生物化學基礎 Biochemistry Basics 2008

核 酸  Nucleic Acid

細胞與分子 - 胺基酸 - 蛋白質 - 核 酸

酵 素 - 生物技術

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目 錄

1  分子構造

核苷酸   核酸   雙螺旋   三級構造   Palindrome   質體 

RNA   基因表現

2  功能性質

重要生理功能   Central Dogma   變性與復性 

鹼基組成的影響   雜合反應   Intron 與 exon

3  研究技術

核酸之純化   限制脢   核酸轉印法   基因操作   基因庫建構 

PCR   DNA 定序   定點突變   RFLP   人類基因序列解碼計畫

問題集 

雙螺旋構造完美說明遺傳機制

 Wikipedia

DNA

Genetic code

Genome project

 

     

核 酸

相關投影片

核酸是以核苷酸為單元所聚成的巨分子,是細胞內分子量最大的功能性分子,包括 DNA 及 RNA。其主要功能為遺傳訊息的貯存、傳遞與表現,是現代分子生物學的主角

 CSHL 教學網頁DNA from the Beginning (中文版)

 

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1  分子構造:

核苷酸單位小分子組成的酸巨分子有一定的分子構形。

 a. 核苷酸 (nucleotide): 由三部分構成 (磷酸)- 5' [五碳糖] 1'-{鹼基} (見圖 1)

核苷酸除去酸後成為核苷 (nucleoside): [五碳糖] 1'-{鹼基}

(1) 五碳糖可以是核糖 (ribose) 或去氧核糖 (deoxyribose),造成 DNA 與 RNA 的差別。

(2) 鹼基分成 purine (A, G) 及 pyrimidine (T, C, U) 兩大類,T 與 U 極相似。

(3) 核苷的核糖 (五號碳上) 可接一至三個磷酸,成為核苷酸,如 AMP, ADP 或 dATP。 

 圖 1  核苷酸的分子組成

 b. 核酸

前一個核苷酸的 3'-OH 端,與次一核苷酸的 5'-磷酸反應,以磷酸二酯鍵結合,連接成巨分子核酸。其中五碳糖為核糖者,即為核糖核酸 RNA;若為去氧核糖,則為去氧核糖核酸 DNA。一般而言 DNA 為雙股核酸長鏈,RNA 多為單股。DNA 分子中,A 的數目必等於 T;而 G 數等於 C,稱為 Chargaff 定律。

 c. 雙螺旋 (double helix):

DNA 分子由兩股核酸捲繞而成,磷酸脊骨露在外側,鹼基在內以 A=T 及 C≡G 配對,經由氫鍵結合,兩股並相互扭曲形成雙螺旋;自然界中多屬右手旋者。

(1) 雙螺旋的一股是 5'→3' 方向,另一股則以 3'→5' 方向與之互補。

(2) 雙螺旋分子呈不對稱扭曲,因而產生有大的凹谷 (圖 2 的 Large groove) 及較小凹谷 (圖 2 中 Small groove);一個如此的扭曲單位,含有 10.5 鹼基對,其長度有 36 埃。若一個雙螺旋單位若含有 10.5 鹼基對,則在結構上最穩定。

 圖 2  雙螺旋的分子構造特徵

(3) 磷酸脊骨在中性 pH 下,會帶有許多負電荷,導致兩股 DNA 相互排斥分離而變性,要加入鎂離子穩定之,因此 DNA 不能溶在純水中。真核細胞核中含帶有強正電性的組織蛋白 (histone),與 DNA 結合成複雜結構,並中和掉核酸的負電荷。

(4) DNA 分子因其含水的多寡,可分成 A 及 B 兩型,另有 Z 型 DNA 是實驗室的產物。

 The Double Helix (Watson 的爭議性名著); Nature: 50 years of DNA: Nature (1953) 171: 737 的原文

 The DNA Molecule is Shaped Like a Twisted Ladder (CSHL:雙螺旋的發現基礎  中文版)

 Salk Institute (Crick 掌管的有名研究機構); Cold Spring Harbor Laboratory  (Watson 主持的 Watson School)

發現 DNA 構造的故事; Secret of photo 51 (Public Broadcasting Service)

發現雙螺旋的故事  (一小段影片取自 Century of Discovery)  wmv, 9 min, 13 Mb

OMM Exhibits  巨分子立體結構博物館  (以 Jmol 觀覽核酸的 3D 構造)

