生物化學基礎 Biochemistry Basics 2008

酵素 Enzyme (5)

細胞與分子 - 胺基酸 - 蛋白質 - 核 酸

酵 素 - 生物技術

回首頁

講義下載

     

 

1  酵素的命名

2  酵素的構成

3  酵素動力學

4  酵素的抑制

5  酵素催化機制

6  酵素活性調節

7  細胞代謝調控

8  生物技術應用

5  酵素的催化機制

5.1  酵素活性區

5.2  協同式催化機制

5.3  順序式催化機制

5.4  酵素的專一性

5.4.1  專一性結合區

5.4.2  專一性結合力量

5.4.3  立體專一性

問題集  (5)

Chymotrypsin 的奇妙催化機制

 Wikipedia

Enzyme

Mechanism

Serine protease

Chymotrypsin

Protein interaction

 

     

酵素 5

相關投影片

5  酵素動力學:

酵素的催化機制可以化學反應逐步推得,與分子的構造也有相當大的關係

5.1 酵素活性區 (active site):

催化反應都在活性區內進行,活性區可提供有利催化的環境。

 a. 活性區是酵素與其基質 (或輔脢) 的結合區,並在此進行催化反應。活性區通常是一凹陷袋狀構造,水分子不易進入袋中。活性區內的胺基酸,只有那些具反應性基團 (reactive group) 者,才直接參與催化;但各種胺基酸都有可能參與結合基質。

 b. 酵素催化的化學機制,通常是以下面三種基本方式進行反應:

(1) Bond strain:基質結合到酵素後,酵素的構形扭曲,使基質分子內某共價鍵受力斷裂。

(2) Acid-base:利用活性區內胺基酸殘基或輔脢,可以放出或接受質子 (或電子) 的特性,對基質進行質子或電子的轉送。

(3) Orientation:活性區可提供基質適當的排列空間,使有利於反應進行。

以上三種方式或可同時發生,為協同式 (concerted set);亦可先後依序發生,稱順序式 (sequential mechanism)。以下兩個重要例子都是蛋白脢。

 

 

投影片 E5

 

E5-1

 

 

 

E5-2

 

 

 

 

 

 

E5-3

 

5.2 協同式催化機制:

以 carboxypeptidase A (CPA, 羧肽脢) 為模型酵素說明 (圖 3)。

 a. CPA 的分子量 34 kD,含 307 個胺基酸,有一雙硫鍵,及一個鋅離子,是一種金屬蛋白脢。 CPA 可由胜肽的C-端,依序切下外側胺基酸 (外切脢),當胺基酸的 R 基團為非極性者,較有利反應進行;而 carboxypeptidase B (CPB) 只切 C-端為 Lys 或 Arg 者,二者專一性不同。

 圖 3  Carboxypeptidase A 的催化機制

 Carboxypeptidase 催化機制  (以動畫呈現上圖之催化動作)

b. CPA 的詳細催化機制如圖 3 所示,並加說明於下: (括號內數字與圖 3 中對應)

(1) Zn2+ 離子乃重要輔助因子,可吸住基質胜肽鍵上的 carbonyl 基,增強其極性,使 a 碳帶正電。

(3) Glu270 吸住水分子,放出 OH- 攻擊 C+ (2),產生新的 C-OH 鍵。

(4) Tyr248-OH 上的質子,與氮 lone pair 電子產生新鍵,原來的胜鍵斷裂。

(5) 附近的胺基酸與基質 C-端的 R 基團,有專一性的結合,以辨別基質的極性;同時 Arg145 與基質 C-端的 -COOH 結合,確定基質蛋白質是以 C-端進入活性區。

 

 

 

 

E5-4

E5-5

5.3 順序式催化機制:

以 chymotrypsin (CT, 胰凝乳蛋白脢) 為代表,請找出課本的相關圖片。

 a. 分子構造:CT 的分子量為 25 kD,含三條胜肽,由兩個雙硫鍵連接,是轉譯後修飾的產物;剛轉譯出來的完整胜肽鏈沒有活性,要在接近 N-端的 Arg15 與 Ile16 之間先斷開後,CT 才能活化。

 b. 催化活性:CT 可水解胜肽鏈上面的芳香族胺基酸 (Tyr, Phe, Trp) 或 Met (具較大非極性基團者),切開這些胺基酸 C-側的胜鍵,是一種內切脢。

 c. 活性區:CT 大部分的極性胺基酸都露在分子外表,只有三個在活性區內,對催化反應扮重要角色 (Ser195, His57, Asp102)。三者以『電荷接力』形成高反應性 Ser,其 Ser195-OH 基上的 H+ 被鄰近的 His57 吸收,生成具有高反應性的 -O -

