生物化學基礎 Biochemistry Basics 2008

核 酸 Nucleic Acid  投影片  N1 - N2 - N3 - N4

回核酸 1

講義下載

■■■

N1-1

核酸 是細胞內的巨分子之一，分成 DNA (去氧核糖核酸) 及 RNA (核糖核酸) 兩大類，是由核苷酸的小單位分子所組成。同樣的，核酸部份也是先說明其分子構造後，再以構造為基礎，來認識其種種生理性質。

學習核酸的構造，要清楚辨別核酸巨分子，是如何以單位小分子連接起來，兩條 DNA 分子如何配對成為雙螺旋鏈。這幾乎是所有生命現象的核心，在五十年前 Watson 及 Crick 發現雙螺旋的構造，同時也開啟了分子生物學的研究。目前我們只能簡短說明核酸的構造與一般性質，至於圍繞著 Central Dogma 所發生的種種分子遺傳學知識，只能留待分子生物學中講述。雖然如此，我們還是把基因操作的一些基本方法與原理，在適當的段落，做精要說明。

N1-2

核苷酸 這三個字有點像象形文字。因為它剛好指出了 nucleotide 單位分子中的三個主要部分：鹼基、五碳糖、磷酸。當核苷酸去掉磷酸時，中文直接變成核苷，英文則改了一個字母成為 nucleoside，見次頁的構造說明。

N1-3

核苷酸 是由三部份構造所組成，每一部份又有數種選擇；例如五碳糖部分，可能是核糖 (ribose) 或是去氧核糖 (deoxyribose)，此種差別造成了 DNA 與 RNA 在性質與構造上的不同。我們所常見的 ATP 分子，是含有核糖，若核糖改成去氧核糖，則寫成 dATP。上圖只是畫出大略的構造關係，請自行在課本上找出確實的分子構造，要能自己默寫出詳細構造才可以；尤其各種鹼基之間，以氫鍵連結的配對情形，一定要十分清楚。生命的奧祕，幾乎盡藏於此。

DNA 與 RNA 所使用的鹼基幾乎一樣︰DNA 用 ATCG，RNA 用 AUCG，只有 T, U 不同，而 T 與 U 在構造上也很相似，都能夠與 A 配對。

■ 請自己列一張表，慢慢整理出 RNA 與 DNA 在構造與功能上的異同點。

N1-4

為何 自然界會選用這幾種鹼基作為遺傳密碼？

可能有幾個理由︰ (1) 鹼基分子扁平，可以緊密堆疊在雙螺旋長鏈中。 (2) 鹼基一類為單環，一類為雙環，單環配雙環成一鹼基對，不易弄錯。 (3) 鹼基分子相當疏水性，藏在兩股磷酸長鏈中，可保安定。 絕對還有其他理由，可以自己再思索。

■ 上圖各種鹼基的構造，其氫原子與雙鍵位置並沒有畫得很清楚，請自行參考課本上的構造，把四種鹼基與兩種配對的氫鍵仔細畫好。

N1-5

兩個 核苷酸之間，前一個 (1) 以 3'-OH 與次一個 (2) 的 5'-磷酸進行脫水反應，連結形成磷酸二酯鍵 (phosphodiester bond)。如此一直連接下去，就成為核酸的長鏈。但最後有一個磷酸及一個 -OH 基是不被作用的，因此核酸的長鏈具有方向性，可寫成 5'-P → 3'-OH 兩端，就像蛋白質有 N-端及 C-端一樣。

又如同蛋白質的 N-C-C-N-C-C-N-C 骨架，核酸長鏈也有分子脊骨，它是以磷酸-核糖輪流出現的 P-R-P-R-P-R 骨架，所有的核酸都一樣，是屬 constant 的部份；同時在核糖分子上一個個加上各種鹼基，組成特定的核酸序列，是 variable 的部份。

N1-6

核酸 巨分子長鏈的記錄法，當然不能每次都把整個構造寫出來。方便的筆記法是把核糖變成一直線 (R)，從上到下分別是 1' → 5'，而 1' 接有鹼基 (B)，5' 接有磷酸 (P)；各核苷酸間以斜線表示磷酸二酯鍵。

後來覺得這樣還是很麻煩，就省去直線及斜線，以 p 代替雙磷酯鍵，只留下各個不同的鹼基序列，最後又去掉鹼基間的 p；有時特別標出 5' 及 3' 端，以作為提醒，因為核酸的方向性極為重要。到最後，只剩下鹼基排列。