 

 d. 三級構造

DNA 的長條核苷酸序列為一級構造,雙螺旋為二級構造,雙股 DNA 分子可能會捲繞成超捲曲 (supercoiling) 三級構造;這些分級是為了說明方便,但超捲曲構造的確可以幫助大量的 DNA 擠進小小的細胞核內,而且使 DNA 的立體構造有所變化。環狀的質體 DNA 有明顯的三級構造,以下圖 3 以 105 bp 的環狀質體說明。原文請參閱 Voet et al. 所著 Fundamental of Biochemistry (1999) p.733, Figure 23-9。

(1) 圖 3 左:雙螺旋 DNA 的兩股分子間,以 10.5 對鹼基長度為重覆單位,互相交叉一次,這樣的重覆單位稱為 twist (T);因此 105 bp 長的 DNA,就有 10 個交叉處 (T)。而這兩股扭曲 DNA 的立體交叉處稱為 linking,其數目稱為 linking number (L);普通的長條狀 DNA 每相互 twist 一次,自然就有一次 linking (見圖 2 標注),故 T = L。而 10 個 T 就有 10 個 L;故 L = 10, T = 10,但此種 DNA 是平攤的,沒有再次捲繞,以 W (writhing) = 0 表示。

(2) 圖 3 上排中及右圖: 若把此段 DNA 頭尾相接捲繞成環狀,則因其分子內鍵角的緊張無法舒解,除非先解開一次扭曲 (T = 9),否則不容易形成完整的環狀構造;但因為解開了一次扭曲,導致扭曲與交叉都少一次,故 L = 9, T = 9;而此環狀 DNA 還是平攤開的,故 W = 0。

(3) 圖 3 下排中及右圖: 上述環狀 DNA 的 T 減為 9,比原來的 T = 10 減少 1 (-1);若此環狀 DNA 要保持原來的扭曲數目 T (10),則此相差數目,必須用三級構造的超捲曲 (W) 來補足,以 L = T + W 表之 (W = -1);也就是說,若此環狀 DNA 沒有先解開一個扭曲,則必須整個環狀 DNA 逆向捲繞一次,以便彌補之。若 W 為正 (即 L > T),則形成 positive supercoil,為左手旋超捲曲構造;若 W 為負值,則為右手旋 (negative supercoil)。

 圖 3  DNA 的三級超捲曲構造

Voet et al. (1999) Fundamental of Biochemistry (1/e) p.733, Figure 23-9

 DNA is Packed in a Chromosome (CSHL:DNA 與 histone 的連結 中文版)

 Molecular Visualization of DNA (一家澳洲大學的作品 http://www.wehi.edu.au/education/wehi-tv/)

 e. Palindrome

是一段特殊的鹼基序列,其特徵是在同一股 DNA 上,其鹼基序頭尾互補,例如 GAATTC 為 EcoRI 限制脢 (restriction enzyme) 的辨認位置。這種互補排列可能在同一條分子內發生鹼基配對,而形成十字型 (cruciform) 的 DNA 三級構造,可做為蛋白質辨認 DNA,或與 DNA 結合的信號。也有利於打開 DNA (breathing),方便上述蛋白質的辨認與結合。但蛋白質也可不打開雙股 DNA,直接辨認各種鹼基對的外側原子排列。

 f. 質體 (plasmid):

DNA 多存在細胞染色體上,但許多細菌的染色體外,也有一些獨立的小分子 DNA,稱為質體。質體是雙股環狀 DNA,常態以超捲曲的三級構造存在,帶有某些遺傳信息,可進出細菌菌體,是基因操作的重要載體 (vector)。

 g. RNA

RNA 分為信息 RNA (mRNA)、傳送 RNA (tRNA) 及核糖體 RNA (rRNA),其活動全部與蛋白質合成 (轉譯 translation) 有關。由於 RNA 為單股分子,長條狀的脊骨活動自由,且有複雜的分子內鍵結,故分子構形較為特殊而多樣,可能具有催化活性 (ribozyme)。現今多認為地球上最早進行複製的巨分子可能是 RNA;但因為 RNA 分子構造不十分安定,後來便演化出 DNA 作為信息貯藏分子,因而造就了今日 Central Dogma 的主軸。

