酵素純化與分析  Enzyme Purification and Analysis

酵素實驗室  Enzyme laboratory

基 本:科學研究 - 酵素實驗室 - 酵 素

純 化:蛋白質抽取 - 層析法 - 其他方法 - 純化策略

分 析:蛋白質定量 - 活性測定 - 電泳法 - 蛋白質科技

總目錄

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下載區

 

> 0.1 確立方向  > 0.2 實驗日誌  > 0.3 撰寫報告

 

參考資源

目 錄

0.4  建立實驗室

儀器設備  儀器管理  小型用具

0.5  藥品試劑

適量庫存  貯存溫度  藥品純度  污染控制

0.6  個人用品

個人藥品  立刻清理  實驗記錄  離開實驗室 

個人安全  必讀   

問題集 (0.4~0.6)

典型的生物化學實驗室

下載 [內文 pdf]

[投影片 pdf]

  Wikipedia  

[Laboratory]

[Chemicals]

[Da Vinci]

 

酵素實驗室  (0.4~0.6)

參考資源

實驗室設備之有效經營管理,在有形或無形中,影響著研究工作的品質與成敗。以下所描述的,是建立一個酵素或蛋白質實驗室,所必需的大小儀器、設備與經營管理。

520 實驗室  (雖然不很完備,但可作為一般酵素實驗室的經營參考)

研究生涯  (7) 重視整体教學研究環境的優質化

 

 

E0-03

0.4  建立實驗室

0.4.1 儀器設備

實驗室自用小型器歸納為 電泳 (electrophoresis) 層析 (chromatography) 兩類,大型有 離心 (centrifugation) 測光 (spectrometry) 兩種。較大型的基本設備,建議組成區域性共同儀器室,由鄰近幾位教師共同設立,並且一起使用與維護。其它更大的貴重儀器,就要到學院級或跨校的貴重儀器室使用,若由教師個人單獨經營,通常是不切實際且空耗經費及人力,應該多支持使用 共同儀器室

生化共同儀器室 Pub (參考臺大生技系生物化學組的共同儀器室) [請上網以 BST Pub 搜尋]

0.4.1.1 基礎設施

純水製造機 、製冰機、高速冷凍離心機 (20,000 rpm)、微量離心機、電泳及轉印系統 (含供電器)、ELISA 光度計及各種層析管柱系統 (包含分劃收集器)。其中電泳與層析包含很多獨立小器具,使用上較複雜。

0.4.1.2 個人電腦及周邊:

一般生化學實驗的運作已經離不開電腦,不管是套裝軟 体或網路資料庫的應用,均不可或缺。要多多利用電腦加強自身研究工的規劃、整理呈現、發表。

研究生涯  (2) 善用電腦軟硬体提升你的能力與表現

0.4.1.3 冰箱與冷房:

a. 每個冰都要妥善規劃貯位並指派使用人或管理人,要詳細表列冰箱內貯存之物品。同類的藥品要先分類再用小盒裝在一起 (貨櫃化),勿零散堆積,以免臨時翻找費時,導致冰櫃失溫。注意冰箱隨時要關好,尤其是零度以下的冰箱,若箱門沒關上而造成回溫,對藥品及冰箱都是超級災難。

b. 零下的冷藏,不要使用無霜冰箱,因為定時自動除霜會造成冰箱內溫度上升,藥品可能因反復的『凍結-解凍』而失活性。若不得已必須使用自動除霜冰箱,可把藥品裝在普利龍盒內,使溫度變化所造成的傷害降至最低,也可減輕停電所造成的傷害。

c. 許多蛋白質操作都要在低溫進行,通常使用『走入式』冷房 (cold room),但最近漸漸改用裝有透明門扇的大冷藏室,類似便利商店裡銷售冷飲的大冰箱,也相當好用,都要注意溫度是否維持在 4°C 左右。

d. 類似的實驗設備還有植物生長箱,乃至無菌操作枱、細胞培養箱等,都需要專門管理及使用知識。

0.4.1.4 進一步設備

通常備有:速離心機、冷乾燥機、超微膜過濾、雙向電泳、等電焦集電泳、分光光度計 (UV 及可見光)、HPLC 或 FPLC、螢光或電子顯微鏡。最近對核酸或蛋白質電泳的紀錄儀器 (如 UVP),也因其方便性與靈敏度而變得很重要。

