immunology 鏡像網頁 IgG 構造 & 抗原抗體結合 

 
 

Viral Antigens: Influenza Hemagglutinin and HIV gp120 ( II. C Antigenic Variability,需要 Chime)

 
     
 
 
 

 
     
 

免疫系統產生專一性抗體的流程,大致如上圖所示。當抗原初次入侵,由巨噬細胞把抗原呈現給 T 細胞,並由 TH 細胞挑出可產生專一性抗體的 B 細胞。最先被挑出來的 B 細胞,其所產生的抗體可能專一性並不很好,但是若抗原再次入侵,擇會誘使此 B 細胞的基因發生 體細胞突變,產生很多種變異子代細胞,他們所產生的抗體親和力有各種變化,但只有親和力最好的才會被挑選出來。注意如此產生的抗體,只對原來的抗原有專一性結合,若抗原突變或者外殼偽裝起來,就無法辨識

 
 
 
 

2B) 傳統抗血清對相似抗原會有交叉反應性:

 
 

對於分子構造相似的抗原,由於它們含有共同或相似的抗原決定基,所產生的抗血清對這兩種相似的抗原都會產生反應;因此在檢定此類抗原時,其 專一性 不很理想,常常會出現假陽性,也稱為 交叉反應性。 同時又由於免疫動物的個別體質不同,對抗原的反應也有相當的差異,以致無法準確控制所得到每批抗血清 效價 的高低。

 
     
 
 
 

 
 
 
 

2C) 一個 B 細胞只會生產一種抗體:

 
 

血清中的每一種抗體是由單一種 B 細胞 所分泌產生,若能把此 B 細胞由脾臟中挑出來,單獨培養成細胞株,則可得單一種類的抗體,只會對一種 抗原決定基 反應,其專一性極高。 大量培養此細胞株,即可有品質一定、純度均一的抗體,此即為 單株抗體

 
     
 
 
 

 
 
 
 

2D) B 細胞無法在培養基中生長:

 
 

然而 B 細胞不易在培養基中生長,雖然有人一直努力,想找出在體外培養脾臟細胞的條件,但結果均不甚理想,因此上述想法不易達成。 (請見 下圖 中央的 4 號 B 細胞X 表示無法培養)

 
 

scheme

 
 
 
 

 
 
 
 

2E) 癌細胞可在培養基中永久生長:

 
 

癌細胞 很容易在培養基中生長,有很多已經建立好的癌細胞株,其生長之特性均已瞭解; 若把癌細胞永續生長的特性,利用細胞融合法導入可生產有用抗體的 B 細胞 中,則得到可在培養基中永久生長的 B 細胞株,此即 融合瘤 細胞株。  (請見 上圖 右半部及下圖說明)

 
 

scheme

 
 
 
 

 
 
 
 

2F) 利用細胞融合法可以結合兩種特性:

 
 

廣義來說,細胞融合也可說是 基因重組 的一種方式,它是以融合兩種不同遺傳特性的細胞,來達成改變遺傳形質的目的。 另外,微生物或植物的細胞,亦可以 原生質體 的形式互相融合,以改變其遺傳性質。

 

     
 

 
     
 

3  細胞融合法

 
     
   
 
 
     
 

利用 polyethylene glycol (PEG) 進行小白鼠 脾臟細胞 (3A) 與 骨髓癌細胞 (3B) 的 融合 (3C),經過 篩選 (3E) 單株化 後,可得到分泌有 單株抗体 (3F) 的融合瘤細胞。實際操作方法可參考 莊榮輝 博士論文 (1985) 88~105  pdf

 
     
 

3A) 小白鼠免疫脾臟細胞

 
 

1) 小白鼠 (balb/c) 先以 目標抗原 (如菌體) 免疫,抗原需加 佐劑 (adjuvant, TiterMax) 製成乳劑打入小鼠體內 慢慢釋出 (免疫流程),誘使 B 細胞成熟增殖並生產抗體。 試採血 確定有抗體產生後,即可取出 脾臟 以收穫 脾臟細胞 (大多為 B 細胞) 與骨髓癌細胞進行 細胞融合 

 
 

2) 注意乳劑的生產要完全,可取小量滴入水中,震動後應該不會散去。 也可以在 電泳後切出所要色帶膠體裝入乳化針筒,加入佐劑 直接製成乳劑,可有相當好的免疫效果。

 
 