N1-7

兩條 DNA 核酸配對在一起時，其 5'-3' 方向剛好相反；有點像馬路有來回兩向的車道一樣。這兩股 DNA 互相捲繞成為有名的雙螺旋構造。這種方向性，對核酸的複製及轉錄很重要，因為這些活動都有一定方向。

N1-8

A=T 與 C≡G 間是以氫鍵連結，其立體的分子構造，在很多書上都有。

雙螺旋是由 Watson 與 Crick 在劍橋大學發現的，他們根據所收集的研究資料，即推出 DNA 的雙螺旋構造。這些資料如下：

(1) DNA 是遺傳物質，其所含鹼基當中，A 的含量等於 T，C 等於 G (Chargaff Rule)。 (2) 由 X 光繞射分析結果得知，DNA 是螺旋狀，含有兩條磷酸脊骨；並且得知許多有關 DNA 分子空間排列的數據。 (3) A 與 T 之間可以用兩個氫鍵結合，C 與 G 之間有三個氫鍵。

N1-9

雙螺旋 分子有點像扭曲的樓梯，而 A=T 與 C≡G 就是水平的踏板，一階一階排列在兩條磷酸脊骨之間。 請注意扁平的鹼基配對，可以很經濟地堆疊在兩股核酸之間，每一單糖分子都與鹼基垂直，而磷酸則裸露在外側。再強調一次，兩股分子的方向相反 (箭頭)。

N1-10

雙螺旋 的整個發現過程充滿戲劇性，Watson 把它寫成偵探小說般的 Double Helix，出版後雖然爭議不斷，但也可描繪出這個世紀大發現的驚險過程。

Watson 的行事風格一向怪異，有自己的想法與強烈個性。 後來長久主掌有名的冷泉港實驗室 (Cold Spring Harbor Laboratory)，並且推動人類基因體計畫，相當活躍。他有幾本著名的教科書，其中 Molecular biology of the gene (2003, 5th ed) 及 Molecular biology of the cell (2002 4th ed)，都是很重要的經典著作。

Crick 是英國人，後來則轉到美國，主持加州聖地亞哥的 Salk Institute，主要以分子層次及細胞機制，探討人類的思考與意識問題。

N1-11

Watson 與 Crick 所發現的雙螺旋，是稱為 B 型的水結合型 DNA，在細胞中最為常見。另外也有 A 型及 Z 型兩種。Z 型 DNA 早期是實驗室中的人工產物，當 GC 配對重複較多的片段容易產生；最近發現細胞中可能也有存在，也許可調節基因的表現或重組。

N1-12

雙螺旋 是一條雙股重複扭曲的螺旋鏈，其重複出現的單位如上圖所示；以常見的 B 型 DNA 而言，每 10.5 bp 形成一個扭曲單位，長度 3.6 nm； 注意每一個扭曲單位中，DNA 的一股會交過另一股一次。因為分子的扭曲並非對稱，因此分子表面會形成大小凹谷，這些凹谷對核酸與蛋白質的相互作用關係，有很大的貢獻。

同時因為磷酸脊骨露在外面，因此核酸的外側有相當大的負電聚集。若把 DNA 溶在純水裡，則兩股磷酸脊骨會互相排斥，造成 DNA 的兩股分開而變性沈澱，故 DNA 都要溶在含有陽離子的緩衝溶液中 (TE buffer)。

N1-13

在 真核細胞中，DNA 捲繞在帶有強正電的蛋白質上 (如 histone)，除了抵消負電性外，還有利於 DNA 的包裝，以便容納在細胞核的有限空間中。這種包裝方式，在真核細胞的染色體中，有極為複雜的組織與控制。

N1-14

雙螺旋 的磷酸脊骨，雖然比起蛋白質長鏈有較大的彈性，可以較為自由地活動，但仍有一定的限制。 因此，整條雙螺旋分子並不能很自由地平攤成一直線，會以雙螺旋為軸心再度捲繞，稱為超捲曲 (supercoil) 的構造。

N1-15

雙螺旋 的實際構造可用橡皮圈做簡單的模型︰把兩股橡皮筋捲繞作成雙螺旋的樣子，若把捲繞的程度加大，則這條雙股橡皮筋會再度捲繞起來，成為超捲曲 (下圖)。

你也可以用毛巾做實驗，先把一條毛巾捲起來，好像一條雙螺旋，但不要捲太緊，適度即可。然後，握住兩頭，試著再度把這條毛巾再捲繞幾圈，則毛巾就會繞成超捲曲。這樣做出來的毛巾雙螺旋，也可以顯示出 DNA 的 (+) 超捲曲或 (-) 超捲曲 (N1-17)，完全取決於再度捲繞時的方向。這很不容易以文字說明。

