生物化學基礎 Biochemistry Basics 2008

酵素 Enzyme (5)

細胞與分子 - 胺基酸 - 蛋白質 - 核 酸

酵 素 - 生物技術

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1  酵素的命名

2  酵素的構成

3  酵素動力學

4  酵素的抑制

5  酵素催化機制

6  酵素活性調節

7  細胞代謝調控

8  生物技術應用

5  酵素的催化機制

5.1  酵素活性區

5.2  協同式催化機制

5.3  順序式催化機制

5.4  酵素的專一性

5.4.1  專一性結合區

5.4.2  專一性結合力量

5.4.3  立體專一性

問題集  (5)

Chymotrypsin 的奇妙催化機制

 Wikipedia  

Enzyme

Mechanism

Serine protease

Chymotrypsin

Protein interaction

■ 酵素 5

■ 相關投影片

5  酵素動力學：

酵素的催化機制可以化學反應逐步推得，與分子的構造也有相當大的關係。

5.1 酵素活性區 (active site)：

催化反應都在活性區內進行，活性區可提供有利催化的環境。

 a. 活性區：是酵素與其基質 (或輔脢) 的結合區，並在此進行催化反應。活性區通常是一凹陷袋狀構造，水分子不易進入袋中。活性區內的胺基酸，只有那些具反應性基團 (reactive group) 者，才直接參與催化；但各種胺基酸都有可能參與結合基質。

 b. 酵素催化的化學機制，通常是以下面三種基本方式進行反應：

(1) Bond strain：基質結合到酵素後，酵素的構形扭曲，使基質分子內某共價鍵受力斷裂。

(2) Acid-base：利用活性區內胺基酸殘基或輔脢，可以放出或接受質子 (或電子) 的特性，對基質進行質子或電子的轉送。

(3) Orientation：活性區可提供基質適當的排列空間，使有利於反應進行。

以上三種方式或可同時發生，為協同式 (concerted set)；亦可先後依序發生，稱順序式 (sequential mechanism)。以下兩個重要例子都是蛋白脢。

投影片 E5

E5-1

E5-2

E5-3

E5-4

E5-5

以 chymotrypsin (CT, 胰凝乳蛋白脢) 為代表，請找出課本的相關圖片。

 a. 分子構造：CT 的分子量為 25 kD，含三條胜肽，由兩個雙硫鍵連接，是轉譯後修飾的產物；剛轉譯出來的完整胜肽鏈沒有活性，要在接近 N-端的 Arg15 與 Ile16 之間先斷開後，CT 才能活化。

 b. 催化活性：CT 可水解胜肽鏈上面的芳香族胺基酸 (Tyr, Phe, Trp) 或 Met (具較大非極性基團者)，切開這些胺基酸 C-側的胜鍵，是一種內切脢。

 c. 活性區：CT 大部分的極性胺基酸都露在分子外表，只有三個在活性區內，對催化反應扮重要角色 (Ser195, His57, Asp102)。三者以『電荷接力』形成高反應性 Ser，其 Ser195-OH 基上的 H⁺ 被鄰近的 His57 吸收，生成具有高反應性的 -O ^-。

◆ Chymotrypsin 活性區鐵三角  (以動畫呈現活性區之生成)

 圖 4  Ser 蛋白脢催化區上由三個胺基酸所構成的電荷接力

d. 催化機制：Ser上的高反應性  -O^- 會攻擊基質胜肽上的 carbonyl 碳 (帶微正電)，形成新的 C-O 鍵 (acylation 步驟)，同時斷開基質的胜鍵，先釋出一段 C-側的胜肽；然後加水分解，破壞此 C-O 鍵 (deacylation 步驟)，釋出另一段 N-側胜肽。以上兩個步驟，依次順序發生。

◆ Chymotrypsin 催化機制  (以動畫呈現上述之催化動作)

 e. 穩定過渡狀態：除了 catalytic triad 可以有效催化之外，活性區也可穩定催化反應的中間過渡狀態。過渡狀態有相當高的負電荷，因此以活性區附近的 Gly193 及 Ser195 本身的 -N-H 與之產生氫鍵而中和之。

 f. Ser 蛋白脢家族：這種以 Ser 為催化主力的蛋白脢很多，統稱為 serine 型蛋白脢；除了 chymotrypsin 外，尚有許多如 trypsin (胰蛋白脢)、elastase (彈性蛋白脢)。它們的催化機制相似，整體構形相當類似，且都有 [Ser-His-Asp] 接力形式的催化機構。但對基質的專一性不同，trypsin 的基質為鹼性胺基酸 (Lys, Arg)，elastase 則只切 R 基團較小且不帶電荷者。

酵素只與特定的基質結合，有很高的專一性，這是酵素重要特性之一。

5.4.1 專一性結合區：

大部份酵素的活性區即有專一性辨識與結合基質能力，但CT另有一基質的辨識區位在其活性區附近。

 a. 上述各 Ser 型蛋白脢的活性區除了有 [Ser-His-Asp] 催化中心外，附近還有一個袋狀的基質結合區，可以辨別基質的種類 (驗明正身)，以便與正確的胺基酸結合。

 b. 這種專一性結合是靠結合區上胺基酸 R 基團的形狀、大小、極性或電荷等性質的契合，以二級鍵結合。例如 chymotrypsin 的結合區多含非極性的胺基酸，故只能與非極性的芳香族胺基酸結合，催化這類胺基酸的水解。改變結合區的重要胺基酸，可能改變專一性 (Science, 1992, 255: 1249)。

