酵素純化  Enzyme Analysis

6  酵素活性測定  Enzyme Activity Assay

基 本：科學研究 - 酵素實驗室 - 酵 素

純 化：蛋白質抽取 - 層析法 - 其他方法 - 純化策略

分 析：蛋白質定量 - 活性測定 - 電泳法 - 蛋白質科技

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參考資源

目 錄

6.1  催化反應

設計原則  基質濃度  動力學基礎

6.2  酵素活性分析

測定方法  中止反應  連續測定  澱粉磷解酶

6.3  維持酵素活性

緩衝液  試劑保存  活性維持  活性單位

問題集 

一種酵素 (PCS) 的活性區

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 Wikipedia  

[Enzyme activity]

{BCbasic}

連結生物化學基礎

6  酵素活性測定

參考資源

6.1  催化反應：

a. 反應設計原則：

大部分酵素反應方式，都可包括在圖 6.1 的大綱中。建立酵素活性測定步驟時，請注意以下原則︰

(1) 測定生成物的產生量，比測基質 (反應物) 的消失量，更方便且靈敏。除非不得已，儘量避免測定反應物。

(2) 反應流程儘量簡單，太複雜的操作過程，增加工作量及成本，且容易造成失誤。

(3) 複雜的反應，可能產生某些意外的生成物 (或 pH 改變)，回饋抑制酵素反應 (圖 6.1 中以負號表示)。

(4) 反應條件必須有利於指定反應方向，可以移除生成物 (以籃框表示) 或連上耦合反應。

(5) 小心樣本中有無其他酵素 (或抑制劑) 干擾，會因為消耗反應物或生成物，加強或減弱目標酵素的活性，造成假象而誤判。

(每張圖均連結有 960 x 720 清晰版本)

b. 反應基質及酵素濃度：

在試管中進行的酵素活性分析，與生物体內的酵素反應，有相當差距。為使反應達最大活性 (V_max)，或往指定方向進行，所使用基質濃度為十倍 K_m。反應的最適 pH、溫度、時間等條件，均需以實驗求得，尤其酵素的用量影響結果甚鉅，要事先找出最適當的使用濃度。

c. 不要忘了基本的酵素動力學：

本課程的主旨是在探討酵素的純化技術與分析方法，對於酵素的催化行為以及所衍生的基礎知識，並沒有討論很多。 但是，不要忘了後者才是研究酵素的最終目的，由簡單的動力學分析，就可以得知許多酵素與其基質間的作用關係，以及酵素催化的分子機制，請務必要体會這一點提醒，也要隨時回顧基本的酵素動力學。

▲

[Enzyme catalysis]

{Enzyme kinetics}

6.2  酵素活性分析：

酵素活性的偵測，通常是固定在一段 時間 (t) 內，觀察 生成物 的產量 (P)。因此反應進行一定時間後需中止反應，再進行生成物的定量。而 P/t 即為此酵素的 反應速率 (v_o)，也就是酵素活性。但若可以連續記錄反應過程，則有無中止反應並不重要。

6.2.1 酵素活性測定方法：

反應一段時間 (t) 後中止反應，測生成物量 (P) 即得活性 (P/t)。以下為各種測定生成物的方法，任何物理、化學甚或生物方法都可使用。

a. 直接測定生成物：

所有去氫酶均可測定 NAD⁺ 與 NADH 間的變化量，即為去氫酶的活性。例如 酒精去氫酶 催化下式之正反向反應：

Ethanol ＋ NAD⁺ → Acetaldehyde ＋ NADH ＋ H⁺

反應液中 NADH 在 340 nm 波長有吸光變化 (如圖 6.2)。

b. 耦合反應法：

若生成物 (P) 無法直接測得，設法把生成物再進行耦合反應，變成可測量的產物 (Q)。很多酵素可耦合到上述去氫酶的反應，則可測 340 nm 波長變化。

S → P → Q

c. 化學測定法：

若生成物具有化學活性，則可直接進行化學反應，例如蔗糖以 轉化酶 (invertase, IT) 水解成果糖及葡萄糖，兩個單糖產物都是還原糖，可測定所生成還原糖之還原力。

