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酵素純化與分析 Enzyme Purification and Analysis 酵素實驗室 Enzyme laboratory |
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目 錄 |
0.4 建立實驗室 0.5 藥品試劑 0.6 個人用品 個人安全 必讀 問題集 (0.4~0.6) |
典型的生物化學實驗室 |
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■ 酵素實驗室 (0.4~0.6) |
參考資源 |
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實驗室設備之有效經營管理，在有形或無形中，影響著研究工作的品質與成敗。以下所描述的，是建立一個酵素或蛋白質實驗室，所必需的大小儀器、設備與經營管理。
◆ 研究生涯 (7) 重視整体教學研究環境的優質化 |
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0.4 建立實驗室：實驗室自用小型儀器歸納為 電泳 (electrophoresis) 與 層析 (chromatography) 兩類，大型有 離心 (centrifugation) 及 測光 (spectrometry) 兩種。較大型的基本設備，建議組成區域性共同儀器室，由鄰近幾位教師共同設立，並且一起使用與維護。其它更大的貴重儀器，就要到學院級或跨校的貴重儀器室使用，若由教師個人單獨經營，通常是不切實際且空耗經費及人力，應該多支持使用 共同儀器室。 ◆ 生化共同儀器室 Pub (參考臺大生技系生物化學組的共同儀器室) [請上網以 BST Pub 搜尋] 0.4.1.1 基礎設施： 純水製造機 、製冰機、高速冷凍離心機 (20,000 rpm)、微量離心機、電泳及轉印系統 (含供電器)、ELISA 光度計及各種層析管柱系統 (包含分劃收集器)。其中電泳與層析包含很多獨立小器具，使用上較複雜。 0.4.1.2 個人電腦及周邊： 一般生物化學實驗的運作已經離不開電腦，不管是套裝軟 体或網路資料庫的應用，均不可或缺。要多多利用電腦來加強自身研究工作的規劃、整理、呈現、發表。 ◆ 研究生涯 (2) 善用電腦軟硬体提升你的能力與表現 a. 每個冰箱都要妥善規劃貯位並指派使用人或管理人，要詳細表列冰箱內貯存之物品。同類的藥品要先分類再用小盒裝在一起 (貨櫃化)，勿零散堆積，以免臨時翻找費時，導致冰櫃失溫。注意冰箱門隨時要關好，尤其是零度以下的冰箱，若箱門沒關上而造成回溫，對藥品及冰箱都是超級災難。 b. 零下的冷凍貯藏，不要使用無霜冰箱，因為定時自動除霜會造成冰箱內溫度上升，藥品可能因反復的『凍結-解凍』而失去活性。若不得已必須使用自動除霜冰箱，可把藥品裝在普利龍盒內，使溫度變化所造成的傷害降至最低，也可減輕因停電所造成的傷害。 c. 許多蛋白質操作都要在低溫進行，通常使用『走入式』冷房 (cold room)，但最近漸漸改用裝有透明門扇的大冷藏室，類似便利商店裡銷售冷飲的大冰箱，也相當好用，都要注意溫度是否維持在 4°C 左右。 d. 類似的實驗設備還有植物生長箱，乃至無菌操作枱、細胞培養箱等，都需要專門管理及使用知識。 0.4.1.4 進一步設備： 通常備有：超高速離心機、冷凍乾燥機、超微膜過濾、雙向電泳、等電焦集電泳、分光光度計 (UV 及可見光)、HPLC 或 FPLC、螢光或電子顯微鏡。最近對核酸或蛋白質電泳的紀錄儀器 (如 UVP)，也因其方便性與靈敏度而變得很重要。 0.4.1.5 特別設備： 有液相閃爍計數器、原子吸收光譜分析儀、毛細管電泳等，其他進一步的貴重儀器如：蛋白質定序儀、質譜儀、影像分析系統、分子結構電腦工作站等，有些分析可以送相關廠商的收費服務平台。另外，若進行放射性實驗，則一定要在專門設立的放射性區域進行，所有操作人員也都要有相關的培訓與執照。其他需要證照的操作還有：基因重組實驗、動物實驗、人 体實驗等，有關者請儘早受訓才能進行實驗。 a. 