酵素純化與分析  Enzyme Purification and Analysis

基礎 (0):科學研究 - 酵素實驗室 - 酵 素 (BCbasics)

純化 (1~4):蛋白質抽取 - 層析法 - 其他方法 - 純化策略

分析 (5~8):蛋白質定量 - 活性測定- 電泳法 - 蛋白質科技

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課程簡介  (pdf)

參考文獻  (References)

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Basics

 

 

科學研究  Scientific Investigation  [pdf]

0.1  確立方向 Attitude & goal

找尋方向  背景搜尋  醞釀題目  研究大綱  確立題目

0.2  實驗日誌  Lab note: PERD

時間座標  記錄方式  記錄命名 

計畫 [P]  操作 [E]  結果 [R]  討論 [D]  應用心得

0.3  實驗報告 Lab report

通則  實驗報告結構  文章寫法建議  編輯注意事項

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問題 Problems

酵素實驗室  Enzyme Laboratory

0.4  建立實驗室 Laboratory

儀器設備  儀器管理  小型用具 

0.5  藥品試劑 Reagents

適量庫存  貯存溫度  藥品純度  污染控制

0.6  個人用品 Personal utilities

個人藥品  立刻清理  實驗記錄  離開實驗室

個人安全  必讀  Personal safety

問題集 Problems

酵 素 Enzyme (生物化學基礎 BCbasics)  外部連結

   

5  蛋白質定量  Protein Determination  [pdf]

5.1  Biuret 法

5.2  Lowry 法

5.3  UV 吸光法

5.4  Coomassie Blue (dye binding) 法

5.5  其他方法 Other methods

問題集 Problems

6  酵素活性測定 Enzyme Activity Assay [pdf]

6.1  催化反應 Catalytic reaction

6.2  酵素活性分析 Enzyme assay methods

6.2.1  酵素活性測定方法 Assay methods

6.2.2  中止酵素反應方法 Stop the reaction

6.2.3  連續測定法 Continuous measuring

6.2.4  澱粉磷解酶活性分析 Assay for L-SP

6.3  維持酵素活性 Maintain activity

6.3.1  緩衝液 Buffer

6.3.2  試劑的保存 Reagents

6.3.3  酵素活性之維持 Maintain activity

6.3.4  酵素活性單位 Enzyme activity unit

問題集 Problems

7  電泳檢定法  Electrophoresis  [pdf]

7.1  電泳原理 Basic principles

7.1.1  蛋白質的泳動率 Protein mobility

7.1.2  電泳種類 Types of electrophoresis

7.1.3  電泳設備及系統選擇 Available systems

7.2  聚丙烯醯胺膠体電泳 (PAGE)

7.2.1  PAGE 種類 PAGE categories

7.2.2  PAGE 膠体組成 Gel composition

7.2.2.1  膠体主要成分 Main components

7.2.2.2  鑄膠反應 Gel-forming reaction

7.2.3  PAGE 系統解剖 System anatomy

7.2.3.1  電泳系統的組成 Gel system

7.2.3.2  電泳的焦集作用 Stacking the sample

7.2.3.3  兩種電泳系統比較 Comparison

7.2.4  結果不佳時 Trouble shooting

7.3  其它相關技術 Related techniques

7.3.1  染色及乾燥 Staining & gel drying

7.3.2  蛋白質轉印法 Protein transfer

7.3.3  等電焦集法 (IEF) Isoelectric focusing

7.3.4  二次元電泳 2-Dimentional electrophoresis

問題集 Problems

8  蛋白質科技  Protein Technology  [pdf]

8.1  分子量測定 Molecular weight determination

8.1.1  膠体過濾法 Gel filtration

8.1.2  梯度電泳法 Gradient PAGE

8.1.3  其他分子量測定方法 Other methods

8.1.3.1  超高速離心法 Ultracentrifugation

8.1.3.2  由胺基酸序列計算分子量 MW deduced from amino acid sequence

8.1.3.3  質譜儀分析 Mass spectrometry

8.2  蛋白質構造與組成 Structure analysis

8.2.1  N-端或 C-端胺基酸 Terminal determination

8.2.2  胺基酸組成 Amino acid composition

8.2.3  胺基酸定序法 Amino acid sequence

8.2.3.1  cDNA 間推法 Deduced from cDNA

8.2.3.2  Edman 直接定序 Edman reaction

8.2.4  胜肽圖譜 Peptide mapping

8.2.4.1  蛋白質專一性水解 Specific proteolysis

8.2.4.2  分離胜肽的方法 Identify peptides

8.2.5  其他相關方法 Other methods

8.2.5.1  分子消光係數 Molar extinction coefficient

8.2.5.2  蛋白質立体結構 Steric structure

8.3  免疫學工具 Immunological tools

8.3.1  準備抗原 Antigen preparation

8.3.2  免疫流程 Immunization protocol

8.3.3  抗体製備 Antibody preparation

8.3.4  抗体應用 Antibody application

8.4  蛋白質新世界 Protein new world

8.4.1  微量科技 Microscale technology

8.4.1.1  微量純化 Microscale purification

8.4.1.2  微量分析 Microscale analysis

8.4.2  蛋白質体學 Proteomics

8.4.2.1  如何看待 proteomics

 What is proteomics?

8.4.2.2  Proteomics 就是蛋白質化學?

Is proteomics that we called protein chemistry?

8.4.2.3  Proteomics 與代謝体 Metabolomics

問題集 Problems

分 析

Analysis

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

純 化

Purification

 

 

1  蛋白質抽取  Protein Extraction  [pdf

1.1  如何開始 ? How to start?

