酵素純化  Enzyme Purification

4  純化策略  Purification Strategy

基 本:科學研究 - 酵素實驗室 - 酵 素

純 化:蛋白質抽取 - 層析法 - 其他方法 - 純化策略

分 析:蛋白質定量 - 活性測定 - 電泳法 - 蛋白質科技

總目錄

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參考資源

目 錄

4.1  純化步驟設計

影響因素  組合純化步驟 

4.2  純化結果

純化表  檢討純化表  純度要求 

應用問題 

 

 Wikipedia  

 [Purification]

(comments)

{BCbasic}

連結生物化學基礎

 

   

想辦法由一堆蛋白質中純化出目標酵素

 

4  純化策略

參考資源

正確的純化策略極為重要,往往可以使純化達到事半功倍之效,因此事前要有極為充分的準備與規劃過程。但有時對目標酵素所知甚少,就要一步一步嘗試,像是摸著石頭過河,小心追蹤每一個步驟回收多少酵素活性?

4.1  純化步驟設計

4.1.1 影響純化的因素:

設計純化步驟時,要考慮 Recovery (高回收率), Resolution (高比活性、高純度), Speed (方便與快速), Capacity (經濟) 四個因素。

a. 高回收率:

一般指總活性的回收,最終回收率若低於 30% 就得檢討過程是否有問題。

b. 高比活性:

酵素的 比活性 要能夠顯著提高,最終純化成品與原始粗抽液二者間,其比活性之比值稱為 純化倍率(purification fold)。各種酵素因材料來源及含量多寡不一,純化倍率也有高低,不過就同一樣本而言,當然越高越好。

c. 高純度:

純度活性 是酵素純化的兩大目的,以達到均質酵素為最終目標;相對而言,在電泳上看不到其它雜質,即可視為均質,但也只能說是 electrophoretically pure。絕對均質的酵素幾乎是不可能,我們只能達到相對純度。

d. 方便與快速:

方法要儘量簡便,步驟勿拖太久,因為酵素活性會隨著操作時間而急速降低,尤其對較不穩定的酵素,時間是最重要因素,有時不得不犧牲其它要求。

e. 經濟:

許多試劑相當昂貴 (尤其是活性分析用藥),大量使用時要考慮到經濟問題,因此每次操作所能處理的樣本量也是關鍵。

4.1.2 組合純化步驟:

a. 組合標準:

(1) 已知的酵素,可先依照已發表論文的步驟進行,有問題再作改進。通常都是以 硫酸銨分劃-膠体過濾-離子交換 為骨幹,再加上其它方法,組成全部流程。

(2) 對完全未知的酵素,亦可循此骨幹先試行純化,視其結果如何再加改進。

(3) 不要忘記利用該酵素的特殊性質來純化,例如在其 pI 沉澱、特別的疏水性、有專一的抑制劑,或異常的熱穩定性等。

b. 純化方法分類:

(1) 每種純化方法都是利用蛋白質分子的某種特性來分離的,圖 4.1 把所有的純化方法,依其運用特性分類歸納,以作為設計流程時的參考。

(2) 通常同一種純化方法不會重複使用,最好是交叉利用各種蛋白質的不同性質,來設計一連串的純化步驟

(每張圖表均連結有 960 x 720 清晰版本)

 

[History]

 "Urease could be isolated and crystallized"

(The chemical nature of an enzyme)

 

[Strategies]

 

(PubMed)

[Purification]

4.2  純化結果

a. 純化表

最終純化結果以 純化表 (purification table) 摘要整個過程及成效,例如表 4.1 所示。總活性除以總蛋白質量就是 比活性 (specific activity),請參考表 4.1 下方 (a) 的算法指引。比活性逐漸增加的比數即為 純化倍數 (purification fold) (b),而以粗抽取液所含活性為 100%,每個步驟所收到的總活性百分比,稱為 回收率 (recovery) (c)

b. 檢討純化表:

若回收率超過 100% 時,表示粗抽取液中可能含有酵素之 抑制因子,或含有干擾活性分析的物質,經去除後酵素活性大增。若回收顯著偏低,表示此一純化步驟並不理想,應探討緩衝液、溶離液成分有無問題,或者是純化流程設計是否不良。有時候目標酵素根本沒有從材料中被有效抽取出來,一開始的收率就很低,就要檢討萃取過程。

c. 純度的要求:

如上表所純化得到的酵素,以電泳檢定已達相當純度,應可供大多數生化學實驗需要,若有必要,可再經製備式電泳或其它方法純化。請注意並非所有的實驗都必要使用均質酵素,有很多實驗 (如酵素動力學、分子量測定) 都不需要完全均質的蛋白質。

 

(Author Kornberg)

"Don't waste clean thoughts on dirty enzymes"

 

(Purification table)

(PubMed)

 

應用問題   (每個問題不一定都有標準答案,甚至會引起很大的爭議,但這就是問題集之主要目的)

 1. 以下是某研究生甲純化酵素 A 的過程概述: 甲的最終目標,是要從植物的癒創組織中純化酵素 A。當收集得足夠量的癒創組織後,加入適量緩衝液 (1 mM Tris-HCl, pH 7.0),以研砵進行研磨,因為怕酵素失去活性,儘快離心收集得 100 mL 上清,進行下一步驟。很快加入 50 g 硫酸銨,使達到 50% 飽和度,得上凊約 40 mL;再加入 25 g 硫酸銨,使成為 75% 飽和度,離心取沉澱,這是依照前人研究報告取 50-75% 飽和度的硫酸銨沈澱。溶解在 5 mL 緩衝液後,通入 DEAE-Sepharose 管柱中,據文獻說酵素 A 可被陰離子交換介質結合。膠体已平衡在緩衝液,裝填在 1.6 × 60 cm 的玻璃管柱。樣本通入後,以緩衝液洗過數個管柱体積,開始拉 0~0.5 M NaCl 濃度梯度,並同時收集流出液。很奇怪,發現蛋白質幾乎都不見了,溶離圖譜沒有明顯的蛋白質尖峰。只得重新抽取,再用硫酸銨沉澱後,改以膠体過濾法分離之,這次用 2.6 × 50 cm 管柱,使用 Sephadex G-50 膠体。結果出現一個大的蛋白質峰,也有酵素 A 活性,甚是高興。趕緊做 disc-PAGE 及 SDS-PAGE,結果發現膠体過濾法前後的蛋白質電泳圖譜,都差不多。算一算總活性回收量,也不到文獻報告的十分之一。請指出甲生可能造成的所有錯誤,並幫他設計一個可行的純化流程。 [4]

 2. 某蛋白質 B 在不同的緩衝液下,會有不同的四級構造 (如下式),且這種轉變是可逆的。

          aabb (緩衝液甲) → abab (緩衝液乙)

(1) 請解釋此一現象發生的可能原因。

(2) 請利用這個特性,設計一個層析法來純化蛋白質 B。 [3]

 3. 動物的血清白蛋白 (albumin) 經過蛋白質水解處理後,成為胺基酸混合液,可供醫療上針劑使用。但若水解不完全,可能有分子量較大的胜肽片段,打入人体後會產生抗体,相當危險。且白蛋白中經常有多醣類雜夾其中,無法被蛋白質水解 酶水解,分子量很大,可能是更危險的抗原。請問有那些方法,可以有效的除去這些有害的物質,同時可大量處理,以便大量製得,供醫療上使用? [3]

 4. 蛋白質 CD 的分子量分別為 49,000 及 47,000,但是 C 分子中含有 70% a helix,在 pH 8.8 下其 helix 構造會變性而成為 random coil,但仍保持其水溶性,當 pH 調回中性時回復原態;蛋白質 D 在兩種 pH 下均為原態。請設計一個方法,可分離此二蛋白質。[4]

 5. 經過部分純化的酵素 E,在緩衝液中為清澈溶液,在水中透析三日後發現:

a. 透析袋內有沉澱發生,離心後分別收集上清及沉澱,上清活性剩約五分之一,沉澱及外液則均無酵素活性。

b. 上述透析袋內的上清及沉澱,測蛋白質量,總共只有原來透析前的一半。

c. SDS-PAGE顯示透析外液不含蛋白質,但有 ninhydrin 反應及 280 nm 吸光。

請問:

(1) 為何會產生沉澱?

