生物化學基礎 Biochemistry Basics 2008

酵素 Enzyme (3, 4)

細胞與分子 - 胺基酸 - 蛋白質 - 核 酸

酵 素 - 生物技術

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1  酵素的命名

2  酵素的構成

3  酵素動力學

4  酵素的抑制

5  酵素催化機制

6  酵素活性調節

7  細胞代謝調控

8  生物技術應用

3  酵素動力學

3.1  酵素催化反應

3.2  酵素動力學

3.2.1  基本概念

3.2.2  Michaelis-Menten 公式推演

3.2.3  Michaelis-Menten 公式意義

3.2.4  VmaxKm 的測定與意義

3.2.4.1  VmaxKm 測定法

3.2.4.2  Km 的意義

3.2.4.3  Vmax 的意義

3.2.4.4  酵素活性定義

3.3  雙基質反應

4  酵素的抑制

4.1  酵素的抑制方式

4.2   不可逆的抑制

問題集  (3, 4)

 

酵素的作用像分子機器

 Wikipedia

Enzyme

Transition state

Enzyme assay

Kinetics

Michaelis-Menten

Enzyme inhibitor

HIV protease

 

     

酵素 3, 4

相關投影片

3  酵素動力學:

動力學可以公式說明酵素對基質分子的催化行為。

3.1 酵素催化反應:

酵素提供基質一個穩定的空間,有利於穩定其過渡狀態,並快速轉變成為生成物。

 a. 反應物 (A, B) 轉變成生成物 (A-B) 途中,有過渡狀態 [A...B] 生成:

A + B → [A...B] → A-B

 b. 過渡狀態 (transition state) 的位能較高,其生成需要耗費能量,稱為活化能 (activation energy, Eact);經由酵素的催化,可降低反應活化能,使反應速率加快,但不影響反應的平衡方向。

 c. 一些過渡狀態的類似物 (analog) 會佔住酵素活性區,但無法完成反應,即成為抑制劑。若把這種過渡狀態的類似物做為抗原,免疫動物後所產生的抗體,可能有類似酵素的催化作用,但催化速率很低,稱為 abzyme (catalytic antibody)。

 d. 酵素降低活化能的機制有以下幾點,都是因於活性區的特殊立體構造所致:

(1) 酵活性區專一性地與基質結合,提供最適的空間排列,以便穩定過渡狀態。

(2) 活性區通常為一凹陷口袋,隔開外界的水環境,減低水分子的干擾。

(3) 活性區附近的某些胺基酸可提供活性官能基 (通常帶有電荷) 直接參與反應。

(4) 很多酵素含有輔脢或輔因子,輔助反應 (見 2.2)。

◆ 圖 1 的酵素動力學大綱以流程圖方式,列出酵素動力學的主要探討項目;當研讀動力學部分時,請隨時依章節號碼參閱本圖。(圖中酵素的漫畫造型取自 Gonick, L. & Wheelis, M. 所著 The Cartoon Guide to Genetics, 有中譯版)

 圖 1  酵素動力學公式的推演及其應用

 

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3.2 酵素動力學:

動力學是如何進行的?先改變基質濃度,再看酵素的活性如何變化。

3.2.1 基本概念:

酵素動力學的形成,是根基於『過渡狀態濃度恆定』的基本概念。早在 1913 年,MichaelisMenten 就以轉化脢 (invertase) 系統為研究對象,發現有關酵素與基質反應的一些行為模式,他們提出:

 a. Steady state 理論:

酵素催化時基質先與酵素結合,生成過渡狀態,再轉變成產物。而酵素與基質的結合是可逆的 (E + S → ES);而當反應達穩定狀態 (steady state) 時,其中的 [ES] 濃度不變 (因為 ES 生成量等於其消失量)。

 b. 酵素行為的數學描述:

反應速率 (v) 與酵素或基質的關係,可以數學式表示;在固定的酵素量下,反應速率 v 與基質濃度 [S] 成雙曲線關係 (但只有股),可用公式表之,即 Michaelis-Menten (M-M) 動力學公式。

3.2.2 Michaelis-Menten 公式的推演:

由四個基本設定開始,可一步一步推得 M-M 動力學公式。

 a. 酵素 E 基質 S 反應如下,各步驟反應速率由常數 k1, k2, k3 表示:

 b. 導 M-M 公式前的四個基本關係及假設:

(1) 因 [ES] 不變,故 ES 的消耗量等於生成量: k2 [ES] + k3 [ES] = k1 [E][S]                                      (I)

