生物化學基礎 Biochemistry Basics 2008

核 酸 Nucleic Acid  投影片  N1 - N2 - N3 - N4

回核酸 2

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DNA 的性質與其雙螺旋構造有密切關係，當雙螺旋鏈解開之後，即為 DNA 分子的變性。但 DNA 分子很容易復性，回復原來的雙螺旋構造。在這一開一合之間，若加入其他的核酸分子，即可進行雜合反應 hybridization，檢定兩種核酸分子序列是否相似。

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除了 作為遺傳信息的傳遞外，核苷酸的單位小分子也在很多的生理功能上，扮演重要角色，而且其影響範圍非常廣泛。上面所提示的三種功能，是很多生物都具有的基本功能，顯示核苷酸在演化史上的時間非常久遠，更加強了核酸可能在早期地球演化過程中，是最早具有演化及複製功能的巨分子。 另外，腺嘌呤 (adenine) 一直活躍地參與這些生理功能 (ATP, cAMP, NAD⁺)，暗示腺嘌呤在早期分子演化上的主角地位。

Adenosine 可結合到人類某種神經細胞表面的受體，接著引發一連串信息，主要是 cAMP 及其下游的磷酸化及去磷酸化梯瀑反應，最後導致該神經元細胞反應遲鈍，因此是一種催促『休息』的信號。而咖啡所含的咖啡因，構造很類似 adenosine，可阻礙後者與此受體結合，因此防止神經細胞之遲鈍化，導致咖啡有提神的效果。

■ 有關咖啡的提神效果研究可參考 Nature (2002) 418: 734 (Full text)。

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細胞 內有許多合成方向的反應，都需要核苷酸的參與。例如肝糖的合成路徑中，葡萄糖是以一種活化的形態加入的，稱為 UDP-Glc，它又是由 UTP 與 Glc-1-P 經催化而成。在上述的例子中，葡萄糖要經兩次修飾，第一次是磷酸化，由葡萄糖與 ATP 受 hexokinase 催化變成 Glc-1-P；再來便是和 UTP 結合成 UDP-Glc。

問題：上述兩種把葡萄糖活化的步驟，都要消耗不少能量，為何要如此麻煩？

可以把上圖葡萄糖加入肝糖的反應過程，看作小朋友 (Glc) 到主題樂園去玩，首先要在門口花錢 (ATP) 買票，在手臂上蓋了一個章 (成為 Glc-1-P)，便可進入園區；然後，看到一種把很多小朋友一個接一個連接起來的遊戲，但又必須花錢 (UTP) 變成 UDP-Glc，才能進去玩。做這些修飾的目的，有些是要限制出入的自由 (Glc-1-P)，有些是要變成有資格的基質 (UDP-Glc)，可以被負責催化的酵素辨認。請注意，一旦買了第二段票變成 UDP-Glc，事實上還有很多遊戲可以玩，除了上述的肝糖合成遊戲，也可進行其它主題的反應 (例如纖維素合成、蔗糖合成等)。

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DNA 的功能主要是貯藏遺傳訊息，而其最重要的生化性質，就是兩股核酸長鏈以加熱方式分開，稱為變性。兩股核酸分開後的最大改變，就是鹼基全部暴露出來，而鹼基在紫外線 260 nm 附近，有強烈的吸光，稱為核酸變性的 hyperchromic effect。

經加熱變性後的核酸，若慢慢回復室溫，則兩股核酸上的鹼基，會自行尋找正確配對，因而捲繞回原來的雙螺旋構造，稱為復性。核酸的變性復性現象與蛋白質很相像，並非所有的蛋白質分子都可以正確復性，但核酸卻可以相當正確地找回原來的配對。注意回復溫度的速度不能太快，以免失去配對的正確性。

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若把 DNA 逐漸加溫，分子間的活動力越來越大，也越難維持兩股間的吸引力 (是由哪一種力量所構成？)，到達某一溫度後，兩股一下子分開來，期間的鹼基對全部外露，會增加此 DNA 對紫外光的吸收能力，稱為 hyperchromic effect。其實兩股 DNA 間的吸引力還算相當強，因此不到一定溫度，兩股不會散開來。而每一種 DNA 兩股間的吸引力大小不同，各有其特定的解開溫度，稱為 T_m (melting temperature)，是每種 DNA 的特性。

