酵素純化  Enzyme Analysis

8  蛋白質科技  Protein Technology

基 本:科學研究 - 酵素實驗室 - 酵 素

純 化:蛋白質抽取 - 層析法 - 其他方法 - 純化策略

分 析:蛋白質定量 - 活性測定 - 電泳法 - 蛋白質科技

總目錄

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參考資源

目 錄

8.1  分子量測定

膠体過濾法   梯度電泳法  其他方法

8.2  蛋白質構造與組成

N-端或 C-端  胺基酸組成  胺基酸定序  胜肽圖譜  其他方法

8.3  免疫學工具

抗原製備  免疫流程  抗体製備  抗体應用

8.4  蛋白質新科技

微量科技  蛋白質体學

問題集 

二次元電泳仍是蛋白質科技的重要工具

 Wikipedia  

[Protein]

(comments)

{BCbasic}

連結生物化學基礎

 

     

8  蛋白質科技

參考資源

蛋白質是細胞內最重要的功能性巨分子,多年來對蛋白質發展出許多研究科技,尤其是測定蛋白質分子量、分子構造與組成、微量純化與檢定等,更可產生專一性抗体作為探針,發展微流体平台等快速篩檢工具,使得新的蛋白質技非常多樣化且具強大威力。本章可說是綜合前面各基礎操作的總結與應用,也進一步踏入探討總体蛋白質的概念。

8.1  分子量測定

分子量是蛋白質最基本性質之一,有許多種測定法,最好採用數個方法相互佐證。

8.1.1 膠体過濾法:(參考 2.2)

a. 分子構形的影響:

膠体過濾是依 分子体積 的大小來進行分離,因此若兩種蛋白質的分子量完全相同,但構形較為鬆散者將提早溶離出來,會表現出比較高的分子量。

b. 標準蛋白質 (molecular weight marker):

膠体過濾法需先用已知分子量的標準蛋白質,求出標準校正線,再以內插法求得樣本的分子量。商品供應標準分子量的蛋白質混合液,使用上較方便。標準蛋白質的使用參考 (kD):

Thyroglobulin (669, 330), ferritin (440), catalase (232), immunoglobulin G (160), lactate dehydrogenase (140), serum albumin (67), ovalbumin (43), lactalbumin (14.4)

c. Blue Dextran 2000:

是一種藍色高分子聚醣 (分子量約 2,000 kD),無法進入膠球孔內,會在 void volume (Vo) 溶離出來,其藍色色帶也可用來檢查管柱的裝填是否完善。Blue Dextran 對蛋白質有相當強的吸附性,不要與樣本混合在一起進行膠体過濾。溶離緩衝液的離子濃度至少要在 0.1~0.2 M 以上 (添加 NaCl),以克服膠体介質對蛋白質的吸附力。

d. 管柱條件要保持琠w:

(1) 以膠体過濾法測定蛋白質的分子量時,連同標準品及樣本蛋白質,前後要做數次管柱操作,在這期間管柱的操作條件要保持恆定,不宜中途重新裝填,因膠体的 Vo 等條件可能會改變。

(2) 以 HPLC 或 FPLC 型式膠体過濾法進行分子量測定,可省去很多時間而且準確,是最佳的選擇。

8.1.2 梯度電泳法:(參考 7.2.1c)

垂直式梯度電泳是把膠体做成由上到下濃度漸增的梯度,其膠体孔徑越來越小,蛋白質分子量越小跑得越遠,因此分子量大小就成為泳動率的決定因素。梯度電泳也與膠体過濾一樣,要拿標準分子量的蛋白質做比較,才能定出樣本的分子量。

a. 原態或變性:

梯度電泳可用 disc-PAGE 或 SDS-PAGE 兩種方式,後者雖然可測定變性蛋白質的次体分子量,但若緩和樣本處理時的變性條件,則有時可能看到多元体分子。

b. 蛋白質等電點的影響:

原態的梯度 disc-PAGE 雖然是依照樣本分子量大小進行分離,但若蛋白質分子不帶淨電荷,甚或因 pI 太高而帶相反電荷,則這種梯度電泳就不適用。梯度 SDS-PAGE 則無電荷的問題,結果甚為可靠。

c. 結果判定:

以梯度 disc-PAGE 定原態分子量,對 pI 較低的蛋白質 (4~6 之間),確實有相當高的準確度,但還要用膠体過濾法確認。進行梯度電泳時,可比一般電泳多跑一些時間,染料跑出膠体也無妨,因為蛋白質會卡在較密的膠体中,以增加解析力。在正式論文中,不要以原態膠体電泳做為檢定分子量的唯一依據。

