生物化學基礎 Biochemistry Basics 2008

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酵素 動力學是以實驗加上數學演算的方式，來說明酵素的作用與性質；至於酵素的催化機制，則以各種實驗觀察來推想酵素是如何催化的。可以說是把酵素的催化動作，以慢動作一步一步分解，說明它的化學反應機制。

我們先把酵素的催化機制，整理出三種基本動作 (5.1)；並且舉出兩大類研究得最清楚的蛋白脢，仔細說明其反應機制 (5.2, 5.3)。 尤其對屬於 Ser protease 的 chymotrypsin (5.3)，更是重要實例，請一定要反覆研究清楚。另外，經由探討比較 Ser protease 家族的各個蛋白脢成員，也把我們引入催化反應的專一性 (5.4)，以及分子演化的領域 (6.1)。

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棒棒脢 的催化動作，可分成數個步驟，催化機制就是一步一步地探討這些步驟。活性區首先獲得基質，並以正確方向結合之，然後以吸引力誘導棒棒的扭曲，造成折斷後完成催化反應。此一模型正確顯現催化機制的構形扭曲，以及調整空間方向的貢獻，但是對吸引力的作用，則較看不出來。

事實上在酵素活性區中，有許多酸鹼性的催化協助機制，可以幫助酵素或基質，產生更強的反應基團，而達快速反應。 以本頁下半圖為例，酸或鹼可分別對兩種基團進行強化反應性的修飾 (中間 Fast 兩圖)；但是只有在酵素的活性區中，利用預先安排好的基團，同時對攻擊與被攻擊的基團進行強化修飾，才會得到最大的催化反應速率。

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通常 酵素的催化反應是要經過數個步驟來完成的，歸納酵素的各種反應，可以整理出以上三種基本動作；由這三個基本動作，可以組合成各種不同酵素的反應來。而這些選取的動作，可以是同時發生的 (協同式)，也可以是一個一個接續發生的 (順序式)。

協同式催化的代表酵素是 carboxypeptidase (CP) 家族，而順序式的代表是 chymotrypsin (或 trypsin) 家族；剛好全都是蛋白脢。 因為是協同發生的，因此 CP 的催化機制只要用一張圖片就可以完全說明，但是 chymotrypsin 則像連環圖畫一樣，要用六張圖片說明它的連續性反應步驟。我們也舉例協同式為反應較為單純的外切脢，由蛋白質的一端開始，一個一個切下胺基酸；而順序式則屬較為複雜的內切脢，才能把蛋白質從中間切開來。

■ 生物化學基礎網站中，有以上兩種酵素催化機制的動畫。

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協同式 的 carboxypeptidase 作用機制，請參考網頁上面的動畫，及講義上的文字說明。

◆ Carboxypeptidase 催化機制  (以動畫呈現上圖之催化動作)

(1) Zn²⁺ 離子乃重要輔助因子，可吸住基質胜肽鍵上的 carbonyl 基，增強其極性，使 (2) 碳帶正電。

(3) Glu270 吸住水分子，放出 OH^- 攻擊 C⁺ (2)，產生新的 C-OH 鍵。

(4) Tyr 248-OH 上的質子，與氮 lone pair 電子產生新鍵，原來的胜鍵斷裂。

(5) 附近的胺基酸與基質 C-端的 R 基團，有專一性的結合，以辨別基質的極性；同時 Arg145 與基質 C-端的 -COOH 結合，確定基質蛋白質是以 C-端進入活性區。

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Carboxypeptidase A 的立體構造，除了鋅離子外，也標出幾個重要的胺基酸。請注意下一頁中，在加入基質後，這幾個胺基酸的劇烈移動，尤其是 Tyr248 的動作最大。

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中央 的基質進入活性區後，被幾個胺基酸側基關起來，開始催化水解的動作。

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順序式 催化機制的代表： Chymotrypsin 是被研究得最清楚的酵素之一，催化機制的大部分課題均以之為範本說明。上面分子模型分別以彩帶模型及泡泡模型顯示 chymotrypsin，並強調出活性區中的數個重要胺基酸，請自行在上面註明這些胺基酸；另外，彩帶模型顯現出 chymotrypsin 分子有數個端點，是由數條胜肽所組成。