3) 抗原 種類與來源 也很重要,與小鼠親緣越遠的分子,越容易產生抗體。 通常抗原都是蛋白質,但是多醣類也相當容易誘生抗體,核酸比較不容易直接產生免疫反應 (或者如下所述,採用 DNA 疫苗免疫方式)。若知道抗原分子的胺基酸序列,可以用電腦找出最具抗原性的片段,大約 10~20 個胺基酸長度,以人工合成出來後接到大分子 carrier 上,經免疫動物誘生抗體,稱之為 單專一性抗體 (monospecific Ab)。

 
 

4) 有人直接取出健康的脾細胞,在培養中加入抗原進行體外免疫;或打開腹腔直接在脾臟注射抗原免疫。 近來更流行以抗原的 DNA 種入肝臟中,以此 DNA 的表現產物,直接在生物體內誘發免疫反應 (DNA vaccine)。 但除非抗原來源困難或有其它目的,我們仍採行舊法,因免疫反應的啟動機制非常複雜,生物整體的免疫反應還是最可靠。

 
 

5) 注意抗原的用量要適當,抗原用量太高,反而無法誘導出高親和力的抗體

 
     
 
 
 

 
 
 
     
 

3B) 骨髓癌細胞 (NS-1):

 
 

NS-1 是穩定的小白鼠 BALB/c 癌細胞株,除了能在培養基中永續生長外,尚有一重要特性,其細胞缺乏兩種核酸代謝的重要酵素 (TK, thymidine kinase HGPRT, hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)。一般細胞內的核酸合成路徑有兩條,如下圖所示:

 
     
 
 
 

 
 

核酸的 正常代謝途徑 若被 aminopterin 阻礙,可由 救急途徑 (salvage pathway) 取用 thymidine (T) 及 hypoxanthine (H) 來合成 DNA。但 NS-1 缺乏 TK 及 HGPRT 兩種酵素,因此在 aminopterin (A) 存在下 NS-1 無法生長;正常細胞 (如 B 細胞) 則可經救急途徑繼續生長。HAT 培養基含 aminopterin, thymidine 及 hypoxanthine,NS-1 在 HAT 中無法生長,除非經由細胞融合導入 TK 及 HGPRT 兩酵素的基因 (可由正常脾臟細胞得來)。

 
 
 
 

 
 
 
     
 

3C) 細胞融合

 
 

小白鼠脾臟細胞 B NS-1 細胞 N PEG 進行融合,操作在 10 min 內完成 (如下圖),隨即把細胞平均分配在 96 槽細胞培養盤 (上圖)

 
     
 
 
 

 
 
 
     
 

由於融合是隨機的,故可能的組合有:B-N, B-B, N-N, B-B-B, B-B-N....;只有同時含有 B N 的融合細胞才會活下去:

 
     
 
 
 

 
 

1) 若只含 NS-1 (N, N-N.....),則在 HAT 中會因 DNA 合成抑制而死亡。

 
 

2) 若只含脾細胞 (B, B-B, B-B-B......),則在體外培養會漸漸死去。

 
 

3) 可能活下去的細胞 (B-N, B-B-N, N-N-B.....) 含有來自兩方的染色體,同源染色體可能發生基因重組,互換遺傳訊息;接下去的細胞分裂會排除多餘的染色體,一直到只剩一組染色體時才告穩定。在初期的分裂增殖過程中,失去含有重要基因染色體的子細胞可能會死去。成功穩定的融合細胞株會經由染色體的重組,得兼有雙方的特性:即可分泌抗體,亦可在培養基 HAT 中生長下去。

 
 
 
 

3D) 細胞融合的注意要點

 
     
 

1) NS-1 要健康,在 T-80 培養瓶內生長密度不要超過六成,一瓶 T-80 細胞用在一次融合。脾細胞取出後可以不用除去紅血球,直接以 RPMI 洗三次,要小心自行調整 離心力 不致太大,也不能太小,隨時鏡檢之

 
 

2) 要用可靠的 PEG 1500,可使用商品已配置好的溶液,每次 0.7~1 mL;否則自己要試出可用的批次,在高壓滅菌時,儘量縮短滅菌時間 (5 min 足夠),並且要儘速由滅菌釜內取出

 
 

3) NS-1 與脾細胞混合,每次使用一個 T-80 與一個脾臟,幾乎可以不用數細胞數目;在 50 mL 離心管中,小心把細胞離心下來,倒去上清後,以殘留的 RPMI 把細胞打散,放在 37℃內保溫準備加入 PEG

 
 

4) 2 min 內慢慢加入 PEG,同時一邊輕輕搖動,讓 PEG 均勻地混合細胞。然後在 2 min 內加入 2 mL RPMI,邊加邊混勻 (如上圖);然後於接下來 2 min 內,再加 8 mL RPMI。此時鏡檢可看到許多細胞聚合,如下圖黑白照片;若在融合後 1 h 看不到很多融合細胞,可能已經失敗