每件儀器應指定專人管理，負責保管零件、附件、說明書，並做初級保養，同時必須定期舉辦工作坊培訓使用者。每種儀器都應儘量使用，在五年內發揮其最大功能，因為通常十年後就無法再維修 (缺乏零件)。 b. 光學或精密儀器，應放在有除溼機的密閉室，同時注意環境的電壓是否穩定；會發熱的器具則集中放在通風處，並且注意電容量是否足夠，以免電源過荷造成災害。 c. 使用儀器前，要先熟悉其操作方法，注意大部分儀器在使用前都需要受訓，若有問題一定要請教管理人，使用前後必須確實登記 (登入、登出)，有任何毛病要立刻報告管理人，不可隱瞞。 0.4.3 小型用具： a. 每個人桌上都需要的小型用具：自動吸管 (20, 200, 1000 mL 三種)、自動吸管頭 (黃色及藍色) 及其盒子、玻璃試管及試管架、計時器、標籤紙、馬克筆、小剪刀、鑷子、滴管、藥杓 (spetulas)、天平秤量紙、保鮮膜、鋁泊紙、冰筒、手套、擦拭紙。另外還可能需要：洗瓶、濾紙、各式漏斗、ELISA plate、膠片染缸、塑膠培養皿、紗布、棉花、透析袋、透析夾。實驗室應建立小量庫存及管理系統，隨時補充物品，以保供應無缺。 b. 實驗室應備有的公用小型機器：桌上離心機、微量離心機 (microfuge)、大小離心管、均質機 (或果汁機、磨粉機)、pH 測定計、電動天平、熱水浴、磁鐵攪拌器、蠕動式幫浦 (peristaltic pump)、試管振盪器 (Vortex)、轉動式振盪器 (rotary shaker)。當秤量僅數 mg 藥物時，先檢查電動天平的靈敏度是否足夠。 c. 常用小儀器如天平、pH 測定計等應集中放在定位 (公用區)，用畢立刻清理好歸位！ 天平、pH 測定計及自動吸管都要經常校正。自動吸管可吸取純水在天平秤量，每 1.0 mL 水應秤得 1.0 gm，若誤差在 1% 以上，立即送修。任何儀器若疑似故障，要貼警告紙條，並通知管理員。 d. 磨碎動植物材料時，經常用到乾冰或液態氮，都要向專業廠商預先購買，特別注意其貯存用具 (受凍裂開)，且操作時要小心避免被超低溫凍傷，一定要使用護目鏡與防凍手套。
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(支持並維護 共同儀器室)
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0.5 藥品試劑：0.5.1 適量庫存： a. 數十年以前的實驗室都有一個藥品櫃，收集實驗室的各種藥品，現在還是有藥品櫃，但已經不是用來做長期大量庫存之用。近年來，由於庫存管理科學的發達，以及快遞服務的密集，在實驗室裡堆積大量藥品並非理想的策略，通常都訂購較少量的藥品，足夠做一兩輪實驗即可。 b. 雖然如此，還是要注意供應廠商的可靠性，是否能準時運送，在下一輪實驗之前，把所需要的藥品準備好。酵素或蛋白質試劑比較不容易保存，通常都不會做很大量的庫存，況且留下來的試劑別人都不太敢用。 a. 每種藥品有其最適當的貯存溫度，切要遵守。一般分為：室溫、4°C 及 -20°C 三種，又可依其為固体、液体或高純度者，分別置放。除了常用的大宗藥品 (如 NaCl) 之外，較精密或不穩定的試劑 (如大部分酵素) 最好不要大量屯積，因為貯藏時間太久後就無法確保其品質。 b. 剛由冰箱取出之藥品，應在充分回溫之後才能打開，並且遠離水源；使用頻繁且不耐回溫的藥品，應少量分裝 (aliquot) 後凍藏，每次取用一個分裝，可不需等待回溫就開瓶使用，用後也不再回收凍藏。 a. 一般依純度及用途分為數級，例如最常用的 Merck 藥廠分為︰合成 (for synthesis)、特級 (extra pure)、生化用 (for biochemistry)、試藥 (pro analysis 或 GR)。各種等級的藥品，價格相差很大，應當用在適當的實驗，否則不是浪費，就是因藥品純度不佳而導致實驗失敗。 b. 許多商品所供應的酵素，是保存在硫酸銨懸浮液中運送，可保持酵素品質之安定；但使用前要先透析，除去硫酸銨，否則在硫酸銨下分析活性可能會造成誤判。也要注意酵素的來源，及其中所含的鹽類或添加物 (如甘油或防腐劑 NaN3)，是否會影響你的實驗。 管制性藥品一定要依照規章定時填表報告，以免觸犯相關法律。臺灣大部分學校已經建立化學污染的回收管控制度，任何化學試劑均不得直接排入水槽，必須集中後由專業人員回收處理。在實驗室內，化學藥品的原液，以及其第一次洗滌液都要倒入固定之回收桶，小心貯藏。若直接倒入水槽而被追蹤舉發，肇事的實驗室將得自行負擔鉅額罰款，嚴重者可能要負法律責任。
