生物化學基礎 Biochemistry Basics 2008

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酵素 動力學是以實驗加上數學演算的方式,來說明酵素的作用與性質;至於酵素的催化機制,則以各種實驗觀察來推想酵素是如何催化的。可以說是把酵素的催化動作,以慢動作一步一步分解,說明它的化學反應機制。

我們先把酵素的催化機制,整理出三種基本動作 (5.1);並且舉出兩大類研究得最清楚的蛋白脢,仔細說明其反應機制 (5.2, 5.3)。 尤其對屬於 Ser protease 的 chymotrypsin (5.3),更是重要實例,請一定要反覆研究清楚。另外,經由探討比較 Ser protease 家族的各個蛋白脢成員,也把我們引入催化反應的專一性 (5.4),以及分子演化的領域 (6.1)。

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棒棒脢 的催化動作,可分成數個步驟,催化機制就是一步一步地探討這些步驟。活性區首先獲得基質,並以正確方向結合之,然後以吸引力誘導棒棒的扭曲,造成折斷後完成催化反應。此一模型正確顯現催化機制的構形扭曲,以及調整空間方向的貢獻,但是對吸引力的作用,則較看不出來。

事實上在酵素活性區中,有許多酸鹼性的催化協助機制,可以幫助酵素或基質,產生更強的反應基團,而達快速反應。 以本頁下半圖為例,酸或鹼可分別對兩種基團進行強化反應性的修飾 (中間 Fast 兩圖);但是只有在酵素的活性區中,利用預先安排好的基團,同時對攻擊與被攻擊的基團進行強化修飾,才會得到最大的催化反應速率。

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通常 酵素的催化反應是要經過數個步驟來完成的,歸納酵素的各種反應,可以整理出以上三種基本動作;由這三個基本動作,可以組合成各種不同酵素的反應來。而這些選取的動作,可以是同時發生的 (協同式),也可以是一個一個接續發生的 (順序式)。

協同式催化的代表酵素是 carboxypeptidase (CP) 家族,而順序式的代表是 chymotrypsin (或 trypsin) 家族;剛好全都是蛋白脢。 因為是協同發生的,因此 CP 的催化機制只要用一張圖片就可以完全說明,但是 chymotrypsin 則像連環圖畫一樣,要用六張圖片說明它的連續性反應步驟。我們也舉例協同式為反應較為單純的外切脢,由蛋白質的一端開始,一個一個切下胺基酸;而順序式則屬較為複雜的內切脢,才能把蛋白質從中間切開來。

生物化學基礎網站中,有以上兩種酵素催化機制的動畫。

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協同式 的 carboxypeptidase 作用機制,請參考網頁上面的動畫,及講義上的文字說明。

 Carboxypeptidase 催化機制  (以動畫呈現上圖之催化動作)

(1) Zn2+ 離子乃重要輔助因子,可吸住基質胜肽鍵上的 carbonyl 基,增強其極性,使 (2) 碳帶正電。

(3) Glu270 吸住水分子,放出 OH- 攻擊 C+ (2),產生新的 C-OH 鍵。

(4) Tyr 248-OH 上的質子,與氮 lone pair 電子產生新鍵,原來的胜鍵斷裂。

(5) 附近的胺基酸與基質 C-端的 R 基團,有專一性的結合,以辨別基質的極性;同時 Arg145 與基質 C-端的 -COOH 結合,確定基質蛋白質是以 C-端進入活性區。

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Carboxypeptidase A 的立體構造,除了鋅離子外,也標出幾個重要的胺基酸。請注意下一頁中,在加入基質後,這幾個胺基酸的劇烈移動,尤其是 Tyr248 的動作最大。

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中央 的基質進入活性區後,被個胺基酸側基關起來,開始催化水解的動作。

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順序式 催化機制的代表: Chymotrypsin 是被研究得最清楚的酵素之一,催化機制的大部分課題均以之為範本說明。上面分子模型分別以彩帶模型及泡泡模型顯示 chymotrypsin,並強調出活性區中的數個重要胺基酸,請自行在上面註明這些胺基酸;另外,彩帶模型顯現出 chymotrypsin 分子有數個端點,是由數條胜肽所組成。