(2) 總酵素活性為何下降許多?列出所有可能情形。

(3) 袋內蛋白質量只剩一半,請作一假設,說明原因。

(4) 請設計一個實驗,證明你的假設。 [4]

 6. Lectin 是植物的一類特殊功能蛋白質,可與各種醣類分子產生專一性的結合。有一 lectin F,它與葡萄糖有相當專一性的結合,請問你如何以最簡單的層析方法來純化之? [4]

 7. 蛋白質間可以用架橋分子連在一起,成為二元体、三元体或多元体。現有 G, H 兩蛋白質,架橋反應後以 SDS-PAGE 檢定之,得如 Fig. 1 結果。

+:蛋白質經過架橋處理 -:未經架橋處理之蛋白質

Marker:已知之蛋白質 (分子量 15,000) 經架橋處理後,所得之各種聚合物

另以膠体過濾法測 G 及 H 的分子量,二者均為 90 kD。

請由這些結果,推論 G 及 H 兩蛋白質的四級構造。 [5]

 8. 酵素 I 的純化流程如下:

材料 (甘藷) 切碎

↓ 加緩衝液均質化

粗抽取步驟 (依一般方法進行)

↓ 離心

 上清

↓ 0.3~0.5 飽和度硫酸銨分劃

Crude I (酵素粗抽液 Xt)

↓ 膠体過濾 (Sepharose CL-6B)

溶離得 P1, P2, P3 三尖峰 (Fig. 2)

↓ → 電泳 (Fig. 3) disc-PAGE

Peak P1 (只有 P1 有酵素活性)

↓ 離子交換 (DEAE-Sepharose)

↓ 以緩衝液洗過一個管柱体積

↓ 0~0.3 M NaCl 梯度溶離

Fig 4 得 P4, P5 兩個尖峰 → Fig. 5 各分劃做 disc-PAGE

Peak P4 (只有 P4 有酵素活性)

請問:

(1) Fig. 2 上 P3 的各分劃 (#55~65),在電泳 Fig. 3 上幾乎都不見了,請解釋為何。

(2) P1 本有一些雜質 (Fig. 5 中打 * 處),但經過離子交換之後,在 0~0.3 M 梯度收得的各分劃,以電泳檢視時 (Fig. 5),找不到這些色帶,它們可能在那裡?

(3) Fig. 5 中 #35, 40 多出現一個高分子量色帶 (箭頭處),可能是如何產生的?

(4) 你對這樣的純化結果滿意嗎?請再改進以上的純化步驟。 [5]

 9. 某蛋白質樣本通入 DEAE-離子交換介質,以純化其中的酵素 J,樣本中原含有 50 mg 蛋白質及 100 活性單位酵素 J。以 0~0.3 M NaCl 梯度溶離得數個 280 nm 尖峰,依次標以 P1, P2, P3, P4 及 P5,分別收集之,分析均無任何酵素 J 活性。另外測得以下結果:

a. 各蛋白質峰的蛋白質總量為 46 mg。

b. 當混合 P2 及 P5 後,可測得約 280 單位酵素 J 活性,其它的混合均無活性。

c. 當混合 P2, P4 及 P5 後,只測得 98 單位的酵素 J 活性。

d. 測 P5 的蛋白質含量只有 0.5 mg。

請問:P2, P4 及 P5 分別含有何種物質? [5]

10. 某酵素 K 的活性分析方法如下,L 為其耦合反應酵素,使用 NAD+ 為輔酶。

             

在進行硫酸銨分劃後,得到 Fig. 6 的結果。

請問:

(1) 活性分析結果有兩個 K 的活性尖峰,可能的原因為何?   (至少列出兩種假設)

(2) 請設計實驗,分別可以證實上題假設。

(3) 若把硫酸銨 30~80% 飽和度間的部分收集起來,再進行膠体過濾,結果 K 的活性回收率多達 250%,則那一個假設為真?

