教  學  主  題

細胞融合與單株抗體

Cell Fusion and Monoclonal Antibodies

國立臺灣大學．生化科技學系．生物化學研究室

莊 榮 輝   吳 建 興

 目 錄

1A) 脊椎動物的免疫系統可催毀入侵物體

1B) 後天免疫反應的四個階段

1C) 後天免疫反應的兩大特點

1D) 抗體是由 B 細胞所分泌的蛋白質

2A) 一個抗原分子可能含有許多抗原決定基

2B) 傳統抗血清對相似抗原會有交叉反應性

2C) 一個 B 細胞只會生產一種抗體

2D) B 細胞無法在培養基中生長

2E) 癌細胞可在培養基中永久生長

2F) 利用細胞融合法可以結合兩種特性

3A) 小白鼠免疫及脾臟細胞

3B) 骨髓癌細胞

3C) 細胞融合

3D) 細胞融合的注意要點

3E) 篩選方法

3F) 抗體生產

摘要流程圖

噬菌體表現

DNA 免疫法

上課時間

講習&實習

抗體生產與應用

107-1 張世宗老師開課 (莊榮輝負擔部份講習課)

講習課程 (停)

單株抗體 (1)

每學年 下學期開課 (接續下面的實驗課程)

實驗課程 (停)

免疫學技術 (2)

每學年 暑期開課 共 18 週   上課課程表  

(若有需要製備單株抗體者，請選修上述課程)

上課相關資料

(1) 本課程講義文字檔 MS Word (mAb.doc 或  pdf ) + 上課投影片檔案下載  pdf  (32 pages, 3 Mb)

(2) 免疫化學：酵素分析方法  Ana 8.3 問題集 8-15 題 + 投影片檔案下載  pdf  (27 pages, 4.4 Mb)

簡要說明單株抗體流程  [mAb chart.ppsx] (若你沒有很多時間，請看此檔案)  pdf  (1 page, 0.4 Mb)

莊榮輝開授相關課程資訊

▲

1  基礎免疫學：

1A) 脊椎動物的免疫系統可催毀入侵物體：

免疫反應分成 先天 及 後天 兩大系統，又各有兩種方式，分別以 細胞 或 分子 去掃除入侵物。 當入侵物太多時，即由先天免疫系統誘發後天免疫，開啟了更具專一性、更為強大的防禦機制。

一些代表性先天免疫防禦細胞或分子：

干擾素： 遭病毒攻擊的細胞會放出干擾素，干擾素會活化免疫系統。

溶菌脢： 在體表及淚液中溶解細菌細胞壁。

巨噬細胞： 最基層的免疫細胞，是免疫系統的第一線防禦。

自然殺手細胞： 可清除體內的癌細胞，是免疫監視系統。

1B) 後天免疫反應的四個階段：  以下四個階段均可連結至漫畫『細胞大戰』

遭遇： 巨噬細胞把抗原分解成小片段，專一地表現給 T_H 細胞。

動員： T_H 細胞動員 T_K 細胞及 B 細胞，後者生產專一性抗體。

掃蕩： 抗體及 T_K 細胞攻擊入侵的抗原。

休止： 完成清除抗原後，免疫細胞休息。

1C) 後天免疫反應的兩大特點：

專一性： 由 甲抗原 所誘導的免疫反應只對 甲抗原 有效。

記憶性： 痊瘉後若 甲抗原 再度入侵，可迅速動員掃蕩之。

因為有上述兩種特點，因此當重複感染同一種抗原時，會有下面幾種現象：

初級反應 primary response： 當抗原首次入侵，細胞經歷以上四個免疫反應階段，產生記憶細胞。

次級反應 secondary response： 抗原再次入侵，由記憶細胞啟動免疫反應，較快速且強勁。

Class switching： 初級反應先生成 IgM，抗體的親和力較低，次級反應則轉成 IgG，親和力大增。

親和力成熟 affinity maturation： 同一抗體基因由 IgM 轉成 IgG ，是經由 體細胞突變。

1D) 抗體是由 B 細胞所分泌的蛋白質：

抗體分子： 由四條蛋白質長短鍊所組成 (兩重兩輕)。

結合區： 抗體分子上有兩個抗原結合區 (二者相同)，結合區的 變異性 很大，以對抗種種抗原。

專一性： 抗體與抗原結合極具 專一性 (如 lock & key 般吻合)。  

抗體種類： IgG 是單一抗體分子，另有 IgM (五元體) 及 IgA (二元體)。

抗體的輕鏈與重鏈是由不同的基因所轉譯出來，兩者各由許多基因片段經過重組而成。如上圖輕鏈的基因由 V, J 及 C 三大群所組成，各群擇一組成最後表現出來的 mRNA，然後轉譯成蛋白質。這樣的重組，可形成很多不同的組合，也是抗體能夠對無數抗原產生專一性結合的主因。