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Chymotrypsin 為何是由數條胜肽所組成？ 其實轉譯出來時是一條完整蛋白質，要先經過另一種蛋白脢 trypsin 在 R15-I16 之間切開，才產生活性；另有一裂解處在 Y146-A149，也會使得 chymotrypsin 具有活性。 為何蛋白質被切開後不會散掉？ 因為這些胜肽之間都以雙硫鍵連結著，仍然保持其三級構造以及正確構形。 最後 chymotrypsin 是由三條胜肽組成，但並不能說 chymotrypsin 含有三個次體，因為這三條胜肽是由一條蛋白質切開後才得到的。一個獨立的次體，必須是由一個獨立基因轉譯得來。

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Chymotrypsin 屬於 Ser protease，是一類極為特殊的酵素，也是演化上極為成功的催化例子；其特點在於利用很平常的一般胺基酸基團，即可以組合出相當強的反應基團，這全靠它的催化鐵三角 (catalytic triad)。

Catalytic triad 因為相鄰三個胺基酸基團的互相吸引，使 Ser195 上的 -OH 質子被 His57 搶走，而成為具有超強反應性的 -O^-。 此 -O^- 攻擊目標蛋白質胜肽鍵上的碳 (carbonyl C⁺)，開始了順序式的胜肽鍵水解催化機制。

我們將循著上面這張整理大綱，一一說明 chymotrypsin 的性質： (1) 如何佈置催化鐵三角，以及環境 pH 及修飾劑對活性區的影響 (2) 詳細的催化機制，可分成兩大步驟，依序進行切開胜肽鍵的反應 (3) 如何穩定中間過渡產物，還是與活性區附近的胺基酸有關 (4) 如何辨別其基質上的胺基酸基團，以便專一性地水解之

■ 有關 chymotrypsin 酵素催化機制方面的研究，在早期的生物化學上，是一段精彩而極有趣的故事，給我們在酵素化學的研究工作很多啟示；有一本由 Scientific American Library 出版的通俗科學書籍 Discovering enzymes (by D. Dressler & H. Potter, 1991)，有極詳細且有趣的解說。

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Chymotrypsin 活性區上面有三個極為重要的胺基酸，雖然原來在蛋白質長鏈上並沒連在一起 (57, 102, 195)，但經蛋白質摺疊後，卻湊在一起成為一直線。然後發生一件非常重要的事，就是 Asp102 搶走中間 His57 的氫，然後 His57 去搶 Ser195 的氫，最後 Ser195 留下一個光溜溜的氧原子，而此氧原子因失去氫而變得極為活躍 (因為有多餘的負電荷)；這就是著名的催化鐵三角 (catalytic triad) 的形成。

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早期 對 chymotrypsin 的觀察發現，其酵素活性受到酸鹼度的影響很大，酵素活性在大約中性時最大，往酸鹼兩方向都會降低活性，而且降幅極大。為何 chymotrypsin 活性會受到 pH 如此大的影響？ 可以分成酸鹼兩個方向來探討，因為其機制不一樣。

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通常 一個蛋白質分子上都帶有電荷，有正電荷、也有副電荷，這些正、負電荷的淨值，即為此蛋白質所帶的淨電荷；蛋白質的淨電荷可能為正、也可能為負，在某 pH 下蛋白質的淨電荷可能為零，則此 pH 稱為此蛋白質的『等電點』(isoelectric point, pI)，一個蛋白質的 pI 通常不會改變。

當環境的 pH 大於某蛋白質的的 pI (如上圖某蛋白質的 pI = 6，環境 pH = 9)，則此蛋白質的淨電荷為負；反之則為正值。另外，環境的 pH 離其 pI 越遠，則其所帶的淨電荷數目將會越大；越接近 pI 時，所帶淨電荷變小，最後在其 pI 處淨電荷為零。因此，蛋白質溶液的 pH 要很小心選擇，以便使該蛋白質帶有我們所需要的淨電荷，或者不帶有淨電荷。

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上述 酸鹼度的實驗中，當 pH 由 7 降到 6 時 chymotrypsin 的活性急遽下降，是否有什麼胺基酸在這個改變的 pH 範圍中，產生很大的改變？ Chymotrypsin 是由胺基酸所組成，而其性質當然是由所組成胺基酸來決定。

回顧一下各種胺基酸的 pK_a，在中性 pH 附近的只有 His 的 imidazole (6.0)，因此是否因為 pH 的改變影響 His 的帶電性質，因而造成活性的下降？ 的確，若把 pH 調到 6 以下，則催化鐵三角中的 His 將會多帶一個質子，而此質子將會加在吸引 Ser195 質子的那個氮原子上，如此 His 將無法吸走 Ser195 的質子，後者也就無法成為活性基團，只是個普通的醇基。