N1-16

超捲曲 的數目 (W)，與其所含鹼基長度及扭曲數目 (T) 有關，可用 L = T + W 表示之；也請參考下頁的例子。

在最穩定的狀況下，每一個單位扭曲 (T) 含有 10.5 對鹼基，請記住 10.5 這個魔術數字。而 Linking (L) 是以兩股中的一股為主，當這股跨過另一股一次時，就會產生一個 Linking number；因此像上圖含有 10.5 個鹼基對，紅色那股跨過藍色股一次，就有一個 Linking (但上下兩端的交點，因為是藍色股跨過紅色股，因此不計)。

若核酸的序列為一級構造，則雙螺旋為二級構造，超捲曲則是其三級構造。 請注意凡是螺旋構造都會有左手或右手旋之分別，而兩者有點像是鏡像物；一般的 DNA 都是右手旋的，請見上圖。 老實說，螺旋的左右手旋構造，很難說明，請自行看圖辨認。

N1-17

超捲曲 之目的是想把核酸擠到擁擠的細胞核內：如何把兩股 DNA 再捲繞成更緊密的構造，但又不會增加 DNA 分子構造內的緊張度。

DNA 分子是右手旋的螺旋狀，超捲曲是整條核酸螺旋再度捲繞，這種二次捲繞稱 writhing (W)。若沒有超捲曲，則 DNA 就不會有 writhing，在數學上就是 W = 0。通常一條線性 DNA 兩端自由開放時，都不會有超捲曲，而其最穩定構造就是每 10.5 鹼基對繞一圈；一條 105 鹼基對的核酸有 10 個單位，因此 T 與 L 都是 10，上面的 L = T + W 公式寫成 10 = 10 + 0。 天下太平，一切沒事 (上圖最左邊)。注意 T 儘量保持為 10，以便讓每圈的鹼基對數目為 10.5 (魔術數字)。但這樣的核酸太鬆散，整體體積很龐大。

因此，若要把 DNA 擠入細胞核內，一定要再度捲繞起來，勢必造成 DNA 分子的緊張。而整條 DNA 分子再度捲繞的方向有兩種，一種是如上圖下排的中圖，長條核酸分子捲成圓圈，且由此圓圈之下方繞過，這種往下的繞法稱為 negative supercoil，W 記為 -1 (因此 9 = 10 - 1)。反之，若繞到圓圈的上方，則為 positive supercoil (W = 1, 則 L = 11, 因為 11 = 10 + 1)。Negative supercoil 等於雙螺旋鬆開一圈，然而 T 仍為 10，維持每圈 10.5 鹼基。

Negative supercoil 超捲曲的繞法，等於先把長條核酸先解開一圈 (L = T = 9 即 9 = 9 + 0)，然後頭尾連接起來 (上排兩圖)；這樣的環形 DNA 會自動以 negative supercoil 再轉一圈，變成 9 = 10 - 1 的超捲曲，T 保持為 10，也就是每單位有 10.5 對鹼基，最為安定。如此，DNA 有了超捲曲，可以擠入細胞核，而其分子構造也不會太緊張。

N1-18

核酸 的構成序列中，有一種特殊鹼基序列，其鹼基的排列是前後互補 (如 GAATTC)，稱之為 palindrome (迴文)；此字是文學用字，指文句可以隨意自前向後念，或由後向前念者 (如 madam)。

有一大類酵素，可以辨認核酸序列上的這種特殊構造並水解之，統稱為限制脢 (restriction enzyme)；這是因為含有某種限制脢的大腸菌，會限制某入侵病毒的攻擊。

天字第一號的限制脢為 EcoRI，是從大腸桿菌分離出來的，可把 GAATTC 序列不對稱地切開，切口會形成 sticky ends (cohesive ends)。 具有相同 sticky ends 的核酸片段，可以互相準確地黏在一起，這在基因重組技術上有很大貢獻。

◆ 兩種限制脢的作用  (以動畫呈現限制脢之切開方式)

N1-19

有些 限制脢 (EcoRV) 是在 palindrome 序列的正中央對稱地切開，成為平口的鈍端 (blunt ends)。 兩個鈍端間雖然也可以進行連結，其效率差很多，但在基因重組上也有其用途。

◆ 兩種限制脢的作用  (以動畫呈現限制脢之切開方式)

N1-20

因為 palindrome 的核酸序列是對稱的，所組成的 DNA 構形會在長條雙螺旋上造成一個對稱的小轉折，限制脢即可認識這種對稱的轉折，並且結合到該處，再以非 Watson-Crick 的鍵結方式，在雙螺旋分子的外側凹谷 (grooves)，探索其所含鹼基序列，看是否為其所能水解者。