0.4.1.5 特別備:

有液相閃爍計數子吸收光譜分析儀、毛細管電泳等,其他進一步的貴重儀器如:蛋白質定序儀、質譜儀、影像分析系統、分子結構電腦工作站等,有些分析可以送相關廠商的收費服務平台。另外,若進行放射性實驗,則一定要在專門設立的放射區域進行,所有操作人員也都要有相關的培訓與執照。其他需要證照的操作還有:基因重組實驗、動物實驗、人 体實驗等,有關者請儘早受訓才能進行實驗。

0.4.2 儀器管理

a. 每件儀器應指定專人管理,負責保管零件、附件、說明書,並做初級保養,同時必須定期舉辦工作坊培訓使用者。每種儀器都應儘量使用,在五年內發揮其最大功能,因為通常十年後就無法再維修 (缺乏零件)。

b. 光學或精密儀器,應放在有除溼機的密閉室,同時注意環境的電壓是否穩定;會發熱的器具則集中放在通風處,並且注意電容量是否足夠,以免電源過荷造成災害。

c. 使用儀器前,要先熟悉其操作方法,注意大部分儀器在使用前都需要受訓,若有問題一定要請教管理人,使用前後必須確實登記 (登入、登出),有任何毛病要立刻報告管理人,不可瞞。

0.4.3 小型用具:

a. 每個人桌上都需要的小型用具:自動吸管 (20, 200, 1000 mL 三種)、自動吸管頭 (黃色及藍色) 及其盒子、玻璃試管及試管架、計時器、標籤紙、馬克筆、小剪刀、鑷子、滴管、藥杓 (spetulas)、天平秤量紙、保鮮膜、鋁泊紙、冰筒、手套、擦拭紙。另外還可能需要:洗瓶、濾紙、各式漏斗、ELISA plate、膠片染缸、塑膠培養皿、紗布、棉花、透析袋、透析夾。實驗室應建立小量庫存及管理系統,隨時補充物品,以保供應無缺。

b. 實驗室應備有的公用小型機器:桌上離心機、微量離心機 (microfuge)、大小離心管、均質機 (或果汁機、磨粉機)、pH 測定計、電動天平、熱水浴、磁鐵攪拌器、蠕動式幫浦 (peristaltic pump)、試管振盪器 (Vortex)、轉動式振盪器 (rotary shaker)。當秤量僅數 mg 藥物時,先檢查電動天平的靈敏度是否足夠。

c. 常用小儀器如天平、pH 測定計等應集中放在定位 (公用區),用畢立刻清理好歸位! 天平、pH 測定計及自動吸管都要經常校正。自動吸管可吸取純水在天平秤量,每 1.0 mL 水應秤得 1.0 gm,若誤差在 1% 以上,立即送修。任何儀器若疑似故障,要貼警告紙條,並通知管理員。

d. 磨碎動植物材料時,經常用到乾冰或液態氮,都要向專業廠商預先購買,特別注意其貯存用具 (受凍裂開),且操作時要小心避免被超低溫凍傷,一定要使用護目鏡與防凍手套。

 

 

 

(支持並維護

共同儀器室)

 

 

 

 

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E0-12

0.5  藥品試劑: 