8.1.3其他分子量測定方法:

8.1.3.1 超高速離心法:(參考 3.2)

a. 沉降係數:蛋白質在密度梯度的介質中進行超高速離心時,其沉降速率 (S) 與 分子量、分子密度 與 分子形狀 有關,因此可用來測定分子量。

b. 超高速離心法也可做為一種酵素製備方法,在酵素純化方法中有詳細說明。

8.1.3.2 由胺基酸序列計算分子量:

a. 許多蛋白質已知其核酸 (cDNA) 序列,由此可推得其胺基酸序列,以電腦計算得此胺基酸序列的分子量,即為該蛋白質的分子量。但須注意很多酵素是以多元体狀態存在,其原態分子量就會大很多,要以其他方法佐證。

b. 注意大部分蛋白質都有 轉譯後修飾 (post-translational modification),例如醣蛋白或有其它修飾基團 (輔酶),則實際分子量應該會大一些。反之,若有轉譯後的蛋白質裂解,則分子量又會變小一點。

8.1.3.3 質譜儀分析:

a. 質譜儀可精確測定各種分子的質量,最近也被用來測定蛋白質的分子量,甚至可決定其胺基酸序列,這種技術已趨成熟,可定出 30 個以上之胺基酸序列,在蛋白質体學的應用,對未知蛋白質的身分鑑定是極重要工具。

b. MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 是質譜分析的一種常用方式,先把未知蛋白質以蛋白酶分解成小片段胜肽,這些片段可以在 MALDI-TOF 質譜儀中分別定出其分子量,再與已知資料庫比對後,就可以推知未知蛋白質的身份 (圖 8.1)。

(每張圖均連結有 960 x 720 清晰版本)

c. 蛋白質仍然先用蛋白酶分解成胜肽,分離出每段胜肽後,再以另一種 EI (electron ionization) 質譜儀進一步撞擊胜肽脊骨成更小碎片,分析各碎片的質量可推得這一段胜肽的胺基酸序列,再把每段胜肽的胺基酸序列串連起來,就可以得到整個蛋白質的序列與分子量 (圖 8.2 左 de novo sequencing)。若蛋白質上面有磷酸化等修飾,也可以測得分子量之增加,因而推得磷酸化的位置 (圖 8.2 右)。 

[Protein methods]

 

 

 

 

 

 

[MW determination]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

[Mass spectrometry]

 

8.2  蛋白質構造與組成:

以下各種檢定方法,需要純度極高的蛋白質,最好先以一般的層析法純化後,再用製備式電泳得到均質蛋白質。其中很多反應會與胺基反應,因此樣本中不能有胺基的物質 (如 Tris 或任何胺基酸),以免干擾反應。

8.2.1 N-端或 C-端胺基酸:

現在已經很少單獨測定 N-端,通常都直接去定序。

a. 一般蛋白質都有固定的 N-端及 C-端,N-端胺基酸可使用 dansylation 標以 dansyl 基團,再以 HCl 水解蛋白質。除了 dansylation 外,尚有許多類似的反應可用來檢定 N-端胺基酸 (圖 8.3)。

b. 水解所得的游離胺基酸以 polyamide (TLC plate) 進行 雙向薄層層析 分離,標有 dansyl 的胺基酸在 UV 光下會發出螢光,與已知的 20 種 dansyl 胺基酸比較,即可判定胺基酸種類,亦可用 HPLC 確定胺基酸。

c. 有些蛋白質的 N-端胺基可能經乙醯化修飾而阻礙 (blocked),無法進行反應,尤以植物來源的蛋白質特別常見。遇此情形,可能要分出胜肽片段來定序 (避開 N-端),或者以化學反應去除此一修飾。

d. 有些蛋白質含有數條胜肽鏈,由雙硫鍵連接起來 (如 chymotrypsin),因此會有數個 N-端胺基酸。則要先打斷雙硫鍵,把游離的各段胜肽分開後,再分別定序。

e. C-端可用外切酶 carboxylpeptidase 一個一個切下來,再進行胺基酸測定,由胺基酸出現的多寡順序,即可得知 C-端序列。但因這種水解反應不好控制,較不常用。

