生物化學基礎 Biochemistry Basics 2008

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回蛋白質 1.3

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由 若干二級構造單位，可進一步組成一個完整的蛋白質分子，即為三級構造。

一些二級構造的組合，經常會重複出現在不同的蛋白質中，例如有許多蛋白質都有 aaaa 的二級構造組成，a₈b₈ 捲成的桶狀構造也常看到；可稱為蛋白質二級構造的 motif，或稱 supersecondary 構造。演化似偏好這些 motif 的構造，可能有其功能或構造上的優點。

Motif 的使用有點氾濫，胺基酸序列、二級構造、DNA 序列等，都有 motif 的稱呼，都是在指那些經常出現的序列片段，經常被重複拿來應用。若胺基酸比喻成文章中的單字，則二級構造的 a helix 及 b sheet 就好像句子，由數個句子組成段落，即為上述的 motif；若干段落可組成文章，即整個蛋白質分子。這樣的一個 motif 段落，若在蛋白質分子構造上成為一個區域，則可稱之為功能區塊 domain。

這些含有數個二級構造的組合，是以何種力量連繫在一起的？ 通常還是以二級鍵為主要力量，除了氫鍵外，在空間上相接近的胺基酸基團若分別帶有正負電荷者，也可以離子鍵相結合。水溶性蛋白質的疏水性胺基酸多藏在分子內部，以疏水鍵造成了一個核心，可以穩定整個蛋白質分子的構造。Cysteine 是帶有 -SH 基團的胺基酸，當兩個 Cys 的-SH 遇在一起時，會氧化形成 -S-S- 的雙硫鍵，可以把蛋白質的兩段脊骨像架橋般接在一起。 雙硫鍵越多的蛋白質通常對熱較穩定，因為分子比較不易被扯開。

由二級構造到三級構造的過程，有比較多且較複雜的步驟或程序，因此對蛋白質三級立體構造的預測，比較不容易。

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三級構造 的氫鍵與二級構造者不同，請注意這些氫鍵並不是在 a helix 之內，那些以脊骨的 C=O 及 N-H 所鍵結成的氫鍵，而是胺基酸側鏈基團間所造成的氫鍵。

問題：二級構造與三級構造的氫鍵，兩者在許多方面不太一樣，請說明其不同點，以及對構造的影響。另外，做這樣的區別有意義嗎？

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金屬離子 對穩定三級構造有相當的貢獻。 許多蛋白質中含有金屬離子，鑲在蛋白質的二級構造之間，可吸引一些側基基團 (-COOH, -SH, -imidazole) 形成配位鍵，以穩定蛋白質三級構造。有些金屬離子，也會直接參與該蛋白質的生理功能，例如參加酵素的催化反應。上圖 zinc finger 是一種常見的蛋白質構成小單位，由一個鋅原子抓住一段 a helix 及兩條 b sheet，形成好像手指的構造，數隻手指組成一個區域，可用來與 DNA 結合。

問題：與蛋白質構造有關的金屬，大多是過渡金屬，如鐵鈷鎳鋅銅等。請問過渡金屬有何特點？為何蛋白質都使用過渡金屬？而不用鋰納鉀等小金屬，或金銀鎘鈾等重金屬？

■ 除 zinc finger 外，還有幾種可與 DNA 結合的蛋白質區塊，請先到 Lehninger Principles of Biochemistry (4e) p. 1088 前後查看這幾種蛋白質的構造特徵。

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對 水溶性蛋白質而言，整個立體構造的中心，大都由非極性胺基酸所組成，非極性基團之間形成疏水性吸引力，可避開外界水分子環境，使得構造更為穩定。反之，大部分的親水性基團，便暴露在分子外側，與外界的水分子有較強的親和力，容易融入水環境中。

想一想，若水溶性蛋白質的核心部份，大多是由親水性胺基酸組成，則如此組成的蛋白質三級構造，便有一個親水性很強的核心，可能會跑出來與外界的水分子結合，就很容易因此造成變性。