(2) 總酵素濃度 [Et] = 單獨存在者 [Ef] + 酵素基質複合體 [ES]                                                            (II)

(3) 反應初速 (vo) 是由後半分解反應 (k3) 所決定: vo = k3 [ES]                                                           (III)

(4) 最大反應速率 (Vmax) 是假設所有酵素均轉變成 [ES], 故上式可改寫為︰ Vmax = k3 [Et]            (IV)

c. 基於上述條件,可推 M-M 公式如下:

投影片 E3b

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3.2.3 Michaelis-Menten 公式的意義:

M-M 公式可以求得 Vmax Km,求得 VmaxKm 有何意義?

 a. M-M 公式是雙曲線公式。若固定酵素量,改變其基質量 [S],則可得到不同的反應初速 vo,再以 [S] 為 x 軸, vo 為 y 軸作圖,可得到一股雙曲線,其漸近點為 Vmax

 b. 低濃度 [S] 時反應速率 vo 與 [S] 成正比,即 vo∼[S] 1,是為一級反應 (first order reaction);當 [S] 增大,vo 接近漸近線時,vo 的改變很小,不受 [S] 變化的影響,即 vo∼[S] 0,稱為零級反應 (zero order)。

 c. 若基質量 [S] 也固定,則 M-M 公式變為:

由 (IV) Vmax = k3 [Et],故 vo∼[Et],即反應速率與酵素量成正比。

 d. 事實上 ES → E + P 的反應為可逆,但此逆反應可忽略,因 M-M 公式的測定,是反應初期所測的反應初速 (vo),此時生成物 [P] 的濃度很低,逆反應幾乎無從發生。

◆ 練習以紙筆自行推演 M-M 公式及上述各種情況下的變化。

3.2.4 Vmax Km 的測定與意義:

Vmax Km 是每一個酵素極重要的性質指標,可以顯示其催化特性。

3.2.4.1 VmaxKm 測定法:

步驟相當單純,但隨著各種酵素活性測定方法的難易有別。動力學實驗的基本資料,為在一系列 [S] 濃度下所測得的反應初速 (vo),依法作圖即可求出 VmaxKm。有以下數種作圖求法:

 a. 直接作圖法:是最基本的數據作圖。以 [S] 為橫軸 vo 為縱軸,所得漸近線的最高處為 Vmax, 而 Km 則是內插計算 50% Vmax 時的 [S] 值。

 b. Lineweaver-Burk 雙倒數作圖法:是最常用的作圖方式。因直接作圖法只能以漸近估計求得 Vmax,若 x 及 y 軸分別改為 1/[S] 及1/vo,則可作出一條直線來,由 x 軸上的交點求出 1/Km,由 y 軸交點求出 1/Vmax

◆ 循一實例練習畫出動力學測定的直接作圖及其雙倒數作圖。並請注意 VmaxKm 的單位是什麼,為何會得到此種單位?

 c. Eadie-Hofstee 作圖法:雙倒數圖的直線,在接近 y 軸處,打點太密,求得直線稍有困難。 若分別以 vo/[S] 及 vo 為 x, y 軸,亦可畫出直線,且各點的分佈較平均。

The Use of the Eadie-Hofstee Plot for Determining Kinetic Parameters

3.2.4.2 Km 的意

Km 是酵素與基質間親和力的指標,Km 越大親和力越小。

 a. 當反應速率為 50% Vmax 時,vo = ½ Vmax,代入 M-M 公式,則得:

因此 Km 的意義表示,要達到一半最高催化速率時 [S] 所需濃度。

 b. 若某酵素的 Km 越低,則表示它要接近 Vmax 所需的基質濃度越低。若一酵素有數種基質,各有不同的 Km,則 Km 越低的基質,表示它與酵素的親和力越大,催化反應愈容易進行。Km 與 [S] 一樣是濃度單位 (mM 或 mM)。

 c. 酵素的 Km 值可看成在一般細胞內,該酵素基質的大約濃度。

3.2.4.3 Vmax 的意義:

請確實瞭解 Vmax = k3 [Et] 的意義 (公式 IV)。

 a. 在足夠的基質濃度下,一定量的酵素所能催化的最高反應速率,即為其 Vmax;要讓一個酵素達致其 Vmax,就要把基質量調至最高濃度。在比較不同酵素的 Vmax 活性時,要以同樣莫耳數的酵素分子為基準。

 b. 單位時間內每莫耳酵素所能催化的基質數 (莫耳數),稱為 turn over number (t.o.n.) 或 molecular activity,一般酵素約在 0.1~10,000 間 (每秒),速率快慢相差很大。當基質量極大於 Km 時 ([S] >> Km),反應推向右邊,E + S → ES → E + P,則 k3 成為決定因素,即為 turn over number,特標記為 kcat

 c. 當基質量遠小於 Km 時 (Km >> [S] 則 [Et] = [E] 而 Km + [S] = Km),則可以由 M-M 公式導得:

 

反應速率成為 second order,由 [E] 及 [S] 兩項因素決定之。 而 kcat/Km 常數的大小則為重要指標,同時顯示酵素的催化效率及專一性。

 d. 瞭解上述的 KmVmax 後,回顧最早的酵素與基質反應式:

若把此式分成兩半,前半是 E + S → ES 由 k1k2 主導;後半 ES → E + P 由 k3 主導。顯然 Vmax 是由後半反應決定 (記得 Vmax = k3 [Et]),而 Km 則大體上由前半反應所定。因此,整個酵素反應,是由這兩半反應所共同組成:前半以 Km 來決定酵素與基質的親和度,後半以生成物的產生來決定最高反應速率。注意 Km 的定義是 (k2 + k3) ÷ k1,故後半反應還是對 Km 有些影響。

3.2.4.4 酵素活性定義:

有兩種表示酵素活性的方式,請注意其定義不同,不要混淆。

 a. 活性單位:酵素活性的表示方法通常使用活性單位 (unit);即酵素每分鐘若催化 1 mmole 基質的活性,即定義為 1 單位活性;注意同一種酵素可能會有不同定義方式的活性單位。

 b. 比活性:每單位重量蛋白質 (mg) 中所含的酵素活性 (unit),稱為比活性 (specific activity, unit/mg);因酵素為活性分子,有時會失去活性,雖然蛋白質仍在,但比活性會下降。

 

 

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3.3 雙基質反應:

 a. 上述 S→P 催化反應,只有一種基質及一種生成物,稱為 Uni-Uni 反應。但事實上大多數酵素反應,有一個以上的基質,也可能有數個生成物,為多基質反應。例如:

S1 + S2  

P

(Bi-Uni, 雙-單)

S

P1 + P2

(Uni-Bi, 單-雙)

S1 + S2

P1 + P2

(Bi-Bi, 雙-雙)

 b. 雙基質反應仍可適用於 M-M 公式,但兩種基質的 Km 要分別測定;測 S1 的時候,反應中的 S2 濃度要飽和 (使 S2 成為非主導因子),反之亦然。

 c. Bi-Bi 反應中基質 (S1, S2) 及生成物 (P1, P2) 的進出次序有數種情形:

(1) Random:基質進入活性區並沒有一定次序,但兩個基質都要結合到酵素後,才會開始進行反應。

(2) Ordered sequential:基質依固定次序進入,然後生成物再依序出來。

(3) Ordered ping-pong:依 [S1 進, P1 出; S2 進, P2 出] 次序,像是兩個 Uni-Uni 組成的;也像是打乒乓球一樣地一來一往。

 

 

E3-34

4  酵素的抑制:

酵素活性的抑制,也是一個重要的調控方式。

4.1 酵素的抑制方式:

 a. 抑制劑與酵素結合而導致抑制作用,這種結合是可逆或不可逆反應。

 b. 很多生理或藥理上的作用,都是源自於抑制劑對酵素的作用,而使酵素的活性降低,或者完全失去活性。如消炎的磺胺藥,即是一種細菌酵素基質 (PABA) 的類似物,可抑制細菌葉酸的合成,因而抑制細菌生長。

 c. 抑制劑與酵素產生非共價性結合,然後可以阻礙基質進入酵素活性區,或者改變酵素構形而使其失活。

 d. 抑制酵素的機制,依抑制劑 [I] 與酵素 [E] 的結合方式,可以分成三種: Competitive, non-competitive 及 uncompetitive (請見圖 2 整理);由抑制劑對酵素動力學曲線所造成的影響,即可得知是何種抑制方式。

 圖 2  三種酵素抑制機制

4.2 不可逆的抑制:

不可逆性抑制劑會對酵素活性區上的主要胺基酸進行共價性修飾,因此酵素活性通常被嚴重破壞,便無上述三種動力學抑制方式。

 a. 青黴素 (penicillin) 喬裝成基質,可與細菌的一種酵素發生不可逆的結合,此酵素乃細菌細胞壁生合成的重要酵素,細菌無法正常生成細胞壁而死亡。有點像是分子版的『木馬屠城記』。

 b. 重金屬:Hg2+, Pb2+, Cd2+ 及砷化物等重金屬,非專一性地與 [E] 或 [ES] 結合,取代原來酵素所需的金屬,而使酵素失去活性。

 c. 化學修飾劑:某些化合物可以專一性地修飾特定胺基酸,除了可做為專一性抑制劑外,也可用來檢定酵素活性區中,具有催化反應的胺基酸為何者 (表 1)。

 d. 蛋白脢及其抑制劑:蛋白脢廣泛存在於細胞,有其專一性抑制劑可控制其生理活性,二者互相抗拮形成調節控制網。目前極被重視的 HIV 蛋白脢及其人工抑制劑,在醫藥研究上有很大的作用及影響。

◆ 有關蛋白脢的分類,請見 6.1.2 一節。

 表 1 若干蛋白脢的抑制劑及其作用機制

抑制劑

 

作用基團

目標酵素例

 PCMB

p-chloro-mercuribenzoate

Cys

-SH

 Papain

 DIFP

diisopropyl-fluorophosphat

Ser

-OH

 Ser proteases

 TPCK

tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone

Ser

-OH

 chymotrypsin

 TLCK

tosyl-L-lysine chloromethyl ketone

Ser

-OH

 Trypsin

A Protease and Protease Inhibitor Web Server  (法國 Tours 大學的蛋白脢網站)

 

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問題集   以下題目不一定有標準答案,甚至會引起很大的爭議,但這就是問題集之目的。

 1. Hemoglobin 並非酵素,但為何也會有部份裂解雙氧水 H2O2 的作用?

 2. 請寫出 Michaelis-Menten 公式,並說明其意義。

 3. 說明為何 k3 就是 turnover number?

 4. 檢討一個酵素的催化活性,採用 kcat/Km 有何好處?

 5. 請判斷下列各題的真偽: (並說明原因)

 a) 酵素分子中的胺基酸,可直接參與催化反應的,都是一些極性不太強的胺基酸。

 b) 酵素的活性區多為一凹陷口袋,是因為要隔離影響催化反應的干擾因子。

 c) 以誘生抗體所製備得的 abzyme,可催化所指定的反應,其效率更優於傳統酵素。

 d) 為何酵素的反應速率要看 k3? (vo = k3 [ES]) 是因為 k1 太大、而 k2 太小。

 e) Steady state 理論是說,酵素在一定時間內會達到一平衡穩定的反應速率。

 f) Vmax 大,表示此酵素與基質的親和力越大。

 g) Km 的單位 = 濃度/時間。

 h) 分析酵素活性時,基質濃度不能太高 (差不多是 Km 的程度即可),以免干擾反應。

 i) k3 = kcat = turnover number

 j) Km 可看成 [ES] 的生成速率常數。

 6. 是非選擇題 (答案寫在內,是→○、非→╳)

 a) 有關 Km 的敘述何者為真? Km 的單位是 mM/sec  Km = k2 ÷ (k1 + k3 Km 越大表示對基質結合力強  Km 隨著酵素的濃度變化而變  Km 與 ES 的生成無關

 b) 有關 kcat 的敘述何者為真? kcat 的單位是 sec-1  kcat 就是 k3  kcat 隨著酵素的濃度變化而變  kcat 與 ES 的生成無關

 7. 酵素動力學可以下式開始:E + S → ES → E + P,請以公式或文字,說明由此式所衍生出來的四個基本觀察。

 8. 寫出下列各種酵素抑制劑的作用機制: a) Penicillin b) Sarin c) Sulfa drug d) Heavy metal

 9. 請判斷下列各題的真偽: (並說明原因)

 a) 酵素的抑制劑對人類都有害,在環境或醫藥使用上應完全避免之。

 b) 青黴素是一種 serine protease 的抑制劑。

 c) 磺胺藥是細菌代謝途徑的可逆型競爭性抑制劑,因此只能抑菌不能殺菌。

10.右圖為某酵素的雙倒數動力學作圖,請依指示回答問題:

 a) 請標示橫座標及縱座標及其單位。

 b) 標明圖中 a 及 b 點各為何?

 c) 若有一競爭性抑制劑 X,請在圖中畫出可能的抑制情形。

 

 

 

 

 

本網頁最近修訂日期: 2017/02/19