8.2.2 胺基酸組成:

a. 蛋白質以 6 N HCl 或 4 N methanesulfonic acid 在真空 110℃ 下水解 24 h,水解液以離子交換 HPLC 分開各種胺基酸,並分別測定其含量,可得知各胺基酸的百分組成。

b. 由胺基酸百分組成的異同,即可比較兩種蛋白質的相似性,並得知蛋白質構造的性質與特徵。例如有一種鎘結合蛋白 metallothionein 含有很高量的 Cys,便是以 Cys 與鎘結合。

c. 使用 HCl 水解蛋白質會破壞 tryptophan,並且使 glutamine 及 asparagine 失去胺基,成為 glutamic acid (合稱 Glx) 及 aspartic acid (合稱 Asx),分析時要注意這些事實。同時,樣本及緩衝液中要避免太多胺基的物質 (如 Tris),以免干擾 HPLC 分析。

8.2.3 胺基酸定序法:

胺基酸序列是一個蛋白質最重要且基本的資訊,除了上述質譜儀定序 (8.1.3.3) 之外,還有兩種方法可求得胺基酸序列。

8.2.3.1 cDNA 間推法:

由蛋白質基因的核苷酸序列,可推得其胺基酸序列,是目前最常用的定序方法 (reverse biochemistry)。此基因一般選殖自 cDNA 庫,在經過群殖、定序等工作,轉譯成蛋白質的胺基酸序列後,就可進行系統性的分析工作;通常以電腦程式搜尋比對,例如 GCG (Genetics Computer Group 工作站)。

比較重要或常見的分析項目如下:

a. 序列鑑定:

若為未知蛋白質,則進入蛋白質資料庫 (Protein Data Bank, PDB) 搜尋,與已知的序列比對,可得知你的蛋白質是已經被發現的,或是一個新的蛋白質。通常都可比對得類似的蛋白質序列,然後推知此未知蛋白質的可能功能。

b. 二級構造分析:

由一級胺基酸序列,可預測蛋白質的二級構造,推得生理功能上的關係。通常三級立体構造無法精確預測,除非有一個已知構造的類似蛋白質可供參考。

c. 功能序列分析:

許多特定的胺基酸片段,有特定的生理功能,稱為 signature。若能找到某些功能序列,則可推測此蛋白質的可能生理角色。例舉 signature 如:各種進入胞器的序列、PEST 降解序列、內質網回收序列 (KDEL) 等。

d. 一般性質分析:

由胺基酸序列可推出此蛋白質的等電點、分子量、抗原決定基片段、各種蛋白酶的水解點等有用資料,目前都有電腦套裝軟体可精確預測。

8.2.3.2 Edman 直接定序:

一個一個把胺基酸從 N-端切下來,然後直接定出其種類。

a. Edman 反應

類似 dansylation 的 N-端標示反應,但是使用 PITC (phenylisothiocyanate) 在蛋白質的 N-端進行修飾反應,生成 PTH 衍生物,Edman 反應後的 N-端胺基酸可以被切下來,再以 HPLC 檢定為何種胺基酸。剩餘的蛋白質部份可以繼續第二輪 Edman 反應,通常手動可進行 10-30 個循環 (圖 8.4),定出其胺基酸序列。

b. 自動定序:

目前都以自動定序儀進行,並且把樣本蛋白質固定在薄膜上,更為方便靈敏。可在電泳後轉印到纖維紙上,切出所要的色帶,直接上機定序。

c. 定序之前的基本資料:

(1) 檢查蛋白質的分子量及四級構造,若有異質多元体,要先分出均質單元体。

(2) 若有分子內或分子間 雙硫鍵 連結,應先還原之,以解開三級構造。

(3) 有無碳水化合物、脂質等修飾物質,或具有 prosthetic group。

(4) 分子量太大的蛋白質應先切成小片段,並分離得各胜肽片段,分別定序。

d. 直接定序的問題:

(1) 蛋白質要先切成胜肽:

由於定序最多只能進行 50 個循環,而蛋白質通常有數百個胺基酸之多,因此長條蛋白質要先切成許多小片段,分離出各個小片段後再進行定序。

(2) 要用兩套不同的胜肽比對:

但定出各獨立片段的序列後,無法得知各片段之先後次序關係。因此要以兩種不同專一性的蛋白酶,製作兩組不同的小片段,兩組的切點不同,以便在分別定序後互相比對重疊部份,找出兩片段的連接點 (見下節)。

8.2.4 胜肽圖譜:

a. 專一性蛋白酶:

可對蛋白質的特定胺基酸進行水解,得到一群不同長短的胜肽片段。兩個不同蛋白質經同一種蛋白酶水解,所得的兩胜肽群,其肽鏈數目、各段胜肽的胺基酸組成與長短均不相同,可鑑定此二蛋白質的相似程度。反之,兩種不同專一性的蛋白酶會切在不同的胺基酸上,對同一蛋白質將得到不同的胜肽圖譜 (如圖 8.5)。

b. 快速得知蛋白質部分序列:

由於細胞生物學的蓬勃發展,對未知蛋白質的探索激增,研究人員多使用胜肽定序的方法,以快速檢定目標蛋白質的身份 (8.1.3.3)。或可定出未知蛋白質的一段胺基酸序列後,反向譯回核酸序列做為群殖所需的探針,或合成人工胜肽以進行單專一性抗体的製備。

8.2.4.1 蛋白質專一性水解:

樣本蛋白質要先經變性處理,把三級構造的胜肽鏈解開,才能以蛋白酶水解之。

a. 專一性內切酶:例舉如下 (胺基酸切位)

Trypsin (Lys, Arg)

Chymotrypsin (Phe, Tyr, Trp)

Sa protease (Asp, Glu)

b. 化學反應法:

CNBr (Met)

8.2.4.2 分離胜肽的方法:

最近由於微量定量方法的進步,以下操作除了可以分離出胜肽片段外,也可以收集分劃或剪出色帶,送自動定序分析,都是很重要的分離檢定技術。

a. 電泳/層析雙向圖譜:

胜肽片段先經高電壓濾紙電泳後,轉 90 度再進行濾紙層析,則可分出各個胜肽片段,也可使用薄層層析,比較方便、快速,這是標準的方法。

b. HPLC:

利用 HPLC 的高解析力,快速分離各段胜肽,多使用反相層析管柱。

c. SDS-PAGE:

由完全水解所切得的胜肽片段,可以 SDS-PAGE 來分析;電泳後也可進行轉印,再用抗体做免疫染色。

8.2.5 其他相關方法:

8.2.5.1 分子消光係數︰

若有均質的酵素,則可將已知吸光度 (280 nm) 的液体樣本,經冷凍乾燥後求其蛋白質的乾重,推得分子消光係數,以做為蛋白質定量的依據。請參考前文 5.3 節,利用分子消光係數來定量蛋白質的方法。

8.2.5.2 蛋白質立体結構:

a. X 光繞射分析是探討蛋白質分子結構的最根本方法,但須先做出蛋白質結晶,對大分子蛋白質而言相當不易。近來多以分子選殖方法,以表現蛋白質進行結晶繞射分析,這是一門亟需專業知識與熟練技巧的研究工作。

b. 使用溶液狀態的蛋白質進行 NMR (核磁共振) 分析,可得溶液狀態下的分子構造,但因為需要大量電腦運算,因此分子量太大者比較不容易處理。

c. 獲知蛋白質的分子構型,並解出此構型與其生理功能間的關係,是研究酵素或蛋白質最極究之層次,能夠做到此階段的論文,通常都可以發表在最重要的期刊。其原因無他,因為所有的生理現象,均可以分子層次的化學反應或交互作用來解釋,這也是生物化學研究的根本精髓。

 

 

[Protein structure]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

[Peptide]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

8.3  免疫學工具

若能得到酵素或蛋白質的抗体,則對其相關研究有非常大的幫助,因為抗体的專一性很高,可做為專一性的探針,廣泛地應用在 ELISA、免疫沉澱或免疫轉印上。有關抗体的製備及詳細的實驗流程,請參考相關免疫學文獻 (如 Harlow E, Lane D (1988) Antibodies, A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory),以下從實用角度,說明生產抗体及其應用的重要事項,以及常見問題之評估。

8.3.1 準備抗原:

a. 蛋白質抗原:

與免疫動物的遺傳背景離得越遠的蛋白質,其抗原性越好,都可順利得到高效價抗血清,通常植物蛋白質都是很強的抗原,而動物來源的抗原就要小心評估。

b. 小分子抗原:

分子量很小的胜肽 (在數十個胺基酸以下者),本身無法誘生抗体,要先結合到大蛋白質分子上去 (稱為 carrier,通常用 BSA 或 KHL hemocyanin)。

c. 半抗原:

分子量極小的一些小分子 (如黃麴毒素僅有數百),稱 為hapten (半抗原),接到 carrier 後也可誘生抗体。

d. 人工合成胜肽抗原:

若已知某蛋白質的胺基酸序列,可以人工合成某段胜肽 (大約十幾個胺基酸),連接到 carrier 後免疫可得抗血清。通常都先以電腦程式 (IEDB Analysis Resource) 預測抗原性較強的胺基酸序列,選出數段進行免疫,可能有些片段不易產生高效價的抗血清。

e. 抗原的純度:

抗原純度越高越好,尤其在製備傳統抗血清時,純度不夠可能會有假結果。但製備單株抗体的抗原可不用完全均質,以方便抗原的大量製備,因為在篩選得單株抗体後,可由免疫轉印確認抗体的專一性,去除不要的單株抗体。

f. 抗原的形式:

一般蛋白質抗原都以溶液形式,加上佐劑處理成懸濁劑後進行免疫 (見下小節),但也可自膠片或轉印紙上直接把色帶切割下來,研碎後加佐劑即可免疫。

8.3.2 免疫流程:

a. 標準免疫流程:

圖 8.6A 是免疫小白鼠的標準流程,在得到足量的抗原後,約需二到三個月的時間來免疫動物。注射的抗原量要適中,過量的抗原,不見得會誘生較好的抗体。最近有商品化的高效能免疫佐劑 (TiterMax),可以在一個月內誘出抗体,並可減少免疫次數,而其效價也不差。

b. 其他免疫流程:

近來有許多快速免疫方法,例如把抗原加佐劑後,直接打入脾臟,以縮短時間或免疫次數,有些血清效價似乎不錯。不過免疫反應相當複雜,有許多科學上的未知現象,若非必要還是採用標準流程,費心思使用特殊方法,不如多考量抗原的本質。

8.3.3 抗体製備:

a. 傳統抗血清:

免疫流程或次數完成後,可試採血看效價如何,多以 ELISA 進行測試。若 ELISA 效價達 5,000 以上 (即血清稀釋 5,000 倍濃度在 ELISA 有 50% 最高呈色),即可進行全部採血。待血液凝固後,離心取上清即得抗血清,儘量使用懸藍式離心機。

b. 腹水採集:

小鼠的全血量很少,但若誘生其腹水,則体積可增大許多。如圖 8.4A 流程中先施打 pristane 減弱小鼠免疫力,再打骨髓癌細胞 NS-1 進其腹腔,可誘生腹水一至數毫升。腹水內多為抗体,可進一步純化出抗体。

c. 單株抗体:

單株抗体針對單一抗原決定基有極高的專一性,是傳統抗血清所無法達致的特點,對蛋白質細微構造的分析很有用處。其製備過程相當複雜,操作順利的話,前後可能需時三個月以上,但若技術與設備均完善,要取得有用的單株抗体並非難事。

d. 免疫球蛋白:

無論是得到抗血清或腹水,應當儘快進行免疫球蛋白 (Ig) 的純化,通常只要硫酸銨沉澱即可得到相當純的免疫球蛋白 (圖 8.6B)。要注意這樣所得到的抗体,其中只有一部份是專一性抗体,因為動物本身有許多原先就存在的抗体,除非是融合瘤細胞所產生的單株抗体。

8.3.4 抗体應用:

a. 轉印及免疫染色法:

是抗体在生化及分子生物學研究最重要的貢獻,其詳細說明請見 7.3.2 所述。

b. 免疫沉澱法:

若把抗体分子接在一固相擔体上 (大多使用 CNBr-Sepharose),則可用來做為專一性的沉澱劑,把樣本中的抗原分子專一性地沈澱下來 (圖 8.7)。

c. 親和層析法:(參考 2.4)

上述接有抗体的固相擔体,也可用管柱方式進行親和層析,以純化抗原分子,將在酵素純化方法中說明。

d. 雙向免疫擴散法:

相當古老的免疫學檢定法,但有其應用上的特色。利用在洋菜膠体上擴散的沈澱圖形,來檢定抗原及抗体間的專一性反應,並可鑑別兩抗原分子間構造上的差異。

e. 酵素免疫分析法 (ELISA):

原理與免疫染色法類似,是利用抗体的專一性去偵測抗原量的多寡,並以酵素為放大信息的標示,因此有相當高的靈敏度。因為使用 ELISA plate 為固相,故操作相當方便,同時可處理大量樣本,但解析力不及電泳轉印的免疫染色法。

 

 

 

 

 

 

[Antibody]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

8.4  蛋白質新科技

分子生物學快速發展 50 年,對核酸的瞭解累積相當基礎,而由核酸所表現的蛋白質,也重現其重要性。新的蛋白質科技,除了強化傳統的純化與檢定能力之外,引入微量科技的概念,蛋白質的分析越來越精密、靈敏且快速,所需樣本量也越來越少。同時,探索對象也由單一蛋白質進入蛋白質体,以更大格局去看整個細胞乃至生物体的活動。

8.4.1 微量科技:

雖然傳統的蛋白質分離純化技術,在初步分離或大量純化上仍然很重要,但對於少量樣本或基因群殖表現出來的蛋白質,則在純化策略之概念有相當大的改變。通常不再拘泥於一步步的純化工作,不再處處講求活性回收及純化倍數,而以一種快速達成的流程,很快鎖定所要的蛋白質,取出少量均質蛋白後便進入微量定序的檢定工作,可馬上得知該蛋白質的身分。這種強迫取分的策略,要靠以下微量純化及檢定系統的建立與發揮。雖然操作策略有變化,但蛋白質純化分析的基本原理是不會改變的。

8.4.1.1 微量純化:

其基本理念是『看得到的,就拿得到』 (what you see, what you get),通常是利用電泳或 HPLC 分離,收集所要的色帶或尖峰,下面列出幾個基本方法。

a. SDS-PAGE 及轉印:(參考 7.3.2)

部分較幸運的樣本,在經過一般的電泳及轉印後,即可得到乾淨的色帶,其上下均無干擾的色帶,則可在定位後切出所要的色帶,立即送去質譜儀確定身份。

b. 二次元電泳:(參考 7.3.4)

若上述方法無法取得單一蛋白質色帶,則須以二次元電泳及轉印,分出所要的色點,切出之後再送定序。以上步驟以圖 8.8 摘錄其進行流程。

c. 膠体內水解:

有一個相當常見的困擾,就是許多蛋白質的 N-端被修飾,也就無法直接以 Edman degradation 定序。若蛋白質量夠大,則可在試管中進行去修飾的化學反應,但通常沒有足夠蛋白質。因此,可以在上述各種電泳膠片中,直接切出所要的色帶,在膠体中以蛋白酶進行水解,所得到的胜肽片段,再經 HPLC 分離後送質譜儀進行定序,現在這樣由膠体到質譜分析的過程,都可在一貫流程中完成 (圖 8.8)。

d. 微量純化系統:

HPLC 或  FPLC 都適合做為微量分離工具,近來又有毛細管電泳或毛細管 LC,但通常在進行這些微量分離之前,都要先以傳統的分離方法進行部分純化。

8.4.1.2 微量分析:

拜科技發展之賜,分析儀器的靈敏度越來越高,因此所需樣本的量也越來越少,在純化上可以減少很多麻煩,但因為靈敏度高,也比較容易受雜質干擾 ,甚至常有受到皮膚、頭皮屑干擾的案例。常用的分析方法如下,通常都是極為昂貴的大型儀器,所幸也有很多商業服務。

a. 蛋白質定序:(參考 8.2.3)

還是以 Edman degradation 為基礎,但靈敏度可達 10~100 pmole,因此一個電泳的色帶已足夠定序。一般可定出 10-30 個胺基酸序列,此序列即可輸入電腦,以軟体如 Lasergene (DNASTAR) 搜尋相似的蛋白質,就可推定其身分。

b. 質譜儀分析:(參考 8.1.3.3)

質譜儀可以精確檢定樣本的分子量,因此蛋白質水解後的片段,可用質譜儀精確定量求得分子量,而目前以質譜儀進行胜肽片段的定序也不成問題,更可推出此片段上的各種修飾,例如磷酸化、醣化修飾等。通常質譜儀分析緊接在 LC 分離之後進行,寫成 LC/Mass 或 LC/Mass/Mass,看後面接著幾次質譜分析。

8.4.2 蛋白質体學:

進入 21 世紀後生物學的第一件大事,就是人体基因的核酸序列完全解碼,這是號稱 Genome Project 的浩大工程。在得到人体所有的基因序列後,第一件可以做的事,就是把這些基因所表現的蛋白質翻譯出來,可獲知一個生物的整体蛋白質体,如此被模糊稱為 proteomics 的是一個龐大資料庫,可能有無限的後效及超出想像的發展。

8.4.2.1 如何看待 proteomics?