抗體基因以幾種機制來達成其多樣化之目的，以便產生足夠的抗體，來對抗環境種種不同的抗原。(1) 其基因本身，就有許多不同的選擇，可有不同的組合，使得變異區多樣化；(2) 然後，這些基因片段的組合點不很精確，可增加變異性；(3) 這樣所組合出來的基因，又會進行體細胞的突變，在超變異區 (HV) 特別容易突變；(4) 輕重鏈都有以上的變異機制，然後不同輕重鏈又可隨意組合。

▲

2  為何要使用單株抗體：

2A) 一個抗原分子可能含有許多抗原決定基：

抗原分子上可以誘導出抗體的部位或片段，特稱之為 抗原決定基 (antigenic determinant)；一個抗原分子上通常都有許多處抗原決定基，而每個決定基至少都可誘生出一種抗體；因此在傳統抗血清中，都含有許多種不同的抗體，分別對抗這些不同的決定基。

免疫系統產生專一性抗體的流程，大致如上圖所示。當抗原初次入侵，由巨噬細胞把抗原呈現給 T 細胞，並由 T_H 細胞挑出可產生專一性抗體的 B 細胞。最先被挑出來的 B 細胞，其所產生的抗體可能專一性並不很好，但是若抗原再次入侵，擇會誘使此 B 細胞的基因發生 體細胞突變，產生很多種變異子代細胞，他們所產生的抗體親和力有各種變化，但只有親和力最好的才會被挑選出來。注意如此產生的抗體，只對原來的抗原有專一性結合，若抗原突變或者外殼偽裝起來，就無法辨識。

2B) 傳統抗血清對相似抗原會有交叉反應性：

對於分子構造相似的抗原，由於它們含有共同或相似的抗原決定基，所產生的抗血清對這兩種相似的抗原都會產生反應；因此在檢定此類抗原時，其 專一性 不很理想，常常會出現假陽性，也稱為 交叉反應性。 同時又由於免疫動物的個別體質不同，對抗原的反應也有相當的差異，以致無法準確控制所得到每批抗血清 效價 的高低。

2C) 一個 B 細胞只會生產一種抗體：

血清中的每一種抗體是由單一種 B 細胞 所分泌產生，若能把此 B 細胞由脾臟中挑出來，單獨培養成細胞株，則可得單一種類的抗體，只會對一種 抗原決定基 反應，其專一性極高。 大量培養此細胞株，即可有品質一定、純度均一的抗體，此即為 單株抗體。

2D) B 細胞無法在培養基中生長：

然而 B 細胞不易在培養基中生長，雖然有人一直努力，想找出在體外培養脾臟細胞的條件，但結果均不甚理想，因此上述想法不易達成。 (請見 下圖 中央的 4 號 B 細胞，X 表示無法培養)

scheme

2E) 癌細胞可在培養基中永久生長：

癌細胞 很容易在培養基中生長，有很多已經建立好的癌細胞株，其生長之特性均已瞭解； 若把癌細胞永續生長的特性，利用細胞融合法導入可生產有用抗體的 B 細胞 中，則得到可在培養基中永久生長的 B 細胞株，此即 融合瘤 細胞株。  (請見 上圖 右半部及下圖說明)

scheme

2F) 利用細胞融合法可以結合兩種特性：

廣義來說，細胞融合也可說是 基因重組 的一種方式，它是以融合兩種不同遺傳特性的細胞，來達成改變遺傳形質的目的。 另外，微生物或植物的細胞，亦可以 原生質體 的形式互相融合，以改變其遺傳性質。

▲

3  細胞融合法：

利用 polyethylene glycol (PEG) 進行小白鼠 脾臟細胞 (3A) 與 骨髓癌細胞 (3B) 的 融合 (3C)，經過 篩選 (3E) 及 單株化 後，可得到分泌有 單株抗体 (3F) 的融合瘤細胞。實際操作方法可參考 莊榮輝 博士論文 (1985) 88~105  pdf 。