0.5.1 適量庫存:

a. 數十年以前的實驗室都有一個藥品櫃,收集實驗室的各種藥品,現在還是有藥品櫃,但已經不是用來做長期大量庫存之用。近年來,由於庫存管理科學的發達,以及快遞服務的密集,在實驗室裡堆積大量藥品並非理想的策略,通常都訂購較少量的藥品,足夠做一兩輪實驗即可。

b. 雖然如此,還是要注意供應廠商的可靠性,是否能準時運送,在下一輪實驗之前,把所需要的藥品準備好。酵素或蛋白質試劑比較不容易保存,通常都不會做很大量的庫存,況且留下來的試劑別人都不太敢用。

0.5.2 貯存溫度

a. 每種藥品有其最適當的貯存溫度,切要遵守。一般分為:室溫、4°C 及 -20°C 三種,又可依其為固体、液体或高純度者,分別置放。除了常用的大宗藥品 (如 NaCl) 之外,較精密或不穩定的試劑 (如大部分酵素) 最好不要大量屯積,因為貯藏時間太久後就無法確保其品質。

b. 剛由冰箱取出之藥品,應在充分回溫之後才能打開,並且遠離水源;使用頻繁且不耐回溫的藥品,應少量分裝 (aliquot) 後凍藏,每次取用一個分裝,可不需等待回溫就開瓶使用,用後也不再回收凍藏。

0.5.3 藥品純度

a. 一般依純度及用途分為數級,例如最常用的 Merck 藥廠分為︰合成 (for synthesis)、特級 (extra pure)、生化用 (for biochemistry)、試藥 (pro analysis 或 GR)。各種等級的藥品,價格相差很大,應當用在適當的實驗,否則不是浪費,就是因藥品純度不佳而導致實驗失敗。

b. 許多商品所供應的酵素,是保存在硫酸銨懸浮液中運送,可保持酵素品質之安定;但使用前要先透析,除去硫酸銨,否則在硫酸銨下分析活性可能會造成誤判。也要注意酵素的來源,及其中所含的鹽類或添加物 (如甘油或防腐劑 NaN3),是否會影響你的實驗。

0.5.4 污染控制

管制性藥品一定要照規章定時填表報告,以免觸犯相關法律。臺灣大部分學校已經建立化學污染的回收管控制度,任何化學試劑均不得直接排入水槽,必須集中後由專業人員回收處理。在實驗室內,化學藥品的原液,以及其第一次洗滌液都要倒入固定之回收桶,小心貯藏。若直接倒入水槽而被追蹤舉發,肇事的實驗室將得自行負擔鉅額罰款,嚴重者可能要負法律責任。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

(Sigma 的例子)

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(依照規定回收)

 

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0.6  個人用品: 個人實驗桌上應該配備的小型用具清單請見 0.4.3 a。

0.6.1 個人藥品

個人使用的藥品,通常都是配製好的溶液,上面一定要貼上標籤,註明 日期藥品名稱使用人姓名 等,藥品名稱不可用暗號,以免日後連自己都忘掉是什麼試劑。試劑不必配製太大量,因大多數藥品經久貯後均不太穩定。常常檢查緩衝液內有無長霉! 個人的藥品應集中一處固定收存,切忌到處亂放。

(每張圖表均連結有 960 x 720 清晰版本)

0.6.2 立刻清理

a. 做完實驗後一定要『馬上』把所用過的儀器、實驗桌、用具等整理乾淨,回復原狀。離開前要從頭回顧,檢查所有使用過的儀器或實驗桌,也許會發現重要的藥品或樣本忘了收起來,或有貴重儀器忘了關機。

b. 玻璃用具 (如試管、燒杯、三角瓶等) 使用後,要儘量在當日清洗掉,這是最省時省力的用清潔液浸泡時,請使用液態的洗潔精,並在一兩天內清洗掉,因為可以說是『越泡越髒』的!