 Chymotrypsin 活性區鐵三角  (以動畫呈現活性區之生成)

 圖 4  Ser 蛋白脢催化區上由三個胺基酸所構成的電荷接力

d. 催化機制:Ser上的高反應性  -O- 會攻擊基質胜肽上的 carbonyl 碳 (帶微正電),形成新的 C-O 鍵 (acylation 步驟),同時斷開基質的胜鍵,先釋出一段 C-側的胜肽;然後加水分解,破壞此 C-O 鍵 (deacylation 步驟),釋出另一段 N-側胜肽。以上兩個步驟,依次順序發生。

 Chymotrypsin 催化機制  (以動畫呈現上述之催化動作)

 e. 穩定過渡狀態:除了 catalytic triad 可以有效催化之外,活性區也可穩定催化反應的中間過渡狀態。過渡狀態有相當高的負電荷,因此以活性區附近的 Gly193 及 Ser195 本身的 -N-H 與之產生氫鍵而中和之。

 f. Ser 蛋白脢家族:這種以 Ser 為催化主力的蛋白脢很多,統稱為 serine 型蛋白脢;除了 chymotrypsin 外,尚有許多如 trypsin (胰蛋白脢)、elastase (彈性蛋白脢)。它們的催化機制相似,整體構形相當類似,且都有 [Ser-His-Asp] 接力形式的催化機構。但對基質的專一性不同,trypsin 的基質為鹼性胺基酸 (Lys, Arg),elastase 則只切 R 基團較小且不帶電荷者。

 

 

E5-7

E5-8

 

 

E5-14

E5-15

E5-9

 

E5-11

E5-13

 

E5-10

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

E5-16

E5-17

 

E5-18

E5-21

E5-22

 

5.4 酵素的專一性:

酵素只與特定的基質結合,有很高的專一性,這是酵素重要特性之一。

5.4.1 專一性結合區:

大部份酵素的活性區即有專一性辨識與結合基質能力,但CT另有一基質的辨識區位在其活性區附近。

 a. 上述各 Ser蛋白脢的活性區除了有 [Ser-His-Asp] 催化中心外,附近還有一個袋狀的基質結合區,可以辨別基質的種類 (驗明正身),以便與正確的胺基酸結合。

 b. 這種專一性結合是靠結合區上胺基酸 R 基團的形狀、大小、極性或電荷等性質的契合,以二級鍵結合。例如 chymotrypsin 的結合區多含非極性的胺基酸,故只能與非極性的芳香族胺基酸結合,催化這類胺基酸的水解。改變結合區的重要胺基酸,可能改變專一性 (Science, 1992, 255: 1249)。

5.4.2 專一性結合力量:

有兩大類構成因素,一是形狀的互補,另一是吸引力量。 (參考 蛋白質 2.3)

 a. 分子間構形互補:如『鎖頭與鑰匙 lock & key』在形狀的契合;而蛋白質分子有彈性,與基質結合可誘生更契合的構形,稱為 induced fit。因構形互補而吸引的主要力量來自凡得瓦爾力,如圖 5 中 A 與 B 之間的契合。

 b. 酵素與基質間會產生吸引力量,是由兩者間的若干二級鍵所共同組成。

  圖 5  兩分子間構形互補

5.4.3 立體專一性:

酵素分子如何辨認立體異構物? 碳的原子軌道是根本原因。 (參考 細胞與分子 圖 4)

 a. 酵素可辨認基質的立體不對稱性,只能對某一種立體異構物有催化反應 (如 LD 型胺基酸之一),而生成物也只有對應的立體異構物之一。

 b. 如圖 6 把基質分子中不對稱碳 (sp3) 四個鍵結中的一點 (A) 固定,再以酵素的專一性結合面 (深綠色) 接觸並確認 B-C-D 三點,就能分辨另一異構物的差異 (例如 B-D-C) 而排斥之 (從 A 點往下看即可分出差異,如圖 7)。