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(Sigma 的例子)
(依照規定回收)
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0.6 個人用品： 個人實驗桌上應該配備的小型用具清單請見 0.4.3 a。個人使用的藥品，通常都是配製好的溶液，上面一定要貼上標籤，註明 日期、藥品名稱、使用人姓名 等，藥品名稱不可用暗號，以免日後連自己都忘掉是什麼試劑。試劑不必配製太大量，因大多數藥品經久貯後均不太穩定。常常檢查緩衝液內有無長霉！ 個人的藥品應集中一處固定收存，切忌到處亂放。
(每張圖表均連結有 960 x 720 清晰版本) a. 做完實驗後一定要『馬上』把所用過的儀器、實驗桌、用具等整理乾淨，回復原狀。離開前要從頭回顧，檢查所有使用過的儀器或實驗桌，也許會發現重要的藥品或樣本忘了收起來，或有貴重儀器忘了關機。 b. 玻璃用具 (如試管、燒杯、三角瓶等) 使用後，要儘量在當日清洗掉，這是最省時省力的。用清潔液浸泡時，請使用液態的洗潔精，並在一兩天內清洗掉，因為可以說是『越泡越髒』的！ 實驗記錄可說是研究工作的靈魂，要忠實地把實驗過程中，所有的設計、執行、觀察、結果、討論等，依循一套方法記錄下來。一些偉大的科學研究者，都有很精彩的實驗記錄本，最有名的就是 達文西。雖然目前電腦工具非常發達，市面有很多數位化平台，有些實驗需要以照相或影片來記錄，建議還是以紙本書寫方式為主，並且永久保存，日後若有爭議時將是最好的證據。 當你畢業或因任何緣故離開實驗室前，要把所有儀器、用品等整理妥當，移交給接任者，最好列出交接藥品與儀器清單。你的實驗記錄本通常必須留在原實驗室，或經實驗室主持人 (PI) 同意才能帶走。有論文發表者，要把所有原始資料 (包括圖片與文字)，燒錄成光碟片 (或拷貝在隨身碟 USB 裡) 交給實驗室主持人。 |
(做好實驗日誌)
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許多實驗室內的災難，都是由小型器具或消耗品釀成的，因為這些小東西較多，且易被疏忽。一定要記得，無論操作任何實驗，都要帶護目鏡 (或眼鏡)。一些實驗室內常發生的危險物件與警告如下： 危險藥物： Acrylamide：神經毒！勿吸入其塵埃，秤量時要戴手套及口罩。 SDS：秤量時很容易飛揚，要戴口罩並小心操作，否則吸入將會溶解你的肺泡。 溶劑及瓦斯：致癌、易燃！很多有機溶劑有害健康，並小心瓦斯外洩 (在外洩現場絕對不可觸動任何開關！避免產生火花導致氣爆)。 危險儀器： 離心管：注意平衡！離心管不平衡時，內容物可能會爆開來。 離心機轉陀：注意要密蓋！離心陀蓋子若沒蓋緊，蓋子會飛出，毀掉離心機。 供電器：產生極高電壓！漏電或接觸到電極時，會被電擊休克。 潛在的危機： 玻璃器具：檢查是否有缺口或裂痕！玻璃缺口會刮傷手，裂痕在加熱時會爆開。 微波爐：加熱要先鬆開蓋子！氣密物 体在微波爐中加熱時，會發生爆炸。 衣著或配件：間接造成災害！長髮、涼鞋、太寬鬆衣褲、項鍊裝飾等都很危險。 膨脹反應：小心可能爆炸！加熱、加壓或抽真空，氧化還原反應，請小心都有爆炸可能。 接太多插頭：負載過度！插頭電源有一定的負載量，勿過度使用之，插座若有過熱溶解痕跡馬上換新。 特別注意： 儘量不要用轉接插座，若不得已必須使用，請換成最新的安全插座，不要接太多儀器。 這種插座要有過荷自動斷電裝置，要放在通風處並隨時可以檢查，嚴禁堆在衣物下面。 在實驗室內聞到異味 (不見得一定是燒焦味)，一定要馬上追查源頭，發掘可能的危險。 其他： 任何災變發生時不要搭電梯！ 每天結束回家前要巡查一遍！ 值週同學確實負責公共安全！ 不要帶太多錢在身上或背包！ 不要深夜單獨一人在實驗室！ (若非得如此時，一定要隨身攜帶手機，任何緊急事件直接撥打 112)