0.6.3 實驗記錄

實驗記錄可說研究工作的靈魂,要忠實地把實驗過程中,所有的設計、執行、觀察、結果、討論等,依循一套方法記錄下來。一些偉大的科學研究者,都有很精彩的實驗記錄本,最有名的就是 達文西。雖然目前電腦工具非常發達,市面有很多數位化平台,有些實驗需要以照相或影片來記錄,建議還是以紙本書寫方式為主,並且永久保存,日後若有爭議時將是最好的證據。

0.2實驗日誌 

0.6.4 離開實驗室

當你畢業或因任何緣故離開實室前,要把所有儀器、用品等整理妥當,移交給接任者,最好列出交接藥品與儀器清單。你的實驗記錄本通常必須留在原實驗室,或經實驗室主持人 (PI) 同意才能帶走。有論文發表者,要把所有原始資料 (包括圖片與文字),燒錄成光碟片 (或拷貝在隨身碟 USB 裡) 交給實驗室主持人。

 

 

 

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E0-09

E0-10

 

 

(做好實驗日誌)

 

 

 

 

0.6.5 個人安全 必讀三遍  

許多實驗室內的災難,都是由小型器具或消耗品釀成的,因為這些小東西較多,且易被疏忽。一定要記得,無論操作任何實驗,要帶護目鏡 (或眼鏡)。一些實驗室內常發生的危險物件與警告如下:

危險藥物:

Acrylamide:神經毒!勿吸入其塵埃,秤量時要戴手套及口罩。

SDS:秤量時很容易飛揚,要戴口罩並小心操作,否則吸入將會溶解你的肺泡。

溶劑及瓦斯:致癌、易燃!很多有機溶劑有害健康,並小心瓦斯外洩 (在外洩現場絕對不可觸動任何開關!避免產生火花導致氣爆)。

危險儀器:

離心管:注意平衡!離心管不平衡時,內容物可能會爆開來。

離心機轉陀:注意要密蓋!離心陀蓋子若沒蓋緊,蓋子會飛出,毀掉離心機。

供電器:產生極高電壓!漏電或接觸到電極時,會被電擊休克。

潛在的危機:

玻璃器具:檢查是否有缺口或裂痕!玻璃缺口會刮傷手,裂痕在加熱時會爆開。

微波爐:加熱要先鬆開蓋子!氣密物 体在微波爐中加熱時,會發生爆炸。

衣著或配件:間接造成災害!長髮、涼鞋、太寬鬆衣褲、項鍊裝飾等都很危險。

膨脹反應:小心可能爆炸!加熱、加壓或抽真空,氧化還原反應,請小心都有爆炸可能。

接太多插頭:負載過度!插頭電源有一定的負載量,勿過度使用之,插座若有過熱溶解痕跡馬上換新。 

特別注意:

 儘量不要用轉接插座,若不得已必須使用,請換成最新的安全插座,不要接太多儀器。

 這種插座要有過荷自動斷電裝置,要放在通風處並隨時可以檢查,嚴禁堆在衣物下面。

 在實驗室內聞到異味 (不見得一定是燒焦味),一定要馬上追查源頭,發掘可能的危險。

其他:

任何災變發生時不要搭電梯!

每天結束回家前要巡查一遍!

值週同學確實負責公共安全!

不要帶太多錢在身上或背包!

不要深夜單獨一人在實驗室!

(若非得如此時,一定要隨身攜帶手機,任何緊急事件直接撥打 112)

 

 

 

預先察覺危險:

毒  性

氣  体

溫  度

反  應

爆  炸

高  速

玻  璃

電  流

 

 

 

 

 

 

注意插頭及插座

 

 

 

 

 

不要單獨在實驗室

問題集  (每個問題不一定都有標準答案,甚至會引起很大的爭議,但這就是問題集之主要目的)

 1. 請指出酵化實驗室中,有那些儀器可能具有危險性? 請至少例舉三種。 [1]

 2. 請指出酵化實驗室中,有那些藥品可能具有危險性? 請至少例舉三種。 [1]

 3. 在使用天平之前,你要注意檢查那些事項,以求得最精確的稱量結果? [2]

 4. 當沒有正規的校正儀器時,你如何利用實驗室內的工具大略檢測天平的準確度? [3]