但是脂溶性的蛋白質則恰好相反，有一個親水的核心，而其表面多為疏水性基團。這種蛋白質多分布在細胞膜內，是細胞膜蛋白質的特性，例如許多細胞受體 (receptor)、離子通道、呼吸鏈酵素等。

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雙硫鍵 有上述架橋特性，形成堅固的連接，也可經由還原反應打斷；但打斷後的 -SH 也可再氧化回來，恢復雙硫鍵。 因此，早期 Anfinsen 以含有很多雙硫鍵的 ribonuclease A (RNase A) 進行這種可逆反應的實驗，發現 RNase A 可在原態與變性狀態下來回轉變。

後來發現，大部分的蛋白質卻不像 RNase A 一樣地可自由地變性與復性，雙硫鍵的形成或打斷，都需要經由另一種酵素的催化。而要正確地摺疊三級構造，有時需要相當複雜的幫手來協助，這一群幫手統稱為 chaperonin。

問題：Cys 除了形成雙硫鍵以穩定構造外，也可能直接參與催化反應。若你已經有某蛋白質的全部序列，以及其立體結構，將如何區別這兩種不同功效的 Cys？

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Anfinsen 提出一個說法，認為蛋白質的最終立體構形，是決定於其一級構造上的胺基酸序列；也就是說，蛋白質依其胺基酸序列合成出來後，其三級立體構造就可自動形成。蛋白質可能都像 RNase A 一樣，可自由地把雙硫鍵打斷變性後，再經氧化回復雙硫鍵而恢復原態構造；這種說法大家接受了數十年，Anfinsen 也因此得了諾貝爾獎，基本上是正確的，但是後來發現蛋白質摺疊沒有這麼簡單。

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Anfinsen 選用 RNase A 當實驗材料是很幸運的，因為實際上只有少數幾個蛋白質能夠經得起反覆變性與復性而仍然活著，RNase A 是其中佼佼者。現在我們知道，並非所有的蛋白質都可以把它扯開，然後再自動摺疊回去。有許多蛋白質，在剛合成出一段胜肽時，沒有辦法自動摺疊，要靠一類輔助性蛋白質來進行正確的摺疊。這一大群輔助蛋白質，統稱為 chaperonin；某些熱休克蛋白質就有 chaperonin 的功能，是因為在高溫下蛋白質的構形不易維持，要特別誘生 chaperonin 來防止蛋白質進行不正確摺疊。

問題：如上圖所示，要把兩個正確的 Cys 拉在一起，產生正確的雙硫鍵，才能完成正確的摺疊，而不正確的雙硫鍵也很容易產生。你覺得細胞要如何設計機制，才可促使 Cys 完成正確的雙硫鍵？

■ 請參閱 J Biol Chem (2006) 281(14): e11 有關 Anfinsen 的紀念論文。

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萬一 蛋白質合成出來後無法正確摺疊，那可能會送去受另一群 chaperonin 進行矯正，成為構形正確的蛋白質。 若摺疊還是失敗，就會被標上標籤 (ubiquitin) 送到 proteasome 去分解，並回收胺基酸。蛋白質從出生到死亡，一路有照顧或監控機制，都在細胞質中進行。

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Chaperonin 家族中，有些是很大的蛋白質複合體，由二、三十個蛋白質聚集成一個像桶子的容器，初合成出來的蛋白質若構形不正確，就可送到桶子內矯正構形，變成正確的原態蛋白質後，才釋放出來。若如此也摺疊不好，就會被送到另一種桶子，在其中被降解，回收胺基酸使用。 這另一種桶子的構造或外型都與 chaperonin 非常像，也是由很多蛋白質單元所組成的，但其功用是水解摺疊不良的蛋白質。在細胞內，蛋白質分子的生與死是在一線之間，一個蛋白質若不能形成正確構形的分子，馬上會被分解掉。