 Some Viruses Store Genetic Information in RNA (CSHL: 逆向轉錄的發現  中文版)

 RNA is the First Genetic Molecule (CSHL: Stanley Miller 如何預測第一個巨分子  中文版)

 h. 基因表現

一段基因的兩股 DNA 之中,只有其中之一可轉錄成 mRNA,這一股稱為 template 或 (-) strand,另一股則稱為 nontemplate 或 (+) strand。兩股都有可能被表現,其調控決定於此基因之前的 DNA 序列 (promoter 或 enhancer 等)。而 anti-sense RNA 是以人為方法,故意使 (+) strand 轉錄出 RNA,在細胞中會與原來的 mRNA 雜合,抑制該基因的表現,特稱為 RNA 干擾 (RNA interference, RNAi)。

 DNA Words are Three Letters Long (CSHL: 如何解出 DNA 的三元密碼  中文版)

 Genes Can be Turned On and Off (CSHL: Operon 理論的具體說明  中文版)

 RNAi - 神祕的基因糾察隊 (科學人2003 年 9 月 p.48~56)

RNA 干擾 (RNA Interference)  (YouTube 上非常精彩的動畫) Artikek Studios Inc.

 

 

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2  功能性質:

DNA 最重要的功能之一就是複製自身的分子

 A Half DNA Ladder is a Template for Copying the Whole (CSHL:DNA 的複製機制  中文版)

DNA Replication  (DNA 複製的模擬實境) WEHI

 a. 單位小分子可參加重要生理功能: 核苷酸除了組成核酸外,另有下列生理功能。

(1) ATP (或 GTP 等三磷核苷酸) 是攜帶能量的分子。ATP 經常會活化許多代謝小分子,以進入特定的代謝途徑;例如 Glc-1-P 被 UTP 修飾為 UDP-Glc,可參加肝糖合成。

(2) 構成輔脢,是某些酵素不可缺的輔助因子;如 FAD, NAD+ 及 coenzyme A (CoA)。 (酵素 2.2)

(3) cAMP 是傳遞細胞內外信息的分子,稱為第二傳信者 (second messenger)。 (酵素 6.3.1)

 b. Central Dogma

Central Dogma 敘述 DNA → RNA → 蛋白質 的流程,幾乎是所有生物體內生命現象運作的基本機制;同時 DNA 以複製來保持其自身的遺傳特性。蛋白質合成時,tRNA 攜帶胺基酸,在核糖體依 mRNA 的信息合成蛋白質。Central Dogma 以及基因表現的調節與控制 (基因調控),是分子生物學的探討內容。

 RNA is an Intermediary between DNA and Protein (CSHL: 如何發現 RNA 轉譯蛋白質  中文版)

基因如何表現並且指揮人體建構藍圖  (一小段影片取自 DNA 時代 1:人類基因組)  wmv, 12 min, 15 Mb

RNA 干擾 (RNA Interference)  (YouTube 上非常精彩的動畫) Artikek Studios Inc.

Transcription and Translation  (由轉錄到轉譯的模擬實境)  WEHI

 基因如何轉錄並轉譯出蛋白質  (以動畫呈現整個 Central Dogma 的流程)

 c. 變性與復性

DNA 的雙螺旋可因加熱而分開,稱之變性,變性後的 DNA 溶液對 260 nm 波長的吸收急劇增加,稱為hyperchromism;是因為分子內的鹼基外露,而加強了吸光。若溶液的溫度再慢慢下降,則 DNA 會再回復雙螺旋的原態構造 (anneal);回復原態的步驟,要先形成一核心 nucleation (兩條單股 DNA 間的單點接觸配對),再自發地進行 zippering (由前述已結成配對的核心開始,朝兩端如拉鍊般快速拉上)。

 Some DNA does not Encode Protein (CSHL: 以變性-復性來觀察 DNA 間的互補關係  中文版)

 d. 鹼基組成的影響:

因 G≡C 之間有三個氫鍵,A=T 間只有兩個;因此 GC 含量多的 DNA,其變性溫度 (Tm) 較高,即較不易變性;其分子也較緊密,因而密度較大。此外,DNA 回復原態的時間,與其所含鹼基的種類、組成也都有關係。越複雜的 DNA,復性所需時間也越長;重複性高的 DNA 則較快;以上均可以 Cot 作圖法來表示之。

 e. 雜合反應

若把兩種不同來源的單股 DNA 分子混合,則序列同質性高的 DNA 就可以配對在一起,稱為混成或雜合 (hybridization)。DNA 與 RNA 之間,也可進行混成反應。

 f. Intron 與 exon:

真核細胞的基因中,其 DNA 經常插有不會表現的 DNA,稱為 intron,可能與基因的調節有關;而基因上可以表現的部分,最後轉錄成 mRNA,稱為 exon。某些 RNA 可自己進行其分子內 intron 的切除 (self splicing),有類似酵素的功能。這種 RNA 的 processing (加工處理),可能與基因表現的調控有關。

 The RNA Message is Sometimes Edited (CSHL: 介紹 intron 的發現及基本的核酸技術  中文版)

 

 

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3  研究技術: 

說明各種核酸操作及序列分析技術。

 a. 核酸之純化

核酸難溶於醇類,可用乙醇或異丙醇沉澱之。洋菜電泳可依核酸分子量的大小不同,來分離各種長度的 DNA 片段。應用超高速離心,可分開 DNA 或 RNA 等分子密度不同的分子。DNA 分子通常都很長,實驗操作中容易拉斷,只能得到約 100 kb 長度者。RNA 分子較小不怕拉力,但容易受到 RNase 水解,而 RNase 很難除去。

 b. 限制脢

限制脢種類很多,可在 DNA 分子上的特定鹼基序列 (一般為四或六對鹼基) 切開核酸,而此種鹼基序列,一定是 palindrome。 DNA 可以不對稱方式切開,得到末端不平整的 sticky ends (或 cohesive ends);也可能平整地切成兩段,而得到鈍端 (blunt ends)。兩個相同的 sticky ends 可以 ligase (接合脢) 連接,這就是遺傳工程的基本操作。

 兩種限制脢的作用  (以動畫呈現限制脢之切開方式)

 c. 核酸轉印法︰

DNA 經過限制脢處理,再以電泳分離後,可轉印到硝化纖維紙上;然後以標有放射性的小段 DNA 為探針,進行混成雜合反應,就可挑出其中具有互補關係的 DNA 片段。此項技術在核酸的檢定上很常見,稱為 Southern blotting;若用來檢定 RNA,則稱為 Northern blotting。探針可使用群殖或 PCR 得來的 DNA,或是化學合成之寡核苷酸片段 (約數十個核苷酸長度,見圖 4)。

 

 圖 4  核酸探針的設計及應用篩選

 d. 基因操作 (gene manipulation):

帶有遺傳信息的 DNA 分子,可用限制脢切開,再以接合脢 (ligase) 接到載體 (vector) 中;送入宿主菌後,即可大量群殖此段基因。基因群殖 (molecular cloning) 可放大、純化所要的 DNA,以獲得大量且長度、組成固定的基因,以進行此段 DNA 之定序或修飾,進而研究此基因的調控特性。甚可轉殖到其他生物體,以觀察其基因表現產物。

 Genes Can be Moved Between Species (CSHL: 基因重組操作的最基本說明  中文版)

 DNA is Only the Beginning for Understand the Human Genome (CSHL:精確修飾基因後觀察表現  中文版)

 e. 基因庫建構︰

依 DNA 來源不同而有以下兩種方式:

(1) cDNA 基因庫:

mRNA 帶有合成蛋白質的完整信息,以 reverse transcriptase 可逆向翻製成 DNA 分子,稱為 cDNA (complementary DNA) 不含 intron;全體 cDNA 再植入載體,送入宿主中,即得 cDNA 庫。但需注意,此種基因庫只代表正在表現中的基因,並不包括所有的基因。cDNA 可以表現出蛋白質,並以其專一性抗體篩選之。

(2) 染色體基因庫 (genomic bank)︰

染色體 DNA 以限制酵素切成隨意片段後,植入載體,再送入宿主建庫。此基因庫可能含有所有的基因,包括正在表現的,與休眠中的基因;也包含 intron,以及基因上游的調控區域 (如 promotor, enhancer 等)。通常要使用噬菌體為載體,以便容納較大的 DNA 片段。

 f. PCR (polymerase chain reaction)︰

以任何 DNA (或 RNA) 為模版,加入兩段 primers 寡核苷酸,此二 primers 分別界定目標基因的起點與終點,用 DNA polymerase 往復進行複製此二 primers 之間的 DNA,則可大量合成得此段目標基因。應用此法,可以直接群殖某特定基因,而不需先行建立基因庫,但需選擇正確的 primers。