a. 隨著生長期間、內部調控、外來因素等影響,一種生物的 genome 可以表現出許多不同的 proteomes,因此蛋白質体是比基因体更為複雜的研究對象。

b. 基因体似乎就是永遠在細胞核裡,然而蛋白質被表現出來之後,不但有修飾、組裝、運送等過程,也有其興衰的生命週期,因此生物細胞並沒有一個固定的蛋白質体,它永遠在變化著。

c. 然而蛋白質体也有其相對恆定的一面,雖然各類蛋白質的構造都非常複雜多樣,但也可歸納出幾種基本構造 (module),而這些 modules 的功能大都可以預知。構造類似的蛋白質,幾乎都擁有相同的功能,由胺基酸序列比對就可準確預測。

d. 基因体的大小與生物的複雜度不一定成正比,例如人類的基因數目其實並不多,因此其複雜度可能來自蛋白質的修飾調控,甚或蛋白質回饋去調節基因表現。

8.4.2.2 Proteomics 就是蛋白質化學?

a. 的確蛋白質体的微觀基礎就是傳統的 蛋白質化學 protein chemistry,後者通常針對單一蛋白質進行細部的分析研究,反觀蛋白質体則擴大格局與範圍,以高產能、更快速、超微量的高端分析儀器,來檢視整個細胞或生物体的全体蛋白質,在研究態度與使用的工具上,都有很大的不同,但二者是密切相關。

b. 蛋白質化學通常以得到整個蛋白質分子的序列為目標,而蛋白質体學反而只要部分序列,配合生物資訊學的龐大資料庫,部分序列已足以鑑定任何未知蛋白質,並由此深入探勘更多細節,由點到面的擴展研究層面。進行任何層次的研究時,切勿忘記在蛋白質化學的基礎上,配合生物資訊學這個強大的工具。

c. 傳統蛋白質化學聚焦在少數目標蛋白質的構造功能關係,一步一步地解決問題,有如一次大戰的陣地壕溝戰。然而蛋白質体學勢必要加入 系統生物學 (systems biology) 的全新陣營,聯合基因体、轉錄体、代謝体、信息傳導,以及任何已知或未知的細胞生物學体系,一起利用大資料庫、數位運算、統計分析、模擬預測等,創造出更多樣而立体的觀察系統,推到前所未有的生物運作模式。

8.4.2.3 Proteomics 與代謝体:

a. 檢查一個生物蛋白質体的所有酵素,應當可以拼湊出某細胞的代謝途徑。例如當我們看到某病原菌的蛋白質体有 hexokinase,以及其它相關的 glycolysis 酵素,則可推斷此菌有糖解作用,甚至有其下游的 TCA cycle 等。此外,信息傳導也是一個龐大網路,蛋白質体學一定會發揮重要功能。

b. 如此可瞭解該病原菌的整体代謝與傳導,並找出其特殊弱點加以攻擊;反之也可以改變一個有益菌的代謝,使其代謝產物更能夠符合人類的需要。J. Craig Venter 在 2010 年製造人工的染色体,並且殖入黴漿菌空殼,宣稱為第一個人造細胞。

c. 對傳統生物化學的代謝部分,應該有全新的角色與認知,雖然短期內每一條代謝路徑都不會有變化,但我們勢必得重新出發,以蛋白質体的心情解讀整體代謝,以更大格局去連結各路代謝的互動,或許就是所說的 代謝体學 (metabolomics)。

d. 人類大部分疾病幾乎都與代謝有關,也可以在基因体上找到根源,因此若能標出造成病變的基因,也就能找出造成病變的標誌蛋白質 (marker protein),而這些病變蛋白質很多就是酵素,病變連結著酵素活性及功能的缺陷,這也是為何我們要如此重視酵素研究的主因之一。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

[Proteomics]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

(TED: JC Venter:

Synthetic life)

 

 

問題集   (每個問題不一定都有標準答案,甚至會引起很大的爭議,但這就是問題集之主要目的)

 1. 你在純化得某酵素後,經定序得到其 N-端的 15 個胺基酸序列,請問接著可以進行那些實驗?各有何目的或用途? [2]

 2. 請列表整理出所有決定分子量的方法,並比較其優缺點。 [1]

 3. 電泳後進行蛋白質轉印,再用抗体染色後,結果: [3]

a. 發現除了標準品的藍色色帶存在之外,其餘各樣本空白一片,請問可能原因。

b. 發現連標準品也都空白一片,請問可能的原因。

 4. 若你的蛋白質 N-端已被乙醯化,無法進行胺基酸定序,則你將如何定出該蛋白質的部份序列? [2]

 5. 胺基酸組成分析可得知蛋白質中各種胺基酸百分比,但 Asn 會水解成 Asp,Glu 水解成 Glu。也就是說只能測得兩者的和 (以 Asx 或 Glx 表示),而無法直接測得 Asn 或 Gln 的量。請問你如何可以推出所測得的 Glu (Asp) 中含多少 Gln (Asn)? [3]

 6. 為什麼只有 Edman 反應能夠應用在胺基酸定序?而 dansylation 不行? [2]