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反過來說，為何 pH 超過 9 後，活性也會急遽下降？ 是否也可以如法炮製，去找一個胺基酸基團 pK_a 在 9 附近者？ 但是發現大部分鹼性胺基酸的 pK_a 都在 10 以上，因此不太可能由一般鹼性胺基酸所為，反倒是 N-端胺基的 pK_a 大約在 9 附近。

原因是 chymotrypsin 在被切第一刀後，新產生一個 Ile16 的 N-端，而此新端點上的 NH₂ 若在 pH 9 以下環境，將會帶有正電荷，在立體構造上與 Asp194 產生離子鍵，抓住 Asp194 後鄰近的 Ser 195 才會就定位，與 His 57 產生質子轉移的效用。 若 pH 調到 10 以上，請自行推理為何活性會喪失？

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假若 沒有 Ile16 的 N-端抓住 Asp194，則 Ser195 將無法擺在正確的立體空間位置，與 His57 產生質子轉移作用；上圖以分子模型顯示此一關係。

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DIFP 與 Ser 型的蛋白脢有相當專一的作用，會與其上的 Ser195 反應，然後形成固定的鍵結，使得該酵素失去活性。 因此，DIFP 是 chymotrypsin 的專一性抑制劑，也是其假基質 (pseudosubstrate)。

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假基質 DIFP 對 chymotrypsin 的抑制，可以被真的基質所對抗，因為兩者都是作用在同一個活性區上。

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Chymotrypsin 的作用機制分成兩個階段，每個階段各有數個步驟。其詳細說明請見講義或課本，同時網頁上有動畫說明，請仔細觀察琢磨。

◆ Chymotrypsin 催化機制  (以動畫呈現上述之催化動作)

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回顧 水解胜肽鍵的反應，胜肽平面上的 -C-N- 碳原子，本來是 sp² 電子軌道，當胜肽鍵水解時，此 sp² 碳先受到水分子的攻擊，多了一個 C-OH 新鍵，變成的中間過渡狀態。因此蛋白脢所辨認的基質，無論 sp² 或 sp³ 都可以結合，有時候也不太挑剃，原本辨識 -CO-N- 的胜肽鍵，卻對 -CO-O- 的 amide 也可結合並且催化反應。

在此可對胜肽鍵的水解做一整理，找出一些共同的機制。大致上都是胜肽鍵上的 carbonyl 碳 (C=O) 被具有強烈負電基團的 -O: (或者水分子上面的氧原子) 攻擊，產生以碳為中心的過渡狀態，然後再斷掉胜肽鍵。Chymotrypsin 的順序式水解則含有兩套如此的攻擊事件，分別由 (1) 活性 Ser 基團上的 -O: 及 (2) 水分子擔任攻擊手。

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酵素 雖然有專一性，但是還是對分子構造相似的基質，有時仍然無法辨認；例如水解胜肽鍵的蛋白脢有時也會水解類似的酯鍵，因此 chymotrypsin 可以使用 nitrophenol acetate 為基質，切出黃色的 nitrophenol，直接觀察黃色的深淺即可得知酵素活性。

但是到底 nitrophenol acetate 不是正常的基質，因此這種反應比較慢，慢到可以觀察到每一步反應過程，反而有利於探討酵素的催化機制。 同時，有一個奇怪的現象發生，理論上 nitrophenol acetate 水解後應該得到 nitrophenol 及 acetate，但是在反應的初期，都無法偵測得到 acetate，過一陣子後，醋酸才會跑出來。 那些醋酸根會跑到哪裡去了？

有一個可能就是，醋酸會不會在反應過程中，留在酵素上面，後來才被切出來？ 科學家 (Hartley & Kilby) 的確是利用這樣的方法，證明 chymotrypsin 有兩階段的催化過程。

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現在 已經知道 chymotrypsin 的催化機制分成 acylation 及 deacylation 兩個階段，其研究是利用 nitrophenol acetate 為基質所進行的；在早期的觀察中，發現催化生成 nitrophenol 的速率有兩個 phases，起先相當快放出 nitrophenol，然後變慢並一直維持此一速度。