 PCR 的基因放大作用  (以動畫呈現 PCR 如何把特定基因放大)

 g. DNA 定序以下兩種方法目前以 Sanger 法較常用 (見圖 5)

(1) Maxam-Gilbert 法:

以四種化學反應分別對四種鹼基作用,每一反應只對單一種鹼基進行修飾,而在該鹼基的地方斷開,得到一系列長度不同的核酸片段。電泳可依照這些 DNA 片段的大小,在膠體中排開,即可依序判讀 DNA 分子上核苷酸的序列;比較如此的四組鹼基序列電泳,即可組合成整段 DNA。

(2) Sanger 法:

以樣本 DNA 為模板,使用 DNA polymerase 進行試管中 DNA 生合成。四個反應中,每個反應各缺單一種核苷酸,而代以其類似物 (analogue),則部分合成反應會停在該類似物的核苷酸處,造成各種長短不一的 DNA 片段,以電泳分離如上,即可組合判讀 DNA 的序列。

上述兩種方法,均以 32P 標示在核酸分子上,以便顯像各不同長度的核酸片段;現在已經可以使用不同的螢光染劑,標示在四種核苷酸上,直接以顏色判讀序列。

 圖 5  核酸定序的原理及兩種定序方法的設計

 A Gene is a Discrete Sequence of DNA Nucleotides (CSHL: 介紹 Sanger 的定序生涯  中文版)

 h. 定點突變 (site-directed mutagenesis)︰

利用分子群殖的方法,可以改變基因上某一特定鹼基,植入載體後,在宿主中表現。檢定轉譯所得之突變蛋白質,可獲知此特定胺基酸之改變,對蛋白質或酵素功能的影響。

 i. RFLP (restriction fragment length polymorphism)︰

同種生物個體間的基因組成雖大致相同,但有微小差異,稱為多形性 (polymorphism)。 這種 DNA 分子上的差異,可以用限制脢檢定出來,DNA 會被水解成不同長度的片段;進行電泳後,將 DNA 轉印到紙上,再以探針偵測,比較所得圖型的差異程度,便可得知個體間基因親緣關係的遠近。

j. 人體基因序列解碼計畫 (Human Genome Project):

2001 年已經完成人體基因 DNA 序列的解碼工作,並可由這些序列得到許多有用的資訊,此一學問稱為 genomics。 由全體基因序列可轉譯出該細胞中可能存在的全體蛋白質,稱之為 proteome,並以 proteomics (或者 function genomics) 來稱呼此一新的研究領域。

 Nova: Cracking the code of life (有關基因解碼的完整故事)

 神奇的 DNA 晶片 (科學人 2002 年 4 月 p.40~48)

 A Genome is an Entire Set of Gene (CSHL: Watson 及 Venter 解讀人體基因密碼  中文版)

 

 

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問題集   以下題目不一定有標準答案,甚至會引起很大的爭議,但這就是問題集之目的。

 1. 以化學觀點而言 DNA 分子比 RNA 穩定,請說明為何?在演化上有何目的?

 2. 何為 Human Genome Project?此大計畫對人類或科學研究,有何目的或影響?

 3. 何為 palindrome sequence?這種序列在分子的立體構造上,有何特點及作用?

 4. 下列核酸序列中,有無具有意義的序列?請畫底線標出,並加說明之。

5’-AGGAGGATATACATGCAGAGTTAACTC-3’

 5. 限制脢 Bam HI 作用在 G↓GATCC 序列,Bgl II 則作用在 A↓GATCT序列 (箭頭表示切開的位置);分別由這兩種限制脢所切得的核酸片段,混在一起後,能否用 ligase 接在一起?若可以連接,則連接完成後可以用哪一種限制脢再度切開?

