生物化學基礎 Biochemistry Basics 2008

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上接 E3-14

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其實 學生很像是酵素,拼命讀書以得到好的考試成果,但每一個學生的讀書或考試表現都不很一樣 (如上圖甲乙丙生)。通常考試章數 (基質濃度) 越多,學生準備考試的效率會好一點 (考 1~3 章),但若考試範圍太多 (考 4 章以上),通常考生會應付不來,只能達到一個飽和點 (或反而考得更糟)。

同時,若以不同章數來考學生,不同的學生就會有不同的表現,如上面每個學生的表現曲線不同;考試章數少的時候 (考 1~2 章),乙生的表現甚至高過甲生。酵素也是如此,有些酵素的表現較佳,有些則較懶散,也各有不同的表現曲線。

在觀察這些情況時,隱約可以發現一件事實,就是不管考得好不好,考試前學生才會開始拿起課本。這點也就是後來動力學研究的最基本起始點,酵素一定要先與基質結合後,才能進行催化作用。

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這兩位 科學家一起完成了酵素動力學公式,也共同命名此一公式。在此之前,已經有一些科學家 (Fischer, Brown & Henri),注意到酵素與基質要先結合在一起的現象。

Michaelis 後來遭到一件科學迫害,他勇敢揭發當時德國科學界大老所聲稱之 defensive enzyme 的假象,指出根本沒有這種東西,因而被迫離開德國,其結果相當悽慘。但是到現在,沒有任何人還聽說過 defensive enzyme,而 Michaelis-Menten 公式卻一直寫在生化教科書上。

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Michaelis 及 Menten 以當時普遍被研究的酵素 invertase (轉化脢) 作為對象,其催化反應如上圖所示,可以把非還原糖的蔗糖,轉化成為兩個具有還原力的單糖 (葡萄糖及果糖)。因此做實驗時,只要把蔗糖加入轉化脢,測量所生成還原力的增高,即可得知酵素活性。

他們在進行實驗時,觀察到一件事實:當酵素的量固定時,若增加基質的量,則反應速率會跟著上升。但此種上升並非沒有限制,當基質增加到某一濃度後,反應速率即不會再增加了,反應速率似乎是受限於其中的酵素分子數量。因此,推想酵素可能要先與基質結合 (E + S → ES),才能進行催化反應。

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其實 動力學實驗很簡單,先分別在各試管內加入不同量的基質,並以相同的酵素量進行催化反應,在固定時間內測定其所生成的產物。由結果可以發現,隨著基質濃度上升,反應也越快速,但基質濃度太高時,酵素的活性 (生成物濃度) 便無法再上升了。

其結果直接作圖如上曲線,此一曲線是雙曲線的一股,並可以用數學式描述之。

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Michaelis 與 Menten 的觀察證實了一個想法,就是酵素 [E] 與基質 [S] 一定要先結合在一起成為 [ES],然後才能得到生成物 [P]。當每個酵素都接滿基質時,[ES] 的濃度將漸趨恆定,因此 [ES] 的生成與其消失速度一樣,稱為 Steady state theory。我們的確可以在實驗中,觀察到反應溶液中有穩定濃度的 [ES]。由此引發了整個酵素動力學的基本研究。

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後來 的研究發現,確實有酵素與基質的結合體存在,此一結合體 ES 的濃度在整個反應過程中,呈現一平衡狀態。在酵素與基質剛混合後,尚未達到 ES 的平衡狀態時,特稱之為 pre-steady state。

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上述的 [ES] 恆定出發,加上三條衍生的觀察,可以一步一步推出動力學公式;上圖把動力學公式的緣由及基本假設,整理出來。