 
 

5) 離心去掉上清,輕輕加入 30 mL HAT-RPMI,均勻懸濁細胞。此步驟最為關鍵,離心力不可過大,以免把 剛融合的脆弱細胞壓成一塊;若你無法輕易而均勻地把細胞懸濁,就已經失敗

 
 

6) 把細胞放在保溫箱 30 min 後,均分到三片 96 孔培養盤,每槽加三~四滴,分配要平均。

 
 

7) 從第二天起就不再用 HAT,改用 HT-RPMI 即可。添加或換培養液時,不要擾動細胞,並且不要在培養箱外面放置太久。 第二或第三天鏡檢可以看到很多二元體,是融合後的第一次分裂;這種二元體數目應該很多,培養槽內到處都會冒出來 ( 25 50 ),可以用『雨後春筍』來形容之,否則可能已經失敗

 
 

8) 但細胞仍迅速死亡,最後每槽只剩下一或二個穩定細胞群落,約一週內可看到如下面彩色圖片所示的細胞堆,此時 開始進行 ELISA 篩選。

 
     
 
 
 

 
 
 
     
 

3E) 篩選方法

 
 

1) 初步篩選: 融合後馬上以 HAT 培養,能活下來的都是上述 B 細胞與 NS-1 的正確融合細胞,但此時細胞的 遺傳背景 尚未十分穩定。

 
 

2) 篩選專一性抗體: 並非所有 B 細胞都會產生我們所要的抗體,小白鼠原先就存在許多 B 細胞株對抗一般疾病;因此要用 酵素免疫分析法 (ELISA) 挑出專一性抗體 (請見下面圖解)。

 
     
 
 
 

 
 
 
     
 

3) 免疫轉印: 也可以收集細胞培養液,抗原以電泳分離後轉印,直接進行 免疫染色

 
 

4) 單株化 (次選殖 subcloning):這樣所挑出來的細胞株,也許仍含有兩群以上的細胞 (為什麼?),因此要進行單株化 。先將該細胞株稀釋,重新平分到 96 槽細胞培養盤中,計算使得每槽中只含一個細胞,俟其生長成群落後,再次以 ELISA 篩選專一性抗體。請見下圖次選殖流程。

 
     
 
 
 

 
 

單株化是要確定每個細胞株的純系,因為細胞可能還會變化,成為不產生專一性抗體者,如上圖最右邊的灰色 3 號細胞。一般使用限數稀釋法進行,細胞的數目可用 cell counter 數得,並且稀釋到所要的濃度,例如 每 mL 含有 100 個細胞,若只要取一個細胞放到一個培養槽中,那麼你應該吸取多少 mL? (0.01 mL)

 
 
 
     
 

3F) 抗體生產

 
 

1) 可把挑選出來的融合細胞打入小鼠腹部,誘生腫瘤,然後以 針頭 收集所產生的 腹水,通常可取得 15 mL 左右;腹水中的抗體濃度非常高,每 mL 可達數 mg 因為這個方法造成實驗動物極大痛苦,很多國家禁用;若非得使用不可時,要儘可能減低動物受苦。

 
 

2) 把融合細胞在大型培養槽中培養,收集培養液上清即得抗體,但每 mL 只得約數 mg,濃度較腹水稀約一千倍。最近有一種細胞培養瓶,可產生如腹水般濃度的上清,但價格極為昂貴 (IBS Integra Bioscience: Integra Celline)。

 
 

3) 得到穩定的抗體後,通常要再以 ELISA 方法 檢定該抗體的 subclass 是屬於 IgG, IgM 或 IgA 等。 免疫時間太短的,較可能取得 IgM,但一般仍以 IgG 較多,注意 IgG 又可分成幾種 sub-subclass。

 
 

4) 所得到的抗體再經純化步驟,以除去雜質,可用下列各種方法的組合︰

 
 

硫酸銨分劃: 收集約 40% 飽和度的沉澱,是最經濟、方便的方法。 

 
 

離子交換法: 用 DEAE 陰離子交換法,多用在純化 IgG

 
 

膠體過濾法: 以分子量的差異分劃出各種抗體,多用在純化 IgM

 
 

親和層析法: 以 Protein A-吸著劑 專一性地吸住抗體分子 (IgG)

 
     
 
 
 

 

 
 
 

 
     
 

總 結

 
     
     
 