3A) 小白鼠免疫及脾臟細胞：

1) 小白鼠 (balb/c) 先以 目標抗原 (如菌體) 免疫，抗原需加 佐劑 (adjuvant, 如 TiterMax) 製成乳劑，打入小鼠體內 慢慢釋出 (免疫流程)，誘使 B 細胞成熟增殖並生產抗體。 試採血 確定有抗體產生後，即可取出 脾臟 以收穫 脾臟細胞 (大多為 B 細胞) 與骨髓癌細胞進行 細胞融合。 

2) 注意乳劑的生產要完全，可取小量滴入水中，震動後應該不會散去。 也可以在 電泳後，切出所要色帶，膠體裝入乳化針筒，加入佐劑 直接製成乳劑，可有相當好的免疫效果。

3) 抗原 種類與來源 也很重要，與小鼠親緣越遠的分子，越容易產生抗體。 通常抗原都是蛋白質，但是多醣類也相當容易誘生抗體，核酸比較不容易直接產生免疫反應 (或者如下所述，採用 DNA 疫苗免疫方式)。若知道抗原分子的胺基酸序列，可以用電腦找出最具抗原性的片段，大約 10~20 個胺基酸長度，以人工合成出來後接到大分子 carrier 上，經免疫動物誘生抗體，稱之為 單專一性抗體 (monospecific Ab)。

4) 有人直接取出健康的脾細胞，在培養中加入抗原進行體外免疫；或打開腹腔直接在脾臟注射抗原免疫。 近來更流行以抗原的 DNA 種入肝臟中，以此 DNA 的表現產物，直接在生物體內誘發免疫反應 (DNA vaccine)。 但除非抗原來源困難或有其它目的，我們仍採行舊法，因免疫反應的啟動機制非常複雜，生物整體的免疫反應還是最可靠。

5) 注意抗原的用量要適當，抗原用量太高，反而無法誘導出高親和力的抗體。

3B) 骨髓癌細胞 (NS-1)：

NS-1 是穩定的小白鼠 BALB/c 癌細胞株，除了能在培養基中永續生長外，尚有一重要特性，其細胞缺乏兩種核酸代謝的重要酵素 (TK, thymidine kinase 及 HGPRT, hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)。一般細胞內的核酸合成路徑有兩條，如下圖所示：

核酸的 正常代謝途徑 若被 aminopterin 阻礙，可由 救急途徑 (salvage pathway) 取用 thymidine (T) 及 hypoxanthine (H) 來合成 DNA。但 NS-1 缺乏 TK 及 HGPRT 兩種酵素，因此在 aminopterin (A) 存在下 NS-1 無法生長；正常細胞 (如 B 細胞) 則可經救急途徑繼續生長。HAT 培養基含 aminopterin, thymidine 及 hypoxanthine，NS-1 在 HAT 中無法生長，除非經由細胞融合導入 TK 及 HGPRT 兩酵素的基因 (可由正常脾臟細胞得來)。

3C) 細胞融合：

小白鼠脾臟細胞 B 與 NS-1 細胞 N 以 PEG 進行融合，操作在 10 min 內完成 (如下圖)，隨即把細胞平均分配在 96 槽細胞培養盤 中 (上圖)。

由於融合是隨機的，故可能的組合有：B-N, B-B, N-N, B-B-B, B-B-N....；只有同時含有 B 與 N 的融合細胞才會活下去：

1) 若只含 NS-1 (N, N-N.....)，則在 HAT 中會因 DNA 合成抑制而死亡。

2) 若只含脾細胞 (B, B-B, B-B-B......)，則在體外培養會漸漸死去。

3) 可能活下去的細胞 (B-N, B-B-N, N-N-B.....) 含有來自兩方的染色體，同源染色體可能發生基因重組，互換遺傳訊息；接下去的細胞分裂會排除多餘的染色體，一直到只剩一組染色體時才告穩定。在初期的分裂增殖過程中，失去含有重要基因染色體的子細胞可能會死去。成功穩定的融合細胞株會經由染色體的重組，得兼有雙方的特性：即可分泌抗體，亦可在培養基 HAT 中生長下去。

3D) 細胞融合的注意要點：

1) NS-1 要健康，在 T-80 培養瓶內生長密度不要超過六成，一瓶 T-80 細胞用在一次融合。脾細胞取出後可以不用除去紅血球，直接以 RPMI 洗三次，要小心自行調整 離心力 不致太大，也不能太小，隨時鏡檢之。

2) 要用可靠的 PEG 1500，可使用商品已配置好的溶液，每次 0.7~1 mL；否則自己要試出可用的批次，在高壓滅菌時，儘量縮短滅菌時間 (5 min 足夠)，並且要儘速由滅菌釜內取出。