 圖 6  碳原子四面體

  圖 7  不對稱碳鍵結排列的立體差異

增補幾個酵素催化機制的實例   下載連結[Enz(5A) 2008.PPT]

 

 

 

 

 

 

 

E5-23

E5-24

E5-25

E5-26

E5-27

E5-28

 

 

 

 

P5-18

 

 

E5-29

C1-9

 

問題集   以下包含酵素部份的全部問題。題目不一定有標準答案,甚至會引起很大的爭議,但這就是問題集之目的。

 1. Carboxypeptidase A 分子的活性區需要一個 Zn 離子,請問此金屬離子有何作用?

 2. 酵素活性區的構形與下列三者何者較能互補?請說明為何? 基質 生成物 過渡狀態

 3. 為何維持正確的酸鹼度 pH,對某些酵素的活性非常重要?有無酵素不受 pH 影響?

 4. 抗體與其抗原極類似酵素及基質,有很強的專一性,但並無酵素的催化作用;而 catalytic antibody (或 abzyme) 為特別設計產生的抗體,可使抗體具有催化的性質。若有反應如︰A+B → A-B,而你要設計能催化此反應的抗體 (A 與 B 均為小分子)。

a) 你將以何種分子為抗原?詳細說明原因。 (hint: 為何酵素具有催化能力?)

b) 在進行免疫時,應當注意那些事項?

 5. 為何 chymotrypsinogen 分子要先經過裂解後,才會變成活性型?

 6. Chymotrypsin 如何穩定所催化基質的中間過渡狀態?

 7. Chymotrypsin 的 His57 對其催化機制有何貢獻?His57 如何受到環境 pH 的影響?

 8. 已知 DPF (diisopropyl phosphofluoridate) 是 Ser protease 的專一性抑制劑,如何證明 DPF 是攻擊酵素的活性區?

 9. 大部份 proteases 似乎都有相類似的水解機制,請說明此一核心機制。

10.胜肽鏈上可被 trypsin 專一性水解的胺基酸有哪兩種?

11.請判斷下列各題的真偽: (並說明原因)

 a) 水溶性蛋白質的疏水性胺基酸大都在分子的裡面,故酵素分子內部不可有親水性胺基酸,以防止分子變性。

 b) 只要含有二十種基本胺基酸基團,蛋白質就可以完全發揮酵素的催化機制。

 c) Carboxypeptidase A 是一種外切脢,可切除蛋白質 C-端的非極性胺基酸,它可以與 a-COOH 結合來辨識是否為 C-端。

 d) Ser proteases 都有由 Asp-His-Ser 組成的 triad,可產生一具高反應性的 -O- 基。

 e) 酵素催化反應進行的過程中,酵素與基質或產物之間,都不能有共價鍵生成,這才能稱為催化。

 f) 蛋白脢催化過程中,所形成過渡狀態有過多正電荷,要用氧原子上的電子中和之。

 g) 剛轉譯出來的完整 chymotrypsin,其催化活性很低,是因為無法穩定過渡狀態。

 h) 一般酵素的活性區與專一性辨認區都不在同一位置,以便增加專一性。

 i) 兩個蛋白質間的專一性結合,其構形的互補是重要條件之一,乃因於凡得瓦爾力。

 j) 以下配對都是專一性吸引力所造成:酵素-基質、酵素-輔脢、荷爾蒙-受體。

12.是非選擇題 (答案寫在內,是→○、非→╳)

 a) 何者為 Ser protease 家族? Subtilisin  凝血因子 VIII  Acetylcholinesterase  Elastase  Thrombin

 b) 何者為酵素的不可逆抑制劑? Penicillin  PCMB  DFP  EDTA  磺胺藥  cAMP

 c) 改變下列那個胺基酸後會影響 chymotrypsin 的活性: Asp102  His57  Ser14  Ile16  C-terminal

 d) 可構成兩個分子間的專一性吸引力的力量有那些: 氫鍵  疏水鍵  雙硫鍵  凡得瓦爾力  離子鍵  分子間構形互補

 e) 有關立体專一性何者為真? 碳原子的 sp3 軌道是主因  自然界中多使用 L-胺基酸  單糖分子並無立体異構物  酵素可分辨基質立体異構物

13.請簡單解釋以下名詞:Abzyme, Metabolomics, Ribozyme, Proteasome, Specific activity

 

 

 

 

本網頁最近修訂日期: 2017/02/19