當單株抗體剛被發展出來時,人們因為它像 巡弋飛彈 般的準確性,而對其應用於 癌症的治療 方面抱以極高的希望;但是二十年來,並無突破性的進展。主要的原因,並不是單株抗體無法攻擊癌細胞,或者是單株抗體的專一性不夠;原因之一乃是癌細胞的變化實在太大,無法找出各種癌細胞的共同抗原,以製成通用的抗癌單株抗體。

雖然如此,單株抗體並沒有失去其科學上或醫療上的價值,它仍然是一個極為 有用的工具,可以認分子上細微的差異,而被應用在很多其他方面;是目前生物技術產業中,極重要且獲利率高的一項,尤其在未來的『蛋白質晶片』應用, 對整個 蛋白質體學 的研究,可能會有很重要的貢獻 (參閱:蛋白質體與單株抗體工具)。

近十年來,由於基因操作技術的發達,單株抗體因為其基因的修飾剪接,得以改造成各種形式,以致更適合於人體使用;同時,基礎醫學對癌症研究也有長足發展,單株抗體因此又受到重用,請見 Scientific American (October 2001): Magic Bullets Fly Again,是單株抗體的全新熱潮。

 
     
 
 
 

 
 
 
 

下圖是整個細胞融合及單株抗體生產的摘要流程

 
 

 
 

 
 

請注意為何使用傳統抗血清會有 交叉反應,而單株抗體如何克服此一缺點 (上圖右側部份);另外,上圖左側部份說明細胞融合方法,以及單株抗體如何篩選及生產

 
 
 
     
 

其他相關技術:

 
     
  Phage Display  
     
     
 

基因操作方法也可以應用在單株抗體的生產上,稱為 噬菌體表現 (phage display)。當單株細胞被挑選出來之後,可以分離出組成抗體 輕鏈 (L) 及 重鏈 (H) 的 mRNA,把他們的 變異區 (VL VH) 逆轉錄成 cDNA 後,以連接片段 (Fv) 接起來,並植入噬菌體 M13 的外殼蛋白基因中,就可以去感染大腸菌,並且繁殖大量 M13 噬菌體,就會在其外殼表現出所植入的抗體 VL + VH 片段,這是抗體最重要的抗原結合區;因為這種片段保留了抗原結合區,但沒有其他的 Fc 部份,因此可以應用在很多方面。

 
     
 
 
   
 
 
     
 

除了如上述直接表現出抗體的結合區之外,在製備 cDNA 的時候,可以用點突變 (結合 PCR) 的方式,隨機地改變任意鹼基以造成多樣性,可產生更多變的 cDNA 庫,再由所產生的突變蛋白質中,挑選可能的變種抗原結合區,也許有更強或較特殊的親和力。另外,利用基因段的洗牌 (chain shuffling),也可以重新組合不同的輕鏈與重鏈,以求得到更好的組合。

 
     
 
 
     
  DNA Vaccine  
     
     
 

不使用蛋白質為抗原,改用其基因打入免疫動物的細胞核中,並在其細胞中直接轉譯出蛋白質,以便誘發免疫反應請連結 生物技術 - 免疫治療法

 
 

 

 
 

 
     
 

References

 
     
 

 

 
 

Ezzell C (2001) Magic Bullets Fly Again. Scientific American 285 (Oct), 28~35 (單株抗體新熱潮)

 
 

Milstein C (1980) Monocloanl Antibodies. Scientific American 243 (Oct), 56~64

 
 

Roitt I, Brostoff J, Male D (2001) Immunology. 6th ed, Mosby (最暢銷的基礎免疫學課本)

 
 

實際操作方法可參考『水稻蔗糖合成脢之研究』莊榮輝 博士論文 (1985 台大農化系) 88~105  pdf

 
 

Richard A. Goldsby et al (2000) Kuby Immunology (4e) 免疫學課本的網路版

 
 

莊榮輝 (1984) 迷爾使呆與突魔大王 (單株抗體的童話故事) 台大農化 33, 65~69

 
 

莊榮輝 (1990) 細胞大戰 (人體免疫的童話故事) 台大農化 38, 54~58

 
 

莊榮輝 (2000) 生物技術簡介 單株抗體 (介紹生物技術新知的網頁

 
 

莊榮輝 (2000) 酵素純化與分析 免疫學工具 (介紹生物技術新知的網頁

 
 

連結到生科院科技共同空間 TechComm TC4

 
 

 
     
 

莊榮輝開授相關課程資訊

 
     
 

 
     
 

建立日期:2000/4/15; 更新日期: 2010/05/29 

 
 

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