3) 把 NS-1 與脾細胞混合，每次使用一個 T-80 與一個脾臟，幾乎可以不用數細胞數目；在 50 mL 離心管中，小心把細胞離心下來，倒去上清後，以殘留的 RPMI 把細胞打散，放在 37℃內保溫準備加入 PEG。

4) 在 2 min 內慢慢加入 PEG，同時一邊輕輕搖動，讓 PEG 均勻地混合細胞。然後在 2 min 內加入 2 mL RPMI，邊加邊混勻 (如上圖)；然後於接下來 2 min 內，再加 8 mL RPMI。此時鏡檢可看到許多細胞聚合，如下圖黑白照片；若在融合後 1 h 看不到很多融合細胞，可能已經失敗。

5) 離心去掉上清，輕輕加入 30 mL HAT-RPMI，均勻懸濁細胞。此步驟最為關鍵，離心力不可過大，以免把 剛融合的脆弱細胞壓成一塊；若你無法輕易而均勻地把細胞懸濁，就已經失敗。

6) 把細胞放在保溫箱 30 min 後，均分到三片 96 孔培養盤，每槽加三~四滴，分配要平均。

7) 從第二天起就不再用 HAT，改用 HT-RPMI 即可。添加或換培養液時，不要擾動細胞，並且不要在培養箱外面放置太久。 第二或第三天鏡檢可以看到很多二元體，是融合後的第一次分裂；這種二元體數目應該很多，培養槽內到處都會冒出來 (約 25 至 50 對)，可以用『雨後春筍』來形容之，否則可能已經失敗。

8) 但細胞仍迅速死亡，最後每槽只剩下一或二個穩定細胞群落，約一週內可看到如下面彩色圖片所示的細胞堆，此時 開始進行 ELISA 篩選。

3E) 篩選方法：

1) 初步篩選： 融合後馬上以 HAT 培養，能活下來的都是上述 B 細胞與 NS-1 的正確融合細胞，但此時細胞的 遺傳背景 尚未十分穩定。

2) 篩選專一性抗體： 並非所有 B 細胞都會產生我們所要的抗體，小白鼠原先就存在許多 B 細胞株對抗一般疾病；因此要用 酵素免疫分析法 (ELISA) 挑出專一性抗體 (請見下面圖解)。

3) 免疫轉印： 也可以收集細胞培養液，抗原以電泳分離後轉印，直接進行 免疫染色。

4) 單株化 (次選殖 subcloning)：這樣所挑出來的細胞株，也許仍含有兩群以上的細胞 (為什麼？)，因此要進行單株化 。先將該細胞株稀釋，重新平分到 96 槽細胞培養盤中，計算使得每槽中只含一個細胞，俟其生長成群落後，再次以 ELISA 篩選專一性抗體。請見下圖次選殖流程。

單株化是要確定每個細胞株的純系，因為細胞可能還會變化，成為不產生專一性抗體者，如上圖最右邊的灰色 3 號細胞。一般使用限數稀釋法進行，細胞的數目可用 cell counter 數得，並且稀釋到所要的濃度，例如 每 mL 含有 100 個細胞，若只要取一個細胞放到一個培養槽中，那麼你應該吸取多少 mL？ (0.01 mL)

3F) 抗體生產：

1) 可把挑選出來的融合細胞打入小鼠腹部，誘生腫瘤，然後以 針頭 收集所產生的 腹水，通常可取得 15 mL 左右；腹水中的抗體濃度非常高，每 mL 可達數 mg。 因為這個方法造成實驗動物極大痛苦，很多國家禁用；若非得使用不可時，要儘可能減低動物受苦。

2) 把融合細胞在大型培養槽中培養，收集培養液上清即得抗體，但每 mL 只得約數 mg，濃度較腹水稀約一千倍。最近有一種細胞培養瓶，可產生如腹水般濃度的上清，但價格極為昂貴。

3) 得到穩定的抗體後，通常要再以 ELISA 方法 檢定該抗體的 subclass 是屬於 IgG, IgM 或 IgA 等。 免疫時間太短的，較可能取得 IgM，但一般仍以 IgG 較多，注意 IgG 又可分成幾種 sub-subclass。