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Steady state theory 可知催化反應進行中的 [ES] 量恆定,也就是說 [ES] 的生成量等於其消失量;而 [ES] 的生成當然是由 [E] 及 [S] 所得來的,而此反應受到常數 k1 的控制,因此 [ES] 的生成量等於 k1 [E][S]。[ES] 的消失量則有兩個方向,其一當然是變成了 [E] + [P],受到 k3 的控制;因此其消失量為 k3 [ES]。另一個消失方式為退回去成為 [E] + [S],即為 k2 [ES]。若 [ES] 消失量等於生成量,則可以得到上圖 (I) 式。

另外,我們定義總酵素量 [Et] 等於自由的酵素 [Ef] 加上已經與基質結合的酵素 [ES],因此可以得到 (II) 式。有時總酵素量會模糊地以 [E] 表示。

催化反應整體表現出來的速率 vo 決定於後半段的反應,也就是說只要看生成物的產量 [ES] → [E] + [P];因此 vo 可以說是 k3 [ES],得到 (III) 式。

若誇張一點,把所有的酵素 [Et] 都變成 [ES] 時,將會達到想像中的最高速率 Vmax,則可寫成 (IV) 式 Vmax = k3 [Et]。

我們由 [ES] 濃度恆定的假設開始,定義並推衍出上面四個基本式子,由其中 (I) 式開始,接著可推導出 Michaelis-Menten 公式。請見下頁的推演過程。

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自行練習以紙筆推演此公式,注意 Km 是如何定義,以及為何要如此定義。

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上圖 是進行酵素動力學的實際操作過程,所需要的設備通常很簡單,操作方法一般也並不很困難,要看分析該酵素活性方法之難易而定。但由動力學實驗所得的資料很重要,可以得知一個酵素與其基質之間的關係,以及該酵素的最大活性,甚至可以推得酵素的作用機制。

通常大學部所開設的生化實驗,都以 invertase 作為範例,追隨當時 Michaelis 與 Menten 的動力學觀察。

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利用上面的數據,自行作圖看看是否與結果的圖形相符。

本實驗應該有一組空白組 (編號 0),不加有基質 ([S] = 0),如上步驟加酵素反應後,所得到的吸光值則為此反應之背景值 (blank),上述數據應該已經扣除此背景值。

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本表 整理出動力學公式的意義及其應用,所有結果到今天仍完全適用。圖中所各個要點及定義,都將在後面的圖表中說明。

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M-M 公式的首要意義,是求得該酵素的 VmaxKm,另外由 M-M 公式及其作圖,可以推出一些酵素的行為模式。

下排左圖說明當基質濃度的高低變化時,會影響酵素反應速率的表現行為;在低基質濃度時,催化速率會隨著基質濃度上升而增高 (一級反應)。在基質濃度極高時,基質濃度就不會影響速率了 (零級反應)。因此,若把基質濃度固定在某一較高的濃度,則所表現出來的反應速率,就與反應液中所含酵素量成正比 (下排右圖)。通常進行酵素的活性分析時,都是在高基質濃度下進行的 (10 倍 Km)。

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上面公式推導,可知我們所設定出來的 Km 常數,居然正是要達到一半最高速率 Vmax 時的基質濃度。因此 Km 越大,表示要達到最高速率時,所添加基質的濃度也要越高,這顯示出基質與酵素的親和力並不是很好 (上面左下圖)。

一般酵素不可能在細胞內以最高速率進行催化反應,若以二分之一的最高速率進行,則此基質濃度剛好是 Km,因此推測細胞內酵素的基質濃度可能就是其 Km

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Hexokinase 可以催化數種六碳糖 (如 glucose, allose, mannose 等),但三者的 Km 相差甚大。 Hexokinase 對 glucose 及 mannose 有較大的親和力 (因 Km 低),而對 allose 親和力很差 (Km 為 8,000 mM)。 檢查比對這三種單糖的分子構造,發現三號碳上面 -OH 基的立體構形有很大的影響;hexokinase 偏好類似 glucose 的構形。

由此結果反推回去想像 hexokinase 的構造,可以推測 hexokinase 與基質結合的活性區,一定有相當專一的空間排列,其空間排列形狀可以與葡萄糖的形狀互補;而且對葡萄糖分子上的三號碳特別挑剔,但對二號碳則較為寬容。