利用兩階段式催化機制，可說明為何開始速率會比較快。 這是因為第一階段的 acylation 反應很快，而剛開始酵素都空閒著，一抓到基質就水解並放出 nitrophenol，因此黃色產物迅速上升。但是因為醋酸根還留在酵素上，準備進行第二步的 deacylation，而此一步驟相當慢速，即為 速率決定步驟 rate-limiting step；酵素要在加入水分子，釋出醋酸後，才能繼續吸入 nitrophenol acetate 繼續下一輪反應。因此出現了兩相的反應速率。

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Chymotrypsin 如何穩定過渡狀態？ 可利用活性區附近蛋白質骨架上的 -N-H，因為此氫原子稍帶正電，可中和過渡狀態上的高密度負電荷 (氧)。 Chymotrypsin 的兩個反應階段，都產生類似的中間過渡狀態，也都可以利用相似的方式來穩定之。

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分子模型 標明過渡狀態如何被 Gly193 及 Ser195 上面的 -N-H 所穩定，同時也顯現專一性辨認區，是一個較大且非極性的口袋，偏好大而非極性的基質 (如 Trp)。

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活性區 中催化區與專一性辨認區的模型，請注意所辨認的胺基酸基團，是在胜肽鍵 N-端那邊的基團 (R)。 Chymotrypsin 的專一性辨認區形成一個相當大的口袋，而且口袋內沒有極性的胺基酸，因此偏好水解 Trp, Phe, Tyr 的位置。

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Ser 一族的蛋白脢很多，都是利用 catalytic triad 的活化型 Ser195 來進行催化反應的，因此其催化機制都相同，但它們在蛋白質上所辨別的胺基酸種類不同；這是因為每種 Ser protease 分子上，除了 catalytic triad 外，都還有一個基質辨認區，可以專一性地與所嗜好的胺基酸基團結合。

因為有如此的異同點 (催化機制相同，基質辨別區不同)，因此有人改變了一個蛋白脢的專一性結合區 (trypsin)，而得到具有另一種專一性的蛋白脢 (chymotrypsin)。

蛋白脢有很多屬於蛋白質類的抑制劑，此種抑制劑也會與蛋白脢結合，而蛋白脢雖然可以水解此抑制劑，但被切開的抑制劑會留在蛋白脢上，形成極強的鍵結，因此抑制了蛋白脢的催化活性。例如 trypsin 有很多來源不同的抑制劑，在卵白中有一種稱為 CHOM 的蛋白質，對 trypsin 具有專一性的抑制與結合作用。

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Ser 蛋白脢家族以其專一性區來辨識基質種類，基質的特性決定辨識區的構形。 Trypsin 有一個細長的專一性口袋，帶底還有一個 Asp189，因此其基質都是 Lys 與 Arg 等帶有正電荷的長條胺基酸。 構形的確決定了很多蛋白質的功能與作用。

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科學家 把 trypsin 專一性結合區上面的 Asp189 改成類似 chymotrypsin 的 Ser，結果水解酯鍵的專一性確有改變，但水解一般 amide bond 的則沒有改變。 可能專一性的形成要更複雜，不是改變一個胺基酸就可以完全成功。

■ Science (1992) 255:1249 Converting trypsin to chymotrypsin: the role of surface loops。

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複習 兩個分子之間專一性親和力的成因，有兩大類結合力量。

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碳 原子有四個外層電子，因此可以 sp³ 軌道與四個原子鍵結，例如上左圖中央 sp³ 軌道的碳原子可與 A, B, C, D 四個原子結合。這種電子軌域至少造就了兩件事實：(1) 碳原子可以與另外四個原子鍵結，其中最常見的是與另一個碳結合，這是有機化學的根本；(2) 碳原子不但鍵結的原子數目多，而且當周圍的原子或基團都不一樣時，中心的碳原子就會成為不對稱碳，便產生立體異構物。

立體異構物是兩個或多個分子間，其分子式完全相同，但立體排列不同的分子。 如上右圖的兩個分子，由上面的 A 看下去，雖然都是 B, C, D，但是可能有兩種不同的排法 (順時鐘或逆時鐘)，這兩種分子在立體空間上的排列不同，兩者無法重疊在一起。這兩個立體異構物事實上互為鏡像，特稱為鏡像異構物。

最常見具有立體異構物的分子是胺基酸，其分子上的 a 碳就是一個不對稱碳；因此除了甘胺酸外，所有的胺基酸都可有 D-, L- 兩種異構物，自然界大多只用 L-胺基酸。酵素也會辨別此二種分子的不同，而大多只利用其中之一。

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