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Chymotrypsin 為何是由數條胜肽所組成? 其實轉譯出來時是一條完整蛋白質,要先經過另一種蛋白脢 trypsin 在 R15-I16 之間切開,才產生活性;另有一裂解處在 Y146-A149,也會使得 chymotrypsin 具有活性。 為何蛋白質被切開後不會散掉? 因為這些胜肽之間都以雙硫鍵連結著,仍然保持其三級構造以及正確構形。 最後 chymotrypsin 是由三條胜肽組成,但並不能說 chymotrypsin 含有三個次體,因為這三條胜肽是由一條蛋白質切開後才得到的。一個獨立的次體,必須是由一個獨立基因轉譯得來。

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Chymotrypsin 屬於 Ser protease,是一類極為特殊的酵素,也是演化上極為成功的催化例子;其特點在於利用很平常的一般胺基酸基團,即可以組合出相當強的反應基團,這全靠它的催化鐵三角 (catalytic triad)。

Catalytic triad 因為相鄰三個胺基酸基團的互相吸引,使 Ser195 上的 -OH 質子被 His57 搶走,而成為具有超強反應性的 -O-。 此 -O- 攻擊目標蛋白質胜肽鍵上的碳 (carbonyl C+),開始了順序式的胜肽鍵水解催化機制。

我們將循著上面這張整理大綱,一一說明 chymotrypsin 的性質: (1) 如何佈置催化鐵三角,以及環境 pH 及修飾劑對活性區的影響 (2) 詳細的催化機制,可分成兩大步驟,依序進行切開胜肽鍵的反應 (3) 如何穩定中間過渡產物,還是與活性區附近的胺基酸有關 (4) 如何辨別其基質上的胺基酸基團,以便專一性地水解之

有關 chymotrypsin 酵素催化機制方面的研究,在早期的生物化學上,是一段精彩而極有趣的故事,給我們在酵素化學的研究工作很多啟示;有一本由 Scientific American Library 出版的通俗科學書籍 Discovering enzymes (by D. Dressler & H. Potter, 1991),有極詳細且有趣的解說。

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Chymotrypsin 活性區上面有三個極為重要的胺基酸,雖然原來在蛋白質長鏈上並沒連在一起 (57, 102, 195),但經蛋白質摺疊後,卻湊在一起成為一直線。然後發生一件非常重要的事,就是 Asp102 搶走中間 His57 的氫,然後 His57 去搶 Ser195 的氫,最後 Ser195 留下一個光溜溜的氧原子,而此氧原子因失去氫而變得極為活躍 (因為有多餘的負電荷);這就是著名的催化鐵三角 (catalytic triad) 的形成。

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早期 對 chymotrypsin 的觀察發現,其酵素活性受到酸鹼度的影響很大,酵素活性在大約中性時最大,往酸鹼兩方向都會降低活性,而且降幅極大。為何 chymotrypsin 活性會受到 pH 如此大的影響? 可以分成酸鹼兩個方向來探討,因為其機制不一樣。

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通常 一個蛋白質分子上都帶有電荷,有正電荷、也有副電荷,這些正、負電荷的淨值,即為此蛋白質所帶的淨電荷;蛋白質的淨電荷可能為正、也可能為負,在某 pH 下蛋白質的淨電荷可能為零,則此 pH 稱為此蛋白質的『等電點』(isoelectric point, pI),一個蛋白質的 pI 通常不會改變。

當環境的 pH 大於某蛋白質的的 pI (如上圖某蛋白質的 pI = 6,環境 pH = 9),則此蛋白質的淨電荷為負;反之則為正值。另外,環境的 pH 離其 pI 越遠,則其所帶的淨電荷數目將會越大;越接近 pI 時,所帶淨電荷變小,最後在其 pI 處淨電荷為零。因此,蛋白質溶液的 pH 要很小心選擇,以便使該蛋白質帶有我們所需要的淨電荷,或者不帶有淨電荷。

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上述 酸鹼度的實驗中,當 pH 由 7 降到 6 時 chymotrypsin 的活性急遽下降,是否有什麼胺基酸在這個改變的 pH 範圍中,產生很大的改變? Chymotrypsin 是由胺基酸所組成,而其性質當然是由所組成胺基酸來決定。

回顧一下各種胺基酸的 pKa,在中性 pH 附近的只有 His 的 imidazole (6.0),因此是否因為 pH 的改變影響 His 的帶電性質,因而造成活性的下降? 的確,若把 pH 調到 6 以下,則催化鐵三角中的 His 將會多帶一個質子,而此質子將會加在吸引 Ser195 質子的那個氮原子上,如此 His 將無法吸走 Ser195 的質子,後者也就無法成為活性基團,只是個普通的醇基。