 7. 免疫化學書上提到,抗体可以與抗原結合而沉澱下來,但在生物化學之應用時,此抗体通常都要附在一固相擔体上,才能做為免疫沉澱劑。為何要如此麻煩,不直接以抗体來沉澱抗原? [3]

 8. 當群殖得某酵素的 cDNA 並已定序,但其活性分析方法極為困難,或根本不知此酵素的活性時,則在純化過程中,你有何方法可以追蹤此酵素? [4]

 9. 生產傳統抗体時,抗原純度一定要非常高,否則可能會有交叉反應,但在生產單株抗体時,反而可以用不很純的抗原去免疫。請問這要如何進行?有何先決條件? [5]

10.澱粉磷解酶與 b-澱粉酶的基質都是澱粉,但兩者的催化反應不同,分子構造上也無相同之處。當使用澱粉磷解酶為抗原製備單株抗体時,發現所得到的抗体有很多株 (約一半) 都會對 b-澱粉酶有交叉反應,反之若以 b-澱粉酶為抗原所得的抗体,也有少部份對澱粉磷解酶會有反應。請解釋這是如何造成的? [4]

11.蛋白質轉印後,以免疫染色所得染色色帶的深淺,能否做為定量蛋白質的依據?請問這樣的定量方法,有無可能的失誤?如何改進或注意? [4]

12.若把短鏈胜肽 (約十多個胺基酸) 連到 carrier 上做為抗原,進行免疫後可以得到抗体,稱為 monospecific Ab。某生由其酵素 cDNA 序列轉譯的蛋白質序列上選出一段特殊序列的胜肽 (VALIWVVSAIL),以此進行抗体製備,結果也得到了抗体。但發現此抗体在進行蛋白質轉印的免疫染色時,對 disc-PAGE 膠片的轉印膜無法呈色,而呈一片空白,同時對 SDS-PAGE 轉印膜,則只能看到很淡的色帶。請問發生了什麼毛病?如何解決問題? [4]

13.假設此生得到另一種完全不同的結果,SDS-PAGE 免疫轉印得到很強的呈色色帶,但對細胞的粗抽取液樣本做檢定時,對不含此一酵素的控制組,卻也有免疫呈色,請問如何解釋? [5]

14.續上兩題,另一位同學則以電腦軟体搜尋較強的抗原決定基,選了該蛋白質很靠近 N-端的一段序列 (MILAKKSVALV),同樣進行抗体製備,所得抗体對細胞的粗抽取液樣本做檢定,結果在兩種 PAGE 膠片上預期分子量的位置,完全看不到呈色的色帶,但在預期分子量稍高處,隱隱發現有一很淡又很細的色帶。這又是發生了什麼問題? [5]

15.請由右圖澱粉磷解酶的酵素動力學結果,推測基質 (澱粉及 Glc-1-P) 與酵素之間的作用關係。 [4]

16.禽流感病毒 (AIV) 外殼有一種血液凝集素 (hemagglutinin, HA),是入侵宿主細胞的關鍵分子,HA 與宿主細胞膜上的接受體結合,接著啟動一連串機制,把病毒基因送進細胞內,開始病毒的感染、繁殖、擴散生活史。HA 在宿主體內被切開為 HA1 及 HA2 兩部分才有正常功能,但仍然維持其立體構造;HA 也會被醣化 (glycosylated),可能有保護病毒的功能。以 H6N1 (2838V) 的 HA1 為例,從其胺基酸序列預測有數個醣化位置,若先進行去醣化處理 (下圖 A 的 P +),則 HA1 的分子量由 a 降到 b,再分別把 a 及 b 切出來以 trypsin 水解成片段後進行質譜儀分析,各片段序列分析結果如 B 圖,發現 b 比 a 多出三個片段,請說明這個結果的作用機制是如何進行的。[4]

17.請寫一篇 500 字的評論短文,必須含有以下關鍵字 (不限定出現順序):基因体學、蛋白質体學、代謝体學、酵素學、美麗新世界,並自行訂定合適的題目。另外,請把此短文內容以一張投影片具體陳述,並可在 5 分鐘內口頭說明清楚。 [5]

18.上面的報告方式,也可以使用這個題目:人類的遺傳密碼使用 A, T, C, G 四種單位分子組成,而植物、微生物甚至病毒,基本上也都一樣使用這四種分子。那麼,人類比起地球上其他生物的價值或存在意義為何? [5]

[題目後面方括號內的數字代表該題的難易程度,3 為中等而 5 最難回答,需要一些討論與思考]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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本網頁最近修訂日期: 2017/09/19