 5. 若沒有標準 pH 溶液時,你如何利用實驗室內的物品校正 pH meter? [4]

 6. 在一般普通的實驗室裡如何快速地校正自動吸管? [3]

 7. 暑假期間常因維修、工程、限電或颱風而停電,你剛準備好某植物樣本的粗抽取液,每瓶 20 mL 共有 10 瓶,暑期要在冰箱裡冷凍貯藏,等開學後再以硫酸銨沈澱所要的酵素,你要如何做才能使你的樣本安然渡過暑假? [3]

 8. 做 ELISA 時要用一種 second Ab-HRP 的連結体試劑,這是把抗体分子與酵素 HRP 用化學鍵連在一起的呈色劑,HRP 在反應後可以呈現黃色物質,以供定量之用。某生在兩個月內持續進行 ELISA 實驗,發現實驗所得的最大吸光度,一週一週下降,由最早的 1.2 降到 0.2。已知抗体及 HRP 都是相當穩定的蛋白質,分析的每個步驟也沒有問題,請指出可能的失誤在那裡? [5]

 9. 某生進行高速離心,使用四隻 30 mL 離心管,把試管兩兩各自平衡得非常準確,放入 16 孔的離心陀中以 15,000 rpm 進行離心,開始後不久離心機就聲響大作,聽起來是沒有平衡好,但同組同學目睹他有做好平衡,離心管都確實成對秤過後,再移到共同儀器室去離心。請問怎麼會這樣? [3]

10.某生用光度計測 280 nm 波長的吸光度,來檢測層析管柱收下來的溶離分劃液共 50 支試管,結果發現這 50 支的吸光一律都很高 (> 2.0),超出了可測定的上限,請問可能出了什麼問題? [3]

11.續上題,助教知道之後,先向某生說抱歉後,換了一支測光管給他,結果稍有改善,勉強可以看出有蛋白質峰的起伏,許多吸光值還是都在 1.5 以上,請問這又是什麼問題? 如何解決? [4]

12.有一種酵素藥品,買來時是 1 g 瓶裝粉末,要放在 -20°C 保存。若你每次要使用 50 mg 做實驗,大約要進行十多次實驗,你應該如何處理這瓶酵素? [3]

13.某生進行酵素活性分析,需要以 ATP 供應反應所需能量,他就向 Sigma 購買 ATP 並進行實驗,雖然反應的確可以順利進行,但發現試劑的價格實在很貴,直到有一天老師看到藥品的瓶子,才驚覺弄了大錯,請問出了什麼問題? [3]

14. 大學部的生化實驗課正在做 CBR 蛋白質定量法,用 ELISA plate 其中的兩排,第一排八個位置加入標準蛋白質的系列濃度,第二排則做四種未知樣本的二重複實驗,某生依照流程把各種樣本都加完後,每個孔洞再各加入 100 mL 呈色液。加完第一排後,老師走過來要他暫停,說他所加的呈色液不對,某生一查果然所用的 autopipet 被調到 150 mL 的位置而非 100 mL。當他正要修改成 100 mL 時,老師急忙叫他不要改正,繼續照流程做完。某生覺得非常疑惑: [4]

(a) 老師怎麼知道他呈色液加錯了?

(b) 老師為何不要他修正,而是直接做下去?

(c) 某生這樣做出來的結果,還能用嗎?

15.某實驗室新買一座 -80°C 無霜冷凍冰箱,有甲乙丙丁四位同學各自操作,分別把相同的藥品 X 放到冷凍櫃去保存,經過一個暑假貯藏後,甲發現活性只剩 30%,乙只剩 50%,丙剩 75%,而丁則有 90%。除了暑假有一次因颱風停電數小時外,他們確定沒有人故意搗蛋。請問為何發生活性下降情形? 為何四個人的活性有差別? [4]

[題目後面方括號內的數字代表該題的難易程度,3 為中等而 5 最難回答,需要一些討論與思考]

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本網頁最近修訂日期: 2017/11/21