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回來 看 M-M 公式,當基質量 [S] 極大時,Km 可以忽略,則 vo = Vmax;代入基本觀察中的 (III) vo = k3 [ES] 以及 (IV) Vmax = k3 [Et],可推得 [ES] = [Et]。表示當基質很大時,所有的酵素全部轉成 [ES],在此種狀況下,酵素的反應事實上只要看後半段,即 ES → E + P,而此段反應是受到 k3 的控制;此時可以表現出一個酵素的最大催化能力,就特別把 k3 稱為 kcat,即為 turn over number (t.o.n.) 或稱為 molecular activity,是表示一個酵素活性速率的絕對指標。

若基質量小於 Km 時,則可如上圖推演,得到 vo = (k3/Km) [E][S];此時的反應速率受到 [E] 及 [S] 兩者的控制,是一種二級反應;而其常數 k3/Km (kcat/Km) 是酵素對某基質催化能力的指標 (k3 以及代表親和力的 Km)。

以上兩種表示法,次頁各舉了數種例子。

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常數 k3 控制的是生成物的產生速率,因此也可看作一個酵素最後轉換出生成物的速率,特稱之為 turn over number (t.o.n.),也是一個重要指標。 注意其單位為 s-1,亦即每秒鐘能夠轉換得到生成物的分子數目;例如上面 RecA ATPase 的 t.o.n. 為 0.4,表示此酵素要 2.5 秒才能使用一分子 ATP 生成 ADP (DNA 重組時需要此酵素)。

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kcat/Km 可以同時兼顧前半與後半反應,也就是說同時監視酵素對基質的親和力,以及該酵素的 Vmax (kcat),是一個比較理想的酵素行為指標;此一比值越大者,有越好的催化力。由上例可以看出,酵素對不同基質會有不同的表現,chymotrypsin 顯然偏好較大的胺基酸基團,且最好有芳香基團。 酵素的成功催化首先需與基質碰撞,而兩者的碰撞率決定在細胞內的擴散率,但是細胞內的擴散率有其極限;有人由此算出若在最高的擴散速率下,且每次碰撞都完成催化,則一個酵素最高的催化極限,其 kcat/Km 將在 10 8~10 9 (M-1s-1) 之間;的確最有效率的酵素催化也趨近此一範圍,目前最高的記錄是 triose phosphate isomerase 的 2.4×10 8

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一般 測定酵素活性時,是在單位時間內測定所得到生成物的量,如上圖所示。若生成物以 mmole 表示,在酵素每分鐘催化產生得到 1 mmole 時,稱為一個活性單位 (U)。若活性單位再除以蛋白質的 mg 數目,即得比活性 (U/mg)。有時候活性單位可自行定義,因此在使用任何酵素前,要先仔細研究其活性的計算方式,以及其比活性的高低如何,並且注意有沒有添加其它物質。

在一定時間內測量生成物時,要注意生成物的量與反應時間要成正比;要取用如上面右圖所示的直線關係部份,反應時間在 30 min 之內都可以 (因為其 tan 值都一樣)。但反應在 40 min 以後,生成物已不成線性關係,測出來的活性不準確 (會低估或高估?)。

問題:依上例的說法,反應時間在 30 min 之內都可以,你應該會選擇多少時間? 時間若選擇 1 min 好不好?

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雙基質 反應以 hexokinase 為例,可把葡萄糖及 ATP 兩個基質催化產生 Glc-6-P 及 ADP 兩個生成物;因為有兩個基質,因此通常活性區上分別有兩個結合區。

上面酵素動畫非常生動,但也正確地描繪 hexokinase 催化動作。

酵素的漫畫取自 Gonick, L. & Wheelis, M. 所著 The Cartoon Guide to Genetics, 有中譯版。

本網頁最近修訂日期: 2008/02/08