(4) 上清蛋白質量不多,但出現相當高的活性,是何原因?請設計實驗證明你的假設。 [5]

11. M 為一相當不穩定的酵素,尤其在低 pH 下容易變性,乙、丙、丁三人以親和層析法純化之,他們的實驗設計如下:

將 M 的基質衍生物 N 耦合到某種親和擔体,洗去反應液後,把擔体裝入管柱,然後通入部分純化的 M,再用游離的 N 溶離下 M。三人的實驗條件略有不同:

所用親和擔体:               耦合緩衝液:   溶離條件:

[乙] CNBr-Sepharose         Tris pH 8.0         游離型 N

[丙] Agarose-C6-COOH    磷酸 pH 7.5       游離型 N → pH 2.05 甲酸

[丁] CNBr-Sepharose         磷酸 pH 7.5       游離型 N → pH 2.05 甲酸 → NaOH pH 12

所得結果也有相當的差異:

[乙] 發現 N 根本沒有耦合到擔体上,酵素 M 無法結合上去。

[丙] 酵素 M 很難溶離下來,要使用 pH 2.05 的劇烈條件,才能洗下蛋白質。

[丁] 酵素 M 是被結合到擔体上了,但無論用何種方法均溶離不下來。

請問:

(1) N 分子上一定要有何種官能基團,以便三人能夠順利完成耦合反應?

(2) 乙在實驗中所犯的毛病為何?如何改善?

(3) 丙可能是用什麼試劑把 N 連結到 agarose 上?

(4) 丙的實驗中何處不妥?如何改善?

(5) 丙所溶離下來的酵素 M,容不容易得到均質?為什麼?

(6) 丙雖然得到了 M,但因 M 為不穩定酵素,可能會有什麼問題?

(7) 丁為何無法把 M 溶離下來?反應可能疏忽什麼步驟?如何證明你的假想? [5]

12. 有 P, Q, R, S, T 五種大小分子的混合物,其性質如下表,請設計一系統方法純化之。 [4]

 

分子量

Ninhydrin test

AHP test

pI

P

300

+

-

6.3

Q

350

-

+

non-polar

R

40,000

+

-

4.3

S

50,000

+

-

7.8

T

440,000

+

-

5.2

 AHP = Aniline hydrogen phthalate

13. 酵素 U 需要鎂離子共同維持活性,在純化過程中,膠体過濾法或離子交換法均使得 U 失去活性,請分別解釋原因;並說明如何防止之? [3]

14. 有兩種蛋白質 VW,其 pI 分別為 5.2 及 6.3,原態單元体之分子量分別為 32,000 及 35,000。V 在其 pI 的環境下,有 90% 的分子會發生聚合現象,成為四元体,且可溶於一般緩衝液。請設計一簡單方法,分離此二蛋白質的混合物。 [4]

15. 經純化後之蛋白質 XY,以 PAGE 電泳檢定得如 Fig. 7。請分別討論蛋白質 X 及 Y 何者為純質?解釋為何。(請由所得之電泳圖形說明之,並再設計實驗證明) [4]

16. 某蛋白質只知下列性質,請設計一流程純化之。

a. 原態分子量約 20 kD

b. 等電點 8.0

c. 可催化生成葡萄糖

d. 在高溫 (95℃) 下可耐受 20 min 而活性不失 

e. 尚未誘導出其專一性抗体 [4]

17. 蛋白質 Z 的純化過程中,最後得到如 Fig. 8 Fig. 9 的結果,並且做了膠体過濾管柱的分子量校正 (如右 column calibration)。

Column calibration

Standards

Mol. mass

Kav

S1

67,000

0.4

S2

25,000

0.7

S3

14,000

0.8

請問:

(1) 此膠体過濾管柱的 Vo 為若干?

(2) 請定出 Z 的原態分子量。

(3) 請描述 Z 分子的四級構造。

(4) 請討論 Z 是否為純質? [5]

18. 某粗抽取液中各種蛋白質及酵素 AA 的性質如下表,請依指示進行以下的純化步驟:

(1) 粗抽液進行膠体過濾法 (Sepharose CL-6B),預測並畫出層析圖譜及 SDS 電泳結果。

(2) 取出含 AA 部份,接著進行離子交換法 (DEAE Sephacel, pH 6.5),同上預測結果。

(3) 若你覺得 AA 還不夠純,請自行設計進一步的純化方法,並預測其結果。

(以上的 SDS-PAGE 只要做含有最高 AA 的一管即可,不需跑全部分劃) [5] 

名稱

含量 (%)

分子量 (kD)