 6. 以對水溶解度的大小,排列以下各種核酸物質 (由大到小)︰

     Adenine (腺嘌呤), Adenosine (腺嘌呤核苷), Adenosine monophosphate (AMP), Adenosine triphosphate (ATP), Deoxyadenosine (並說明其溶解度差異的原因)

 7. 細胞內的很多反應需要蛋白質與 DNA 分子間的專一性確認與結合,如限制脢可確認特定的鹽基序列;但 DNA 是兩股互相纏繞的雙螺旋,鹽基都深埋在分子內部。請問蛋白質是如何來確認 DNA 分子上的鹽基序列? 請回答兩種以上的確認方法。

 8. 在純化 DNA 時,最大的污染來自 RNA 及多醣類,尤其是後者很難去除之。

 a. 如何由 DNA 中去除 RNA?請舉三個方法。

 b. 為何多醣類很難與 DNA 分開?請以分子構造觀點說明之。

 c. 如何去除雜夾在 DNA 中的多醣類?

 9. 有關 DNA 的雙螺旋構造:

 a. 其分子構造中的那些因素,分別可以穩定或破壞其雙螺旋的安定性?

 b. 為何 DNA 雙螺旋構造無法像蛋白質一樣,生成具有固定構形的分子?

 c. DNA 分子也有的三級構造 (如 supercoiling),有何生理上的功能或意義?

10.通常在用乙醇進行 DNA 沈澱時,要把溶液的酸鹼度調低,並且加入鎂離子。請問此種處理,有何作用?請就 DNA 的分子構造說明之。

11.基因操作技術中,genomic bank 與 cDNA bank 在建庫的方法上及其應用上,各有不同之處,請說明之。

12.Central Dogma 說明遺傳信息 DNA → RNA → Protein 的流程,而這三種分子均為巨分子 (macromolecule),都是由單位小分子所組成的。

 a. 你認為地球上第一個出現的巨分子可能為何者?

 b. 舉出有那些實驗或結果,可證實你的觀點 (可自行設計實驗)。

13.DNA 的雙螺旋鍊構造中,其外側為兩條帶有很強負電的磷酸脊骨,鹽基在內側以 A=T 及 C≡G 的方式配對。這樣的構造,使得 DNA 分子在低離子濃度的水溶液中,很容易變性 (denatured)。

 a. 請說明上述導致變性的原因。

 b. DNA 變性後會有 hyperchromic effect 發生,請說明此現象。

 c. 在試管中的實驗操作,要如何避免上述之變性發生?

14.DNA 及 RNA 為兩種遺傳上重要的大分子,其分子構造的最大差別在於核糖分子上的一個氧原子 (2'-OH)。在二級構造上,一為單股分子,另一為雙螺旋構造。因這兩點差異,導致二者在功能及性質上有截然不同的表現,請分別說明之。

15.DNA 分子上有兩股核酸序列,在進行轉錄 (transcription) 時,是使用哪一股為模版?其決定機制如何?

16.核酸轉譯的起始密碼只有一種,即為 AUG,可轉譯為 Met,亦即所有轉譯得蛋白質的開頭一定是 Met;但我們已發現,一般蛋白質的起頭不一定是 Met,請問為何會有這樣的結果?並說明這種現象在細胞生理上的意義。

17.進行基因操作時,若要把一段核酸送入宿主細胞時,一定要使用質體或噬菌體作為載體 (vector);請以質體為例,說明載體的功能。

18.請解釋何為 intron 何為 exon? 較原始的原核細胞並無 intron,請問 intron 及 exon可能是如何演化而來的?

19.DNA 或 RNA 等核酸構造,也會捲曲成複雜的三級構造,請舉出三例。 例如︰質體 DNA 的 superciol 構造

20.DNA 分子中 G 與 C 含量的多寡,會影響 DNA 的哪些分子性質?請舉三例。

21.已知某真核細胞內的一段 RNA 序列為 -AAUAGGUACC-,則負責轉錄出此段 RNA 的 sense DNA 序列為何?請寫出兩種可能序列。

22.為何  RNA 的半衰期大都很短?請分別就其化學性質及細胞生理學討論之。

23.請就以下各性質,分別說明能否把 DNA 及 RNA 分離開來?

(a) 分子量  (b) 分子密度  (c) pI  (d) 對醇類的溶解度

24.某些 RNA 具有酵素的作用,稱為 ribozyme。請問這些 RNA 分子如何會有催化的能力?

25.當你得到某生物染色體全部基因的核酸序列 (genome) 後,你可以做什麼事?

 

 

 

 

本網頁最近修訂日期: 2009/10/16