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Chaperonin 這個字是由 chaperone 衍生來的。如上面 Renoir 的名畫中，在西方社會的社交場合，一些剛踏出社會的少女，通常都會由一名年長的女性陪伴，以免遭人誘拐，這名陪伴者就稱為 chaperone。 (-nin 的字尾通常代表蛋白質)

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Proteasome 的作用，有點像是資源回收筒，而資源回收需要先消耗一些能量。

例如，有一個蛋白質在內質網中無法被 chaperone 正確摺疊，就會被送到細胞質中，先除去一些修飾分子後，貼上泛素 (ubiquitin) 標籤，然後再送到 proteasome 內進行降解。 Proteasome 內部有幾個水解位置 (右下圖)，送入其中的蛋白質分子，被降解成較小片段。 整個過程需要消耗很多 ATP，但可以專一地清除無用蛋白質，並且回收寶貴的胺基酸資源，因此還是划算。

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Proteasome 與 chaperone 在外型上的相似性令人驚訝，直徑大小也相當接近 (但是胺基酸組成就不相似)。兩者的主體，都是由四個環狀的聚合分子所組成，而每個環狀物都是由七個小單位分子所組合的；兩者的順利運作，都需要能量參與。只是，一個是用來導正摺疊不佳的蛋白質，另一則是用來摧毀無法正確摺疊的蛋白質；好像一個是演白臉的勸人向善，另一則是扮黑臉摧毀惡人。

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肌紅蛋白 是第一個被解出立體構造的蛋白質，這件大事也是在劍橋完成，與 DNA 雙螺旋的發現同時同地，但不同人 (Kendrew & Perutz)，卻也是同年領諾貝爾獎 (1962)。這些事都發生在劍橋大學的 Cavendish 實驗室，是一個傳奇的地方，可以參考陳之藩的『劍河倒影』第十三篇『不鑄大錯』，其中所述及的開溫第士就是 Cavendish Lab。文中的科學探索精神，到現今還是一樣適用，鏗然有聲：

『一八七一年，開溫第士實驗室成立。成立的原因是鑒於當時工業革命之後，社會發展的需要，需要新的觀念去處理問題，需要新的技術去解決問題。正如航海時代的英國需要天文研究，需要航海儀器一樣。一百年前呢，蒸汽、機械、以及電工，在在需要深入的探討與研究。當時的劍橋知道需要實驗室的設備，知道動手的重要，更知道實驗方法值得深入，有待摸索。

可是，有些教授卻是持反對論調的。有一位數學權威說：「先生如何教，學生就如何學，要實驗做什麼？」而這些阻擾，尚屬次要；重要的難關是沒有錢開辦！

當時的劍橋大學校長是開溫第士，他的辦法最直捷了當。從自己荷包中拿出六千三百磅來作為開辦費；而房子建起後，錢又花過了預算，校長又從自己荷包中補出二千磅來，這是開溫第士的起源。

…… 這個實驗室中諾貝爾獎金得主之多，是很難令人想像的。布瑞格是二十五歲得獎的；就以現在常常碰面，一同喝茶的得主就有四個或五個之多。』

■ 陳之藩：劍河倒影 (遠東圖書公司)。

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三級構造 被解出來的第一個蛋白質是肌紅蛋白，Kendrew 及 Perutz 因此得到諾貝爾獎。他們使用肌紅蛋白的結晶，從 X-ray 繞射圖譜推算肌紅蛋白分子上，每個原子的立體座標，使人們能夠『看到』一個蛋白質的真正面貌。 而 X-ray 繞射法的發明人布瑞格父子，正是 Cavendish Lab 的先輩；當時小布拉格還在當 Cavendish 的主任，對研究所內有另外兩個年輕人在胡鬧相當頭痛，他們的名字叫 Watson 及 Crick。

問題：蛋白質分子無法用電子顯微鏡清楚看到其相貌，只能用 X-ray 繞射法解出蛋白質結晶中，各原子的相對位置，以此來推算整個蛋白質的分子構造。其實電子顯微鏡之解析力再如何增加，都無法看清原子的相貌，請說明原因。