4) 所得到的抗體再經純化步驟，以除去雜質，可用下列各種方法的組合︰

硫酸銨分劃： 收集約 40% 飽和度的沉澱，是最經濟、方便的方法。 

離子交換法： 用 DEAE 陰離子交換法，多用在純化 IgG。

膠體過濾法： 以分子量的差異分劃出各種抗體，多用在純化 IgM。

親和層析法： 以 Protein A-吸著劑 專一性地吸住抗體分子 (IgG)。

▲

總 結：

當單株抗體剛被發展出來時，人們因為它像 巡弋飛彈 般的準確性，而對其應用於 癌症的治療 方面抱以極高的希望；但是二十年來，並無突破性的進展。主要的原因，並不是單株抗體無法攻擊癌細胞，或者是單株抗體的專一性不夠；原因之一乃是癌細胞的變化實在太大，無法找出各種癌細胞的共同抗原，以製成通用的抗癌單株抗體。

雖然如此，單株抗體並沒有失去其科學上或醫療上的價值，它仍然是一個極為 有用的工具，可以辨認分子上細微的差異，而被應用在很多其他方面；是目前生物技術產業中，極重要且獲利率高的一項，尤其在未來的『蛋白質晶片』應用， 對整個 蛋白質體學 的研究，可能會有很重要的貢獻 (參閱：蛋白質體與單株抗體工具)。

近十年來，由於基因操作技術的發達，單株抗體因為其基因的修飾剪接，得以改造成各種形式，以致更適合於人體使用；同時，基礎醫學對癌症研究也有長足發展，單株抗體因此又受到重用，請見 Scientific American (October 2001): Magic Bullets Fly Again，是單株抗體的全新熱潮。

下圖是整個細胞融合及單株抗體生產的摘要流程：

請注意為何使用傳統抗血清會有 交叉反應，而單株抗體如何克服此一缺點 (上圖右側部份)；另外，上圖左側部份說明細胞融合方法，以及單株抗體如何篩選及生產。  pdf  下載

其他相關技術：

基因操作方法也可以應用在單株抗體的生產上，稱為 噬菌體表現 (phage display)。當單株細胞被挑選出來之後，可以分離出組成抗體 輕鏈 (L) 及 重鏈 (H) 的 mRNA，把他們的 變異區 (V_L 及 V_H) 逆轉錄成 cDNA 後，以連接片段 (F_v) 接起來，並植入噬菌體 M13 的外殼蛋白基因中，就可以去感染大腸菌，並且繁殖大量 M13 噬菌體，就會在其外殼表現出所植入的抗體 V_L + V_H 片段，這是抗體最重要的抗原結合區；因為這種片段保留了抗原結合區，但沒有其他的 Fc 部份，因此可以應用在很多方面。

除了如上述直接表現出抗體的結合區之外，在製備 cDNA 的時候，可以用點突變 (結合 PCR) 的方式，隨機地改變任意鹼基以造成多樣性，可產生更多變的 cDNA 庫，再由所產生的突變蛋白質中，挑選可能的變種抗原結合區，也許有更強或較特殊的親和力。另外，利用基因片段的洗牌 (chain shuffling)，也可以重新組合不同的輕鏈與重鏈，以求得到更好的組合。

不使用蛋白質為抗原，改用其基因打入免疫動物的細胞核中，並在其細胞中直接轉譯出蛋白質，以便誘發免疫反應。請連結 生物技術 - 免疫治療法。

▲

References

◆ Ezzell C (2001) Magic Bullets Fly Again. Scientific American 285 (Oct), 28~35 (單株抗體新熱潮)

◆ Milstein C (1980) Monoclonal Antibodies. Scientific American 243 (Oct), 56~64

◆ Roitt I, Brostoff J, Male D (2001) Immunology. 6th ed, Mosby (最暢銷的基礎免疫學課本)

◆ 實際操作方法可參考『水稻蔗糖合成 酶之研究』莊榮輝博士論文 (1985 台大農化系) 88~105  pdf  

◆ Richard A. Goldsby et al (2018) Kuby Immunology (4e) 免疫學課本 (Amazon)

◆ 莊榮輝 (1984) 迷爾使呆與突魔大王 (單株抗體的童話故事) 台大農化 33, 65~69

◆ 莊榮輝 (1990) 細胞大戰 (人體免疫的童話故事) 台大農化 38, 54~58

◆ 莊榮輝 (2000) 生物技術簡介 單株抗體 (介紹生物技術新知的網頁) 

◆ 莊榮輝 (2018) 酵素純化與分析 8.3 免疫學工具 (介紹生物技術新知的網頁) 

莊榮輝開授相關課程資訊

建立日期：2000/4/15； 更新日期： 2018/09/19 

本網頁資料隨時在編修中 © 版權所有

▲