5.4.2 專一性結合力量：

有兩大類構成因素，一是形狀的互補，另一是吸引力量。 (參考 蛋白質 2.3)

 a. 分子間構形互補：如『鎖頭與鑰匙 lock & key』在形狀的契合；而蛋白質分子有彈性，與基質結合可誘生更契合的構形，稱為 induced fit。因構形互補而吸引的主要力量來自凡得瓦爾力，如圖 5 中 A 與 B 之間的契合。

 b. 酵素與基質間會產生吸引力量，是由兩者間的若干二級鍵所共同組成。

  圖 5  兩分子間構形互補

5.4.3 立體專一性：

酵素分子如何辨認立體異構物？ 碳的原子軌道是根本原因。 (參考 細胞與分子 圖 4)

 a. 酵素可辨認基質的立體不對稱性，只能對某一種立體異構物有催化反應 (如 L 或 D 型胺基酸之一)，而生成物也只有對應的立體異構物之一。

 b. 如圖 6 把基質分子中不對稱碳 (sp³) 四個鍵結中的一點 (A) 固定，再以酵素的專一性結合面 (深綠色) 接觸並確認 B-C-D 三點，就能分辨另一異構物的差異 (例如 B-D-C) 而排斥之 (從 A 點往下看即可分出差異，如圖 7)。

圖 6  碳原子四面體	圖 7  不對稱碳鍵結排列的立體差異

■■■ 增補幾個酵素催化機制的實例   下載連結：[Enz(5A) 2008.PPT]

問題集   以下包含酵素部份的全部問題。題目不一定有標準答案，甚至會引起很大的爭議，但這就是問題集之目的。

 1. Carboxypeptidase A 分子的活性區需要一個 Zn 離子，請問此金屬離子有何作用？

 2. 酵素活性區的構形與下列三者何者較能互補？請說明為何？ 基質 生成物 過渡狀態

 3. 為何維持正確的酸鹼度 pH，對某些酵素的活性非常重要？有無酵素不受 pH 影響？

 4. 抗體與其抗原極類似酵素及基質，有很強的專一性，但並無酵素的催化作用；而 catalytic antibody (或 abzyme) 為特別設計產生的抗體，可使抗體具有催化的性質。若有反應如︰A＋B → A-B，而你要設計能催化此反應的抗體 (A 與 B 均為小分子)。

a) 你將以何種分子為抗原？詳細說明原因。 (hint: 為何酵素具有催化能力？)

b) 在進行免疫時，應當注意那些事項？

 5. 為何 chymotrypsinogen 分子要先經過裂解後，才會變成活性型？

 6. Chymotrypsin 如何穩定所催化基質的中間過渡狀態？

 7. Chymotrypsin 的 His57 對其催化機制有何貢獻？His57 如何受到環境 pH 的影響？

 8. 已知 DPF (diisopropyl phosphofluoridate) 是 Ser protease 的專一性抑制劑，如何證明 DPF 是攻擊酵素的活性區？

 9. 大部份 proteases 似乎都有相類似的水解機制，請說明此一核心機制。

10.胜肽鏈上可被 trypsin 專一性水解的胺基酸有哪兩種？

11.請判斷下列各題的真偽： (並說明原因)

 a) 水溶性蛋白質的疏水性胺基酸大都在分子的裡面，故酵素分子內部不可有親水性胺基酸，以防止分子變性。

 b) 只要含有二十種基本胺基酸基團，蛋白質就可以完全發揮酵素的催化機制。

 c) Carboxypeptidase A 是一種外切脢，可切除蛋白質 C-端的非極性胺基酸，它可以與 a-COOH 結合來辨識是否為 C-端。

 d) Ser proteases 都有由 Asp-His-Ser 組成的 triad，可產生一具高反應性的 -O^- 基。

 e) 酵素催化反應進行的過程中，酵素與基質或產物之間，都不能有共價鍵生成，這才能稱為催化。

 f) 蛋白脢催化過程中，所形成過渡狀態有過多正電荷，要用氧原子上的電子中和之。

 g) 剛轉譯出來的完整 chymotrypsin，其催化活性很低，是因為無法穩定過渡狀態。

 h) 一般酵素的活性區與專一性辨認區都不在同一位置，以便增加專一性。

 i) 兩個蛋白質間的專一性結合，其構形的互補是重要條件之一，乃因於凡得瓦爾力。

 j) 以下配對都是專一性吸引力所造成：酵素-基質、酵素-輔脢、荷爾蒙-受體。

12.是非選擇題 (答案寫在□內，是→○、非→╳)

 a) 何者為 Ser protease 家族？ □ Subtilisin  □ 凝血因子 VIII  □ Acetylcholinesterase  □ Elastase  □ Thrombin

 b) 何者為酵素的不可逆抑制劑？ □ Penicillin  □ PCMB  □ DFP  □ EDTA  □ 磺胺藥  □ cAMP

 c) 改變下列那個胺基酸後會影響 chymotrypsin 的活性：□ Asp102  □ His57  □ Ser14  □ Ile16  □ C-terminal

 d) 可構成兩個分子間的專一性吸引力的力量有那些： □ 氫鍵  □ 疏水鍵  □ 雙硫鍵  □ 凡得瓦爾力  □ 離子鍵  □ 分子間構形互補

 e) 有關立体專一性何者為真？ □ 碳原子的 sp³ 軌道是主因  □ 自然界中多使用 L-胺基酸  □ 單糖分子並無立体異構物  □ 酵素可分辨基質立体異構物

13.請簡單解釋以下名詞：Abzyme, Metabolomics, Ribozyme, Proteasome, Specific activity