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預先察覺危險： 毒 性 氣 体 溫 度 反 應 爆 炸 高 速 玻 璃 電 流
注意插頭及插座
不要單獨在實驗室 |
問題集 (每個問題不一定都有標準答案，甚至會引起很大的爭議，但這就是問題集之主要目的)1. 請指出酵化實驗室中，有那些儀器可能具有危險性？ 請至少例舉三種。 [1] 2. 請指出酵化實驗室中，有那些藥品可能具有危險性？ 請至少例舉三種。 [1] 3. 在使用天平之前，你要注意檢查那些事項，以求得最精確的稱量結果？ [2] 4. 當沒有正規的校正儀器時，你如何利用實驗室內的工具大略檢測天平的準確度？ [3] 5. 若沒有標準 pH 溶液時，你如何利用實驗室內的物品校正 pH meter？ [4] 6. 在一般普通的實驗室裡如何快速地校正自動吸管？ [3] 7. 暑假期間常因維修、工程、限電或颱風而停電，你剛準備好某植物樣本的粗抽取液，每瓶 20 mL 共有 10 瓶，暑期要在冰箱裡冷凍貯藏，等開學後再以硫酸銨沈澱所要的酵素，若要重新做一次，你要如何規劃才能使樣本安然渡過暑假？ [3*] 8. 做 ELISA 時要用一種 second Ab-HRP 的連結体試劑，這是把抗体分子與酵素 HRP 用化學鍵連在一起的呈色劑， HRP 在反應後可以呈現黃色物質，以供定量之用。某生在兩個月內持續進行 ELISA 實驗，發現實驗所得的最大吸光度，一週一週下降，由最早的 1.5 降到 0.2。已知抗体及 HRP 都是相當穩定的蛋白質，其連結体試劑都經冷凍收藏好，每個分析步驟也沒有問題，請指出可能的失誤在那裡？ [5*] 9. 某生進行高速離心，使用四隻 30 mL 離心管，把試管兩兩各自平衡得非常準確，放入 16 孔的離心陀中以 15,000 rpm 進行離心，開始後不久離心機就聲響大作，聽起來是沒有平衡好，但同組同學目睹他有做好平衡，離心管都確實成對秤過後，再移到共同儀器室去離心。請問怎麼會這樣？ [3*] 10. 某生用光度計測 280 nm 波長的吸光度，來檢測層析管柱收下來的溶離分劃液共 50 支試管，結果發現這 50 支的吸光一律都很高 (> 2.0)，超出了可測定的上限，請問可能出了什麼問題？ [3*] 11. 續上題，助教知道之後，先向某生說抱歉後，換了一支測光管給他，結果稍有改善，勉強可以看出有蛋白質峰的起伏，許多吸光值還是都在 1.5 以上，請問這又是什麼問題？如何解決？ [3] 12. 有一種酵素藥品，買來時是 1 g 瓶裝粉末，要放在 -20°C 保存。若每次你要取出 50 mg 配製酵素溶液，大約要進行十多次實驗，你應該如何處理這瓶酵素？ [2*] 13. 某生進行酵素活性分析，需要以 ATP 供應反應所需能量，他就向 Sigma 購買 ATP 並進行實驗，雖然反應的確可以順利進行，但發現試劑的價格實在很貴，直到有一天老師看到藥品的瓶子，才驚覺弄了大錯，請問出了什麼問題？ [3*] 14. 大學部的生化實驗課正在做 CBR 蛋白質定量法，用 ELISA plate 其中的兩排，第一排八個位置加入標準蛋白質的系列濃度，第二排則做四種未知樣本的二重複實驗，某生依照流程把各種樣本都加完後，每個孔洞再各加入 100 mL 呈色液。加完第一排後，老師走過來要他暫停，說他所加的呈色液不對，某生一查果然所用的 autopipet 被調到 150 mL 的位置而非 100 mL。當他正要修改成 100 mL 時，老師急忙叫他不要改正，繼續照流程做完。某生覺得非常疑惑： [4*] (a) 老師怎麼知道他呈色液加錯了？ (b) 老師為何不要他修正，而是直接做下去？ (c) 某生這樣做出來的結果，還能用嗎？ 15. 某實驗室新買一座大型家用無霜冷凍冰箱，有甲乙丙丁四位同學各自操作實驗，分別把相同的藥品 X 放到冷凍櫃去保存，經過一個暑假貯藏後，甲發現活性只剩 30%，乙只剩 50%，丙剩 75%，而丁則有 90%。除了暑假有一次因颱風停電數小時外，他們確定沒有人故意搗蛋。請問為何發生活性下降情形？為何四個人的活性有差別？ [4] [題目後面方括號內的數字代表該題的難易程度，3 為中等而 5 最難回答，標有 * 為實際問題] |
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