1.2  材料來源 Materials & sources

1.3  均質及抽取 Homogenization & extraction

1.4  鹽析及沈澱法 Salting-out & precipitation

1.4.1  鹽析分劃法 Salting-out fractionation

1.4.2  有機溶劑沈澱法 Precipitation by organic solvent

1.4.3  其它處理法 Other methods

問題集 Problems

2  色層分析法  Chromatography  [pdf] 

2.1  色層分析法原理 Basic principles

2.2  膠体過濾法 Gel filtration

2.2.1  原理概述 Basic principles

2.2.2  膠体介質 Gel materials

2.2.3  膠体管柱 Gel & column

2.2.4  管柱操作 Column operation

2.2.5  問題及解決 Problem & solution

2.3  離子交換法 Ion exchange

2.3.1  原理概述 Basic principles

2.3.2  離子交換介質 Exchange materials

2.3.3  緩衝液與層析系統 Buffer system

2.3.4  管柱操作方法 Column operation

2.3.5  色層焦集法 Chromatofocusing

2.4  親和層析法 Affinity chromatography

2.4.1  原理概述 Basic principles

2.4.2  親和吸著劑 Affinity adsorbent

2.4.3  金屬螯合層析法 Metal chelating

2.4.4  疏水性層析法 Hydrophobic interaction

2.4.5  液相分配 Liquid partitioning

2.5  HPLC 及 FPLC

問題集 Problems

3  其它純化方法  Other Purification Methods  [pdf]

3.1  製備式電泳 Preparative electrophoresis

3.2  超高速離心法 Ultracentrifugation

3.3  超微薄膜過濾法 Ultrafiltration

問題集 Problems

4  純化策略  Purification Strategy  [pdf]

4.1  純化步驟設計 Design a purification protocol

4.1.1  影響純化因素 Critical factors in purification

4.1.2  組合純化步驟 Set up purification steps

4.2  純化結果 Purification table

應用問題 Application Problems

(複雜的綜合性之實境模擬問題)

   

Ref

   

酵素純化與分析 Enzyme Purification and Analysis

參考文獻  References

基礎 (0):科學研究 - 酵素實驗室 - 酵 素 (BCbasics)

純化 (1~4):蛋白質抽取 - 層析法 - 其他方法 - 純化策略

分析 (5~8):蛋白質定量 - 活性測定- 電泳法 - 蛋白質科技

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實驗室管理

 

 

 

 

酵素

 

操作方法

 

 

實驗教本

 

 

抗体工具

 

蛋白質体

 

經典手冊

 

 

 

 

 

 

 

 

 

入門讀本

Barker K (2005) At the bench - A laboratory navigator. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

很奇特的書,說明如何建立實驗室,如何與實驗室的同伴相處,如何準備基本的藥品試劑。有點像本網頁的

另有一本類似的 At the helm (2010),給年輕的助理教授建言,如何建立研究室、找到好的人手、組織一個研究團隊。

研究生涯 (Academic career) 是以前上酵素化學實驗課前,我給修課同學的一些建議,對未來的研究生涯可能有所助益。

科學之路 The art of scientific investigation (1950) 是 70 年前一位劍橋大學教授寫給年輕科學家的建言,到現在還適用。

BCbasics (2008) 生物化學基礎Enzyme 酵素

大學部生物化學課程的基礎部份,但是對酵素的背景知識,有相當廣泛且深入的說明;另外也介紹 蛋白質核酸 等。

Coligan JE et al, ed (2017) Current protocols in protein science. John Wiley & Sons, Inc.

最新且最齊全的工具書,幾乎所有蛋白質技術均有記載,且都針對熱門研究題目;因為內容隨時會修改增補,因此很難定義其出版年代。 臺大圖書館有電子版本,以及 Current Protocols 其它主題系列,還有 相關報導的部落格

Deutscher MP ed (2009) Guide to protein purification (Methods in Enzymology, Vol. 463) Academic Press

最齊全而詳細的蛋白質純化及檢定方法教本,463 卷是繼 20 年前 182 卷以來的新版,有許多全新的改變。而 Methods in Enzymology 系列是酵素化學的無限寶藏,若你的研究主題是某一個酵素,在這個系列一定可以找到相關的一卷。

Harlow E, Lane D (2013) Antibodies. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory.

對於抗体的生產及應用,有最詳細的操作步驟。  (也可以參考莊榮輝的 單株抗体課程網)

Liebler DC (2002) Introduction to proteomics. Tools for the new biology. Humana Press. (全本 PDF)

非常簡要地說明蛋白質科技的最新發展,以及各種強大工具的應用。(也可以參考莊榮輝的 蛋白質体課程網)

Pharmacia (GE) 一系列 操作手冊: 網頁上有很詳細的說明、下載 Handbooks (非常有用)

2-D electrophoresis

Affinity chromatography. Principles and methods 

Gel filtration. Principles and methods 

Hydrophobic interaction chromatography 

Ion exchange chromatography. Principles and methods 

Monoclonal antibody protocol 

Protein purification 

Reverse phase chromatography. Principles and methods 

Strategies for protein purification (Handbook, pdf, 12 M)

Scope RK (1994) Protein purification. Principles and practice (3rd ed), Springer-Verlag.

描述純化及分析的基本原理,相當深入淺出,雖然有點舊,但仍是許多蛋白質純化課程的主要教科書。

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Current Protocol

 

 

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Wikipedia

說明公司沿革

 

 

 

 

 

 

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本網頁最近修訂日期: 2017/10/10