d. 放射線測定法：

若基質分子中含放射性核種，酵素反應後追蹤生成物的放射線量，即可知酵素活性。麻煩的是，要分離開反應物及生成物，有時不太容易，可用 HPLC、濾紙色析法 (PPC) 或離子交換法等。

e. 測壓法 (manometry)：

若生成物為氣体，則可測定氣体体積之增加量。尤其有氧氣生成時，可用 Warburg 氏呼吸計測之。

f. 電極︰

有些電極可直接測定反應的變化，例如若有 pH 或氧濃度的改變，則可用 pH 計或氧電極。酵素電極把酵素固定在薄膜上進行反應，然後直接測定反應物的改變，相當方便，但多用在工業或醫療界有大量樣本時。

g. HPLC 檢定法：

若產物無法以其他任何方便的方法檢測時，最終可用 HPLC 來分析產物，但相當費時且需要較昂貴的設備。

6.2.2 中止酵素反應方法：

注意任何中止反應的方法均不得破壞生成物，或干擾儀器測定。

(1) 最常用急速加熱 (100℃ 水浴) 10 min，注意有些蛋白質 (如 RNase) 仍然無恙。

(2) 以 3~5% TCA (三氯乙酸) 改變 pH，使酵素變性沉澱，再離心去除沉澱取上清。

(3) 用 1% SDS 中止反應，注意 protease K 等在 SDS 下仍有活性。

(4) 若該酵素需二價離子，則加入 EDTA 中止反應。

(5) 若該酵素有專一性抑制劑，則可加入抑制劑。

(6) 若使用放射性基質，可加入大量不具放射性 (cold) 的基質，看來具有放射性的生成物不再產生了，但實際上酵素反應並沒有停止。

6.2.3 連續測定法 (continuous-reaction)：

連續測定法可不用刻意中止酵素反應，但通常要使用儀器即時監控生成物。

a. 連續測定法：

若酵素反應，在其反應過程中可以一邊進行觀察，則可連續測定反應的情形，不須中止反應，上述 酒精去氫酶 即可連續監視 340 nm 波長的變化。若生成物無法直接觀測，也可連接某一耦合反應，把生成物轉變為容易觀察的物質。

b. 連續的耦合反應：

耦合反應在連續測定法應用相當多，但由於耦合反應更複雜，甚至成為一個迷你的代謝途徑。這種複雜的反應中有較多試劑與產物，許多不必要的副反應可能出現，干擾反應結果，因此要作好對照的控制組，以免有假結果出現。

6.2.4 澱粉磷解酶活性分析：

以澱粉磷解酶 (starch phosphorylase, SP; EC 2.4.1.1) 為例，說明如何以生物化學方法偵測其活性，並提醒活性分析如何受其他物質干擾而造成假象。

a. 澱粉磷解與合成：

注意磷解 (加磷酸分解) 不是水解 (加水分解)，此反應為可逆 (Pi 為無機磷)：

(Glc)n-Glc + Pi → (Glc)n + Glc-1-P (磷解方向)

(Glc)n + Glc-1-P → (Glc)n-Glc + Pi (合成方向)

合成方向反應可測無機磷 (Pi) 生成，而 Pi 的檢定有方便的化學呈色反應。反之，磷解方向應如何設計方便的活性分析方法？

b. 延長澱粉鏈：

澱粉磷解酶以可溶性澱粉 (Glc)n 作為 引子 (primer)，催化 Glc-1-P 連接到此引子上，成為較長的直鏈澱粉 (amylose)，因此可用碘液呈色觀察。在原態電泳膠片，澱粉磷解酶活性可利用此法染色，直接在膠片上看到酵素活性 (如圖 6.3 A)。

c. 小心其它干擾物質：

澱粉磷解酶的兩種基質很容易受到其它酵素的作用：可溶性澱粉受到 b-amylase (BA) 澱粉酶快速水解，澱粉磷解酶活性會被抑制。而 Glc-1-P 受 phosphatase (Ph) 磷酸酶的水解，產生游離的磷酸，會誤判為澱粉磷解酶的活性 (圖 6.3 B)。