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各種 胺基酸的側鏈基團，因為其大小、電荷、極性或非極性之不同，對蛋白質二級構造的貢獻也不一樣。大致來說，比較容易形成 a helix 者，就比較不容易形成 turns；遇到 Pro 一定會破壞 a helix 或 b sheet 的形成或延續。上圖只是一個統計資料，並不是說 Gly 一定不會在 a helix 中出現。

問題：由上圖的調查統計，你能否看出一些規律性來？

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由 一條胺基酸序列來預測蛋白質的二級構造是相當準確的。但是，由二級構造還是無法推知正確的三級構造。通常還是要經由 X-ray 繞射分析，或者是核磁共振 NMR 來決定真實的立體構造。這是因為由二級到三級構造，蛋白質的摺疊其實相當複雜，並不是很呆板的堆疊動作，很多蛋白質還需要別種蛋白質的幫忙 (例如 chaperone)，才能正確摺疊。

有一變通方法：若能找到另一種生物來源的類似蛋白質，或是另一同質性極高的蛋白質，而且已解得其立體構造，則可把此未知蛋白質的胺基酸序列套入此已知模型，經比對並推測出可能的立體構造。

右側圖先比較 SP 與 GP 在一級構造上的相似程度，再以 GP 的三級構造為藍本，就可模擬出 SP 的立體構造。L-SP 很奇特地在分子中央多出一段蛋白質，含有 78 個胺基酸，也可以在模擬時插入，請見次頁。

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我 在生技系的研究主題之一，就是植物的澱粉磷解脢 (L-SP) 構造，L-SP 可能在植物的澱粉合成上，佔有非常重要的角色。

澱粉磷解脢在動物細胞中的對等蛋白質為肝糖磷解脢 (GP)，五十多年以來，GP 已經被研究得很清楚，很早就解出其 3D 立體構造。由於 L-SP 與 GP 在蛋白質序列上有 80% 以上的相似度，預測兩者的蛋白質構形也極相像。因此可以用 GP 的構造為藍本，以電腦程式模擬 L-SP 的構造。

另外，L-SP 與 GP 在構造上有一個很不同的地方，就是 L-SP 的分子中央，多出一段約 78 個胺基酸的片段，稱為 L78。電腦程式可以先預測 L78 的二級構造後，再插入所預測的 L-SP 分子中，就得到上圖的模擬構造。依此構造，我們就可以預測 L-SP 的活性催化機制，推測有無調節或控制。

L78 據推測是由 intron 演化而來，變成了 exon，但在表現出來之後，這段蛋白質卻插在 L-SP 的澱粉結合區上面 (如上圖)，使得 L-SP 無法與澱粉結合。後來發現，L78 會被降解，甚至完全切除掉。這實在是說不通，L-SP 把 intron 演化成 exon 表現出蛋白質來卡住自己的嘴巴，然後又要把它切掉。

問題：請幫上述 L78 的困境想一個合理的說法。

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直接 由一級構造的胺基酸序列，來推測蛋白質的立體構造，是非常不容易；但對插在細胞膜上的蛋白質，卻有相當正確的推測結果。原因是大部分的細胞膜蛋白，都有一種大致相似的摺疊規律。

分析蛋白質序列上各胺基酸側基的親水與疏水性質，就可以得到 hydropathic plot；若發現有週期性地間隔出現疏水與親水性片段，就有可能是細胞膜蛋白質。然後，便可推測其立體構造是來回穿梭細胞膜，而疏水性片段就鑲在細胞膜中，親水性片段則分別分布在細胞膜兩側。

問題：這種膜蛋白貫穿細胞膜，其餘的親水部份露在膜外的兩側 (上圖綠色片段)，例如可能是在高爾基氏體的 lumen 側或者細胞質側 (如上面右圖)。請問能否預測某片段是落在那一側？

■ 請先到 Lehninger Principles of Biochemistry (4e) p. 377 前後查看細胞膜上的各種蛋白質模樣。

下接 P3-19

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