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反過來說,為何 pH 超過 9 後,活性也會急遽下降? 是否也可以如法炮製,去找一個胺基酸基團 pKa 在 9 附近者? 但是發現大部分鹼性胺基酸的 pKa 都在 10 以上,因此不太可能由一般鹼性胺基酸所為,反倒是 N-端胺基的 pKa 大約在 9 附近。

原因是 chymotrypsin 在被切第一刀後,新產生一個 Ile16 的 N-端,而此新端點上的 NH2 若在 pH 9 以下環境,將會帶有正電荷,在立體構造上與 Asp194 產生離子鍵,抓住 Asp194 後鄰近的 Ser 195 才會就定位,與 His 57 產生質子轉移的效用。 若 pH 調到 10 以上,請自行推理為何活性會喪失?

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假若 沒有 Ile16 的 N-端抓住 Asp194,則 Ser195 將無法擺在正確的立體空間位置,與 His57 產生質子轉移作用;上圖以分子模型顯示此一關係。

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DIFP 與 Ser 型的蛋白脢有相當專一的作用,會與其上的 Ser195 反應,然後形成固定的鍵結,使得該酵素失去活性。 因此,DIFP 是 chymotrypsin 的專一性抑制劑,也是其假基質 (pseudosubstrate)。

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假基質 DIFP 對 chymotrypsin 的抑制,可以被真的基質所對抗,因為兩者都是作用在同一個活性區上。

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Chymotrypsin 的作用機制分成兩個階段,每個階段各有數個步驟。其詳細說明請見講義或課本,同時網頁上有動畫說明,請仔細觀察琢磨。

 Chymotrypsin 催化機制  (以動畫呈現上述之催化動作)

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回顧 水解胜肽鍵的反應,胜肽平面上的 -C-N- 碳原子,本來是 sp2 電子軌道,當胜肽鍵水解時,此 sp2 碳先受到水分子的攻擊,多了一個 C-OH 新鍵,變成的中間過渡狀態。因此蛋白脢所辨認的基質,無論 sp2sp3 都可以結合,有時候也不太挑剃,原本辨識 -CO-N- 的胜肽鍵,卻對 -CO-O- 的 amide 也可結合並且催化反應。

在此可對胜肽鍵的水解做一整理,找出一些共同的機制。大致上都是胜肽鍵上的 carbonyl 碳 (C=O) 被具有強烈負電基團的 -O: (或者水分子上面的氧原子) 攻擊,產生以碳為中心的過渡狀態,然後再斷掉胜肽鍵。Chymotrypsin 的順序式水解則含有兩套如此的攻擊事件,分別由 (1) 活性 Ser 基團上的 -O: 及 (2) 水分子擔任攻擊手。

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酵素 雖然有專一性,但是還是對分子構造相似的基質,有時仍然無法辨認;例如水解胜肽鍵的蛋白脢有時也會水解類似的酯鍵,因此 chymotrypsin 可以使用 nitrophenol acetate 為基質,切出黃色的 nitrophenol,直接觀察黃色的深淺即可得知酵素活性。

但是到底 nitrophenol acetate 不是正常的基質,因此這種反應比較慢,慢到可以觀察到每一步反應過程,反而有利於探討酵素的催化機制。 同時,有一個奇怪的現象發生,理論上 nitrophenol acetate 水解後應該得到 nitrophenol 及 acetate,但是在反應的初期,都無法偵測得到 acetate,過一陣子後,醋酸才會跑出來。 那些醋酸根會跑到哪裡去了?

有一個可能就是,醋酸會不會在反應過程中,留在酵素上面,後來才被切出來? 科學家 (Hartley & Kilby) 的確是利用這樣的方法,證明 chymotrypsin 有兩階段的催化過程。

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現在 已經知道 chymotrypsin 的催化機制分成 acylation 及 deacylation 兩個階段,其研究是利用 nitrophenol acetate 為基質所進行的;在早期的觀察中,發現催化生成 nitrophenol 的速率有兩個 phases,起先相當快放出 nitrophenol,然後變慢並一直維持此一速度。

利用兩階段式催化機制,可說明為何開始速率會比較快。 這是因為第一階段的 acylation 反應很快,而剛開始酵素都空閒著,一抓到基質就水解並放出 nitrophenol,因此黃色產物迅速上升。但是因為醋酸根還留在酵素上,準備進行第二步的 deacylation,而此一步驟相當慢速,即為 速率決定步驟 rate-limiting step;酵素要在加入水分子,釋出醋酸後,才能繼續吸入 nitrophenol acetate 繼續下一輪反應。因此出現了兩相的反應速率。