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[Enzyme activity]

[Alcohol dehydrogenase]

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6.3  維持酵素活性：  

酵素是有活性的分子，因而可能隨時失去活性，應該考慮各種最佳的環境與條件，以便使酵素保持在最安定的狀態，其中酵素的緩衝液是最關鍵的因素。

6.3.1 緩衝液：

緩衝液可維持酵素溶液的恆定酸鹼度及離子濃度，兩者都會影響酵素的活性，請複習生物化學中緩衝液的作用原理。

a. 緩衝液有其使用範圍：

各種緩衝液都有其適用的 pH 範圍，表 6.1 列出常用的緩衝液。

表 6.1 各種常用緩衝液及其使用範圍：

b. 添加物都有作用：

經常在緩衝液中加入一些物質，以增加酵素安定以保持活性 (表 6.2)，要小心這些添加物是否影響活性分析，是否影響下一步實驗。(參考 6.3.3)

表 6.2 緩衝液常用的添加物：

c. 溫度的影響：

緩衝液用來維持溶液恆定 pH，請注意有些緩衝液的 pH 受溫度影響很大 (如 Tris)。故製備緩衝液時，要考慮此緩衝液將要在何種溫度下使用。

d. 濃度的影響：

改變緩衝液的濃度，可能會影響其 pH。使用不同緩衝液，酵素活性表現也會有差異，有些酵素甚至失去活性。通常若環境的 pH 變化較大，則需要使用較濃的緩衝液，圖 6.4 列出各種實驗情況下，緩衝液的使用濃度範圍。

e. Stock solution：

緩衝液可以十倍濃度貯存，高濃度可防止微生物生長，並保持每次實驗所使用藥品的穩定度與一致性。注意在稀釋後，溶液的 pH 也許會有改變，尤其是磷酸緩衝液很容易受到濃度改變而影響其 pH。

6.3.2 試劑的保存：

試劑的適當保存非常重要，要依照廠商所指示的溫度貯存。

a. 避免潮解：

注意每當試劑由冷藏庫取出時，要等它回到室溫後才能打開，否則水氣會附在藥品的表面，進而潮解或破壞之。

b. 分裝凍藏：

常用的冷藏藥品以小量分裝 (aliquot) 後凍藏，是最好的貯藏方式，尤其是溶液狀態的生物活性試劑 (如酵素)，切勿反復 凍結-解凍。有些酵素經不起凍藏，一旦結冰後再解凍，活性快速下降 (為什麼？)。例如上述澱粉磷解酶請勿凍藏，放在 4℃ 即可。

c. 甘油凍藏：

於低溫 (-20℃) 貯藏的酵素溶液，若保存在 50% 甘油就不會凍結，隨時取用。但請注意所含的甘油，對下一步反應有無影響。

d. 避光防菌：

很多試劑要避光貯存，或須放在乾燥器中，避免長霉長菌。

6.3.3 酵素活性之維持：

a. 酵素的安定性不同：

酵素在細胞中合成後，有的分泌到細胞外，有的運送到細胞器官中貯存或應用。前者 (分泌性酵素) 因為要在細胞外的惡劣環境中生存，因此較為堅韌，不易受到破壞；反之，細胞內的酵素，都以較濃的濃度集中在保護良好的胞器內或胞膜上，一旦抽離細胞暴露在氧氣中，可能很容易失去活性。

b. 酵素失活的原因：

可歸類成如下的物理性或化學性原因。

(1) 蛋白質變性： 離開細胞的生理環境後，蛋白質可能遇到極端的 pH 條件、不適的溫度、冰凍時被冰晶破壞，或使用變性劑 (如 SDS、尿素)，均會使蛋白質的構形破壞。