等電點 (pI)

疏水性 (%)

其它特徵

單元体

四級構造

AA

6

60

trimer

180

5.1

40

含有 heme (Fe)

X1

10

60

dimer

120

5.5

20

含有鋅離子

X2

12

50

tetramer

200

5.0

35

glycoprotein

X3

5

90

dimer

180

5.2

90

對熱不穩定易失活

X4

8

95

dimer

190

6.8

50

 

X5

10

58

dimer

116

5.4

40

含有鈣離子

X6

12

20

monomer

20

4.1

40

SDS 下有活性

X7

11

45

tetramer

180

4.9

35

在其 pI 會沉澱

X8

6

200

tetramer

800

4.5

30

淡褐色

X9

7

55

trimer

165

7.8

55

 

X0

3

80

tetramer

320

5.5

30

glycoprotein

19. 若你在一個熱帶窮困國家的醫院裡,沒有任何儀器,也沒有電力,只有簡單的玻璃管及小孔徑的塑膠注射針管等器材;唯一的藥品是胃藥,這種胃藥是氫氧化鋁中和劑,可保護胃壁。某日你發現當地有一種植物果實的抽取液可以抗癌,這種果實中大都為糖份,但含有一點點苦味物質,可能是生物鹼。你想研究何者是真正有效的成份,在這種艱難情況下,請問你如何大略分離其中的成份? [5]

20. 禽流感病毒 (AIV) 外殼有一種血液凝集素 (hemagglutinin, HA),是入侵宿主細胞的關鍵分子,HA 與宿主細胞膜上的接受體結合,接著啟動一連串機制,把病毒基因送進細胞內,開始病毒的感染、繁殖、擴散生活史。HA 在宿主體內被切開成為 HA1 及 HA2 兩部分才有正常功能,但仍然維持其立體構造;另外 HA 也會被醣化 (glycosylated),可能有保護病毒的功能。以 H6N1 (2838V) 的 HA1 為例,從其胺基酸序列預測,有數個 Asn 醣化位置,若把某個醣化位置的 Asn 突變成 Ala (Fig. 10, N167A),則 HA1 分子量下降,最右側的 M4 分子量約 38 kDa,請問 M4 可能是什麼?可以推得什麼事實? [4]

承上,若把 WT 的 HA1 分離出來,然後進行膠体過濾純化,則得如 Fig. 11 的色析圖譜,但是必須以 SDS-PAGE 及 Western blotting 才能看到 HA1 (Fig. 12),請問所得到的 HA1 的分子量若干?能否推知 HA1 的分子構造? [5]

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21. 請解釋下列各操作時所發生現象的主要原因,若是實驗操作問題請亦提出解決方法:

例:加熱使酵素中止反應。[答] 蛋白質受熱變性,構形被破壞,失去活性。

(1) 粗抽取液經透析後,總活性降至一半以下。 [4]

(2) 粗抽取液經透析後,總活性增加 50%。 [3]

(3) 硫酸銨沉澱後,找不到酵素活性。 [4]

(4) 硫酸銨分劃後,某酵素的活性分佈在所有的各個分劃。 [5]

(5) 有人宣稱使用 SDS-PAGE 可以測得原態蛋白質的分子量。 [5]

(6) 蛋白質樣本在濾紙電泳上會有嚴重拖尾現象。 [4]

(7) 有些人使用酵素的粗抽取液即可進行動力學實驗。 [4]

(8) 已知某酵素不是醣蛋白,卻可以糖染色法 (PAS) 染上色。 [5]

(9) 用 ultrafiltration 濃縮後的濃縮液中,發現根本沒有濃縮效果。 [4]

(10) 進行甘藷粗抽液的原態電泳,經活性碘染色發現有粉紅色色帶。 [4]

(11) 酵素經過反相層析法 (reversed phase chromatography) 後,活性立刻消失。[5]

(12) 等電焦集法膠体可形成 pH 梯度。 [3]

(13) 原態電泳時,所要的蛋白質跑不下來,在膠体上方拖成一片。 [3]

[題目後面方括號內的數字代表該題的難易程度,3 為中等而 5 最難回答,需要一些討論與思考]

 

酵素分析

本網頁最近修訂日期: 2017/09/19