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Chymotrypsin 如何穩定過渡狀態? 可利用活性區附近蛋白質骨架上的 -N-H,因為此氫原子稍帶正電,可中和過渡狀態上的高密度負電荷 (氧)。 Chymotrypsin 的兩個反應階段,都產生類似的中間過渡狀態,也都可以利用相似的方式來穩定之。

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分子模型 標明過渡狀態如何被 Gly193 及 Ser195 上面的 -N-H 所穩定,同時也顯現專一性辨認區,是一個較大且非極性的口袋,偏好大而非極性的基質 (如 Trp)。

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活性區 中催化區與專一性辨認區的模型,請注意所辨認的胺基酸基團,是在胜肽鍵 N-端那邊的基團 (R)。 Chymotrypsin 的專一性辨認區形成一個相當大的口袋,而且口袋內沒有極性的胺基酸,因此偏好水解 Trp, Phe, Tyr 的位置。

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Ser 一族的蛋白脢很多,都是利用 catalytic triad 的活化型 Ser195 來進行催化反應的,因此其催化機制都相同,但它們在蛋白質上所辨別的胺基酸種類不同;這是因為每種 Ser protease 分子上,除了 catalytic triad 外,都還有一個基質辨認區,可以專一性地與所嗜好的胺基酸基團結合。

因為有如此的異同點 (催化機制相同,基質辨別區不同),因此有人改變了一個蛋白脢的專一性結合區 (trypsin),而得到具有另一種專一性的蛋白脢 (chymotrypsin)。

蛋白脢有很多屬於蛋白質類的抑制劑,此種抑制劑也會與蛋白脢結合,而蛋白脢雖然可以水解此抑制劑,但被切開的抑制劑會留在蛋白脢上,形成極強的鍵結,因此抑制了蛋白脢的催化活性。例如 trypsin 有很多來源不同的抑制劑,在卵白中有一種稱為 CHOM 的蛋白質,對 trypsin 具有專一性的抑制與結合作用。

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Ser 蛋白脢家族以其專一性區來辨識基質種類,基質的特性決定辨識區的構形。 Trypsin 有一個細長的專一性口袋,帶底還有一個 Asp189,因此其基質都是 Lys 與 Arg 等帶有正電荷的長條胺基酸。 構形的確決定了很多蛋白質的功能與作用。

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科學家 把 trypsin 專一性結合區上面的 Asp189 改成類似 chymotrypsin 的 Ser,結果水解酯鍵的專一性確有改變,但水解一般 amide bond 的則沒有改變。 可能專一性的形成要更複雜,不是改變一個胺基酸就可以完全成功。

Science (1992) 255:1249 Converting trypsin to chymotrypsin: the role of surface loops。

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複習 兩個分子之間專一性親和力的成因,有兩大類結合力量。

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原子有四個外層電子,因此可以 sp3 軌道與四個原子鍵結,例如上左圖中央 sp3 軌道的碳原子可與 A, B, C, D 四個原子結合。這種電子軌域至少造就了兩件事實:(1) 碳原子可以與另外四個原子鍵結,其中最常見的是與另一個碳結合,這是有機化學的根本;(2) 碳原子不但鍵結的原子數目多,而且當周圍的原子或基團都不一樣時,中心的碳原子就會成為不對稱碳,便產生立體異構物。

立體異構物是兩個或多個分子間,其分子式完全相同,但立體排列不同的分子。 如上右圖的兩個分子,由上面的 A 看下去,雖然都是 B, C, D,但是可能有兩種不同的排法 (順時鐘或逆時鐘),這兩種分子在立體空間上的排列不同,兩者無法重疊在一起。這兩個立體異構物事實上互為鏡像,特稱為鏡像異構物。

最常見具有立體異構物的分子是胺基酸,其分子上的 a 碳就是一個不對稱碳;因此除了甘胺酸外,所有的胺基酸都可有 D-, L- 兩種異構物,自然界大多只用 L-胺基酸。酵素也會辨別此二種分子的不同,而大多只利用其中之一。

增補幾個酵素催化機制的實例   下載連結[Enz(5A) 2008.PPT]

本網頁最近修訂日期: 2009/09/14