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為何 每種 DNA 的 T_m 都不一定相同？ 因為兩股間吸引力比較大的，其 T_m 就比較高；而兩股間的吸引力為何有大小之別？ 那是因為兩種鹼基對中，AT 之間只有兩個氫鍵，而 CG 間有三個氫鍵，因此 GC 含量越多的 DNA，T_m 就越大。

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除了 GC 含量會影響 T_m 外，溶液中的離子濃度也有很大影響。若溶液的離子濃度低，則 DNA 的 T_m 也會降低。因為離子可中和兩股 DNA 分子上的強大負電基團 (磷酸)，若離子濃度太低，則兩股磷酸負電無法有效中和，造成兩股互斥而使得 T_m 下降。因此，注意不要把 DNA 溶在純水中，純水中沒有離子中和效果，兩股 DNA 互斥造成變性而沈澱。

問題：RNA 則無此問題，可以溶在純水中，為什麼？

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GC 含量較高造成兩股之間的吸引力加強，因此 DNA 分子密度會顯得比較高。另外，由上圖可發現各種生物的 DNA 中，所含的 GC 成份可能相差很大，有低至 40%，也有高至 60% 以上。

問題：有一大類古生菌，專門生長在溫泉地區，生活環境的溫度很高，請預測這種生物的核酸當中，GC 的百分比應該如何？

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若 把各種生物的基因體取出，經變性分開兩股後，再慢慢降溫復性，則發現各種生物復性所需要的時間不同。可以預測越複雜的基因，其復性時間越長，上圖結果的確支持此一預測。圖中的 C₀t 代表測試核酸的濃度 (C₀) 與復性所需時間 (t) 的乘積，通常若把核酸濃度固定，則只需考慮時間，因此橫座標可直接看成復性所需要的時間。每一條曲線，由左上到右下方看，顯示復性的比例越來越多 (圖的下方 1.0 代表全部都復性成功)，而以其中點 (0.5) 作為比較的基準點。

問題：由這個實驗請整理出，有哪些因素會影響 DNA 的復性速度？

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DNA 變性後可再黏合復性，回復原來的雙股核酸。若取兩種不同來源的 DNA，經變性後混合在一起，假如兩種 DNA 的序列同質性高，則可能會雜合為混成的雙股核酸。也可使用已知序列的核酸小片段，作為探針 (probe) 與 DNA 雜合。

一般實驗操作上可先把樣本 DNA 經電泳分離後，轉印至尼龍膜上，再以放射性探針進行雜合，稱之為 Southern hybridization。 RNA 雖是單股，但也可以在電泳後，與其互補的 DNA 探針雜合，則稱為 Northern hybridization。

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探針 的來源有很多，上圖舉出一例，說明可以由已知蛋白質的一小段胺基酸序列，回推其核苷酸序列，並依此序列進行人工合成探針。

注意對應同一種胺基酸的核酸密碼，可能有數種，例如 Ser 就有 UCU, UCC, UCA, UCG , AGU, AGC 等六種可能，稱為密碼不確定性 (codon degeneracy)。這樣合成人工探針時就會比較麻煩，有幾個對應之道：(1) 把所有可能的密碼全部合成，則探針成為一種混合物，各種可能的序列都有，其精確度降低；(2) 調查該種生物的密碼使用習慣，並選擇較常使用的密碼；(3) 參考不同生物來源的同源基因序列，抄襲所用的密碼。當然，這些方法都各有缺點，好消息是 DNA 的復性，有時不太計較兩股序列是否百分之百互補，有時只要大部份序列配對正確，就可以順利復性。而我們可以控制雜合的條件 (溫度、離子濃度)，來調整復性的嚴苛度 (stringency)，以便得到我們想要的配對精確度。

問題：假如你利用上述原理製備探針，是由已知的胺基酸序列回推核苷酸序列，那麼在使用此種探針進行雜合時，應該要用高嚴苛度，或是低嚴苛度的復性條件？ 。

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合成 探針經放射性磷酸標定後，可用在 Southern blotting 上，與未知樣本中的核酸進行雜合反應。目標基因在細菌染色體中，實驗時必須先把細菌溶解，然後以化學反應使核酸變性，露出單股 DNA，才能與探針進行雜合反應。