較長的 palindrome 序列可以形成同一股 DNA 分子內的鹼基配對，因而形成了特殊的十字形 (cruciform) 構造，兩者之間也可以互相變換；可能作為 DNA 分子上的標記位置，以便在 DNA 分子上進行各種反應。

N1-21

蛋白質 與 DNA 之間經常要互相辨認，以便進行許多生理功能；尤其是這些辨認都是專一性的，蛋白質必須要結合到核酸上面的特定序列，才能正確進行生理功能。那麼，蛋白質是如何辨認核酸序列的？ 需不需要把兩股核酸打開，以辨識其鹼基序列？

答案是不一定，也就是說蛋白質可以在雙股核酸配對結合的情況下，認出裡面的鹼基是什麼。有點像認人不一定要看到對方面孔，許多熟人你看側影甚或背影，就可以叫出名字。同樣的，蛋白質要辨認鹼基不一定要把雙螺旋打開，只要看鹼基側面各種基團的排列，就可以認出，因為每一對鹼基的外側輪廓都不太相同，請見上面的對照密碼就可明白。

■ 有許多種可與 DNA 結合的蛋白質區塊，請先到 Lehninger Principles of Biochemistry (4e) p. 1088 查看這幾種蛋白質的構造特徵。

N1-22

因為 限制脢可以辨認核酸序列上的特定序列，因此對某段固定的核酸，每次用相同限制脢所切的位置是固定的，所得到的大小片段也都是恆定的，這些片段可用電泳分離之，稱為限制脢圖譜。當然，使用不同的限制脢會切在不同的地方，因此 A, B 兩種限制脢所切得的電泳圖譜也會不同。若同時使用這兩種限制脢，則由所得到的圖譜，可推出這兩種限制脢在該段核酸上的切點位置。

例如上面的兩種限制脢分別切出 2 + 8 (A) 以及 3 + 7 (B) 兩種圖譜，合起來都是 10 kb，對其切點的預測有兩種可能；但經由混合水解所得到的 2 + 3 + 5 片段，可以推出兩個限制脢切點之間相隔 5 kb，若不做混合水解則無法得知。

N1-23

限制脢 所切出來的 sticky ends，可與另一相同的 sticky end 相連結，再用 DNA ligase 連結脢把各股補滿，這使得 DNA 的剪接非常精準有效，是基因操作的最基本工具之一。任何兩個鈍端 (blunt ends) 也可相互連接，沒有專一性，而且其連結效率非常低。

這些工具提供了在核酸序列上的精確剪接動作，可以像編輯錄音帶一樣，把所要的核酸片段剪出，然後接到另一段核酸上，開啟了基因操作的大門，科學家也快樂地打開了潘多拉的盒子。

N1-24

質體 是一種小型環狀 DNA，可以進出宿主細菌。質體上面帶有可以表現的遺傳信息；最有名的是產生抗藥性的質體，它所轉譯出來的酵素會水解抗生素。傳統上純化質體都是利用超高速離心法，因質體為超捲曲構造，構形較為緊密，因此密度比染色體 DNA 要大一點，離心後會在主要的 DNA 色帶下面，找到一個質體 DNA 的色帶。

N1-25

質體 可以由一種宿主傳到另一種宿主菌，因此抗藥性也可以因此傳播開來，使得很多細菌很快對抗生素產生抗藥性。遺傳工程也是利用質體的這種傳播功能，把一個被修改過的重組質體，放到宿主細菌中去表現，生產我們所要的物質。

N1-26

質體 用限制脢切開後，可以插入各種外來的 DNA，形成重組質體，後者可以轉形到宿主細胞中。但是，一個細菌只能接受一種重組質體，而這個轉進去宿主的質體，可以在細菌中大量複製相同的質體。

N1-27

質體 在細菌中會大量複製，大約每一隻細菌可以累積 5~200 個質體 (以 100 計算)；若把這些轉形菌途佈在培養皿上，則由單一細菌所形成的菌落，將只含有一種轉形菌，也就是只含有一種重組質體。

每一個菌落若有 1000 隻細菌，而每隻細菌含有 100 個重組質體，則每個菌落就有 1×100×1000 個均質的純系重組質體，沒有雜夾其他的質體；因為一個細菌只能包容一種質體，而一個菌落只有一種細菌。

因此這種 分子群殖 (molecular cloning) 手法，有點像在『種植分子』，把一個目標基因，經過上述的 純化 與 放大 的過程，得到數目眾多的複製 DNA，可以抽取出來應用。

最後所得到的群落，可以用探針進行雜合反應，挑選出含有目標基因的菌落 (N3-13)。

■■■