(2) 酵素活性區破壞： 在抽取過程中，若失去 cofactor，或者活性區的關鍵胺基酸被修飾，均可造成。最常見的影響是氧化，尤其是 cysteine上的 -SH 基很容易被氧化。一般加入 EDTA 除去可活化氧分子的二價離子，或加入抗氧化劑以其自身氧化防止 -SH 基氧化。

(3) 蛋白酶水解： 細胞內有許多蛋白酶，細胞被打破後即釋放到酵素溶液中，很快水解酵素。可用蛋白酶的抑制劑防止之，但蛋白酶有數大類，各有不同類的抑制劑。一般使用 PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) 是 Ser 型蛋白酶的抑制劑，但也抑制部分其它類型者，注意 PMSF 在水溶液中很快就會降解，每次使用都要重新補充。

(4) 酵素抑制劑： 在自然界中或以人工合成，發現許多酵素有抑制劑，可以專一性地抑制酵素活性；有可逆性的，也有不可逆的，通常不可逆抑制劑的效果都很強烈。

c. 如何保持活性：

若你的酵素不太穩定，活性不易保持，請參考下列處理方式：

(1) 儘快進行純化及各項分析，隨時保持在 4℃ 或冰浴中。

(2) 讓酵素保存在硫酸銨固体沉澱中，要比溶液狀態安定得多。

(3) 勿讓高純度的酵素，保存在稀濃度溶液中，否則要加 BSA 當安定劑。

(4) 勿隨意凍結或解凍酵素液，可加防凍劑 (如甘油或醣類) 以液態保存。

(5) 冷凍乾燥雖可長期保存酵素，但有些酵素活性可能會因而下降。

(6) 若容易受微生物污染，可經無菌過濾後保存 (當然也會損失一些酵素)。

6.3.4 酵素活性單位：

a. 活性單位 (activity unit, U) 是酵素活性高低的指標。一個活性單位的標準定義，是在固定溫及 pH 下，每分鐘可催化 1 mmole 基質的活性。但很多情況下，為了操作或計算的方便，直接用測定產物所得的吸光值，除以單位時間來表示活性，因此各種活性單位的定義可能不同，請特別注意。

b. 在提到酵素活性單位時，通常有兩種意思，一是指該酵素的總活性，單位就是 unit。另外，因為酵素本身大多為蛋白質，因此有蛋白質的質量 (mg)，而 unit/mg 就是該酵素的 比活性 (specific activity)。比活性當然越高越好，表示在比較少量的蛋白質中，擁有比較多活性，比活性高者其酵素的純度也比較好。

c. 有關酵素活性及其基本背景，請複習生物化學中的酵素章節，你在大學所熟悉的基本酵素知識，在研究所或以後的任何階段，都還是完全適用。

問題集   (每個問題不一定都有標準答案，甚至會引起很大的爭議，但這就是問題集之主要目的)

 1. 酵素活性的測定，可觀察反應物消失或者生成物生成，何者較佳？請述明理由。 [2]

 2. 活性分析時通常使用大量基質，要大到多少？(有一個公認的估計) 其目的何在？ [3]

 3. 在設計一個酵素活性分析方法時，應當注意那些要點，以免低估酵素活性？ [3]

 4. 酵素的催化條件受環境因子影響很大，而在試管中的反應與在細胞內的催化環境，一定有很大的差異，請儘你所知舉出兩者的差別，並說明其利弊。[3]

 5. 酵素催化反應時若能把生成物除去，有何好處？如何以物理或化學方法去除之？ [3]

 6. 測定酵素活性為何要中止酵素反應？何種情況下可以不必中止反應？ [3]

 7. NAD⁺ 如何進行其輔酶的作用？請寫出其構造式。 [1]

 8. NAD⁺ 為何能在 340 nm 波長的吸光有變化？ [1]

 9. NADH 與 NADPH 有何不同？能否互相通用？ [2]

10. 340 nm 應當使用UV或者可視光的光源？ [2]