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探針 雜合反應的做法實例。

菌落在培養皿長出來之後，先以濾紙複印得菌落，利用氯仿把細菌溶並解釋出核酸，然後以變性解開核酸雙股，再加入標有放射線的探針，進行雜合反應。若某菌落中含有目標基因，便會與探針成功雜合，該菌落的位置便會出現放射線影像；然後再回去挑出原來培養皿上面的菌落，大量培養後可純化目標基因。

■ 本圖接續 N1-27 頁分子群殖，在培養基生長的各個菌落，可以用探針經雜合反應挑出所要的目標菌落。

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Southern blotting 轉印方法： (1) 將核酸以洋菜電泳分離開來；(2) 利用毛細作用把電泳片上的核酸色帶轉印到尼龍膜上。下頁：(3) 取下轉印膜並使核酸變性；(4) 加入放射性探針進行雜合反應；(5) 以放射性顯像觀察所雜合到的色帶。

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Southern hybridization 到現在都還是分子生物學實驗室的必備工具，數十年來在基本做法上沒有太多改變。而基因晶片所根據的原理，還是類似 Southern hybridization 的雜合反應，只是雜合對象的數目變得很多。

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基因 晶片的基本原理，就是利用類似 Southern blotting 的核酸雜合反應。但是比起一般的毛細管轉印雜合，有幾點不同：(1) 以極細微的色點替代電泳色帶；(2) 一次可以處理上千萬個核酸色點，因此對同一樣本可有上千萬個測試；(3) 樣本所需的量極小；(4) 偵測方式簡便快速，也配合電腦比對分析。

基因晶片看起來很炫，也有其實質的效用。但晶片最重要的靈魂，還是在那一公分見方的小玻片，上面所點的到底是何種 DNA。也就是說，每一個點上的 DNA 是什麼，才是最重要的關鍵因素；若這些 DNA 能夠明確指示某種關鍵性疾病的有無，則這塊晶片便是無價之寶。這些重要的 DNA 要從哪裡來？ 當然還是要經由無數的基礎研究，獲得對生物的深刻瞭解後，所得到的基本知識。

晶片製作過程是一種技術 (technology)，而晶片上必須點上何種 DNA，便要靠基礎科學 (science) 來提供，兩者是不一樣的，但絕對相輔相成。其他很多方面也有類似的情形，例如大學裡的教學與研究必須並進，不能偏廢，大家都知道。然而，目前台灣有個很嚴重的問題，可能會影響國本。那就是在研究上，大家只重視可以馬上應用的技術，不太支持長期的基礎科學研究；在大學裡，教授又只重視如何發表大量論文 (不管有沒有用)，不太花時間在教學的努力與改進上。

■ 可參閱 Friend SH, Stoughton RB (2002 四月) 神奇的 DNA 晶片。科學人 2: 40~48。

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ABC type (ATP-binding cassette) pump 是一大群細胞膜上的輸送幫浦，消耗能量以便主動運輸物質通過細胞膜。 其中的某些 pump 可以被癌細胞利用來輸出化學治療的藥物，因而產生抗藥性。這種膜幫浦的構造與胺基酸序列，都有一定的特徵，就是都要有許多穿透細胞膜的疏水性片段，並且一起圍繞成一個通道。

■ 請複習 P3-18 有關膜蛋白的特殊構造，ABC type pump 就是一個很好的實例。

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若 癌症病人的化學治療不成功，則殘存下來的癌細胞會啟動基因中某 ABC type pump，把化學治療的藥物送出細胞，成為可以抵抗化學療法的突變株。上圖 a, b 分別標出化學療法前後，癌細胞中 ABC type pump 的改變，可用專一性抗體辨認之。先把樣本經過電泳，然後轉印到硝化纖維紙上，再用抗體標定出 pump 的位置。這種類似 Southern blotting 轉印方式，並且用抗體來偵測蛋白質的方法，稱為 Western blotting。除了 Southern 是真的有此人物之外，Northern 與 Western 都是科學家後來故意創造的名詞。

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其實 這些 ABC type pump 的基因一直存在細胞內，由 Southern blotting 可以看出，癌細胞產生抗性的前後，都可偵測得到此基因，只是含量有點不同 (a → b)。 但是由 Northern blotting 檢查 mRNA 改變量，發現只有具抵抗性的細胞，才會表現出 mRNA (右上圖)。

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