11. 若生成物無法直接偵測，則要如何進行活性分析？ [2]

12. 分析酵素活性時，雖然耦合反應與主反應一起連續著進行，但在反應動力學及實驗操作上，或者反應過程中基質及生成物的濃度上，二者有相當的差別，請檢討兩種反應的異同點。 [4]

13. 在酵素活性分析時，佐以耦合反應，有何好處？但有什麼可能的缺點？ [3]

14. 請詳究澱粉磷解酶 (starch phosphorylase) 的催化反應，請列出所有可能的活性分析方法。 [2]

15. 何為還原醣？為何蔗糖不是還原糖，而葡萄糖及果糖則是？ [1]

16. 請寫出轉化酶 (invertase) 的催化反應，並舉出可能的生成物偵測方法。 [2]

17. 請幫轉化酶設計一個使用放射線的活性分析方法。[3]

18. Phytochelatin synthase (PCS) 催化以下的反應，請幫忙設計活性分析方法： [3*]

g-Glu-Cys-Gly + g-Glu-Cys-Gly → g-Glu-Cys-g-Glu-Cys-Gly + Gly

19. 有那些試劑或處理方式可以使蛋白質變性？其原理或機制各為何？ [1]

20. 為何改變 pH 可以使得蛋白質沉澱下來？其變性的機制為何？ [2]

21. 某化學小分子上有兩個官能基，其解離常數 pKa 分別為 4.5 及 11，請問這個小分子的等電點大約多少？這個小分子能否作為緩衝液？可以作為多少 pH 的緩衝分子？ [2]

22. 請試著默寫 Henderson-Hasselbalch 平衡式，並以此平衡式解釋，為何弱酸或弱鹼具有緩衝環境 pH 的作用？ [3]

23. EDTA 與 EGTA 有何不同？在使用上有何差異？ [1]

24. 使用放射性試劑時，何謂 pulse-chase？在實驗上有何用途？ [3]

25. 許多酵素在冰凍後受到傷害，活性因而下降，為此經常把酵素放在含有 50% 甘油的緩衝液中，凍藏在 -20℃ 中就不會結冰，可以直接取出來使用，非常方便。某生以此方式保存酵素，但每次取出來做活性分析時，分別取出 10 到 100 mL 体積，想要做一條校正直線 (酵素体積 vs 活性)，但是無論嘗試幾次，這條直線的精準度都很差，檢測點大多無法落在直線上，請幫忙找出可能的原因，並且建議改善方法。 [4*]

26. 通常要進行活性分析的樣本都要稀釋，若某酵素的稀釋度為 1:10 時，測得 2 U/mL 的活性；當稀釋為 1:50 時，活性為 0.6 U/mL；稀釋 1:1000 時，活性為 0.05 U/mL。請問你應當如何判別所得數據？如何取捨？為何有這樣的情形？ [5*]

27. 酵素的活性單位有一個公認的定義，請寫出如何定義 1 unit 活性單位。另外，活性單位也容許各自定義，且有其正當理由，請說明為何。 [3]

28. 酵素試劑通常都很貴，某生要購買酵素 X 做為實驗的標準品，發現廠商有多種形式如下，請問你如何幫他訂購最合適的種類？刮號內為美元報價。 [5]

Type X-1: 1,000 units/1 gm (USD 10.00), Type X-2: 100 units/1 mg (USD 100.00)

Type X-3: 1,000 units/10 gm (USD 5.00), Type X-4: 50 units/0.1 mg (USD 500.00)

29. 請由右圖澱粉磷解酶 L-SP 的酵素動力學實驗結果，推測兩種基質 (澱粉及 Glc-1-P) 與酵素之間的交互作用關係。 [5*]

(也請解答 Pur 0 酵素實驗室問題集：7~15 題)

[題目後面方括號內的數字代表該題的難易程度，3 為中等而 5 最難回答，標有 * 為實際問題]

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