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目錄	3.1 製備式電泳電泳用具操作方式 3.2 超高速離心法沉降係數密度梯度兩種離心離心陀操作注意 3.3 超微薄膜過濾法 Ultrafiltration 濃縮裝置其他方法問題集	簡單的實驗室製備式電泳 (酵素分析：電泳法)	下載 [內文 pdf] [投影片 pdf] [影音檔 mp4] Wikipedia [Purification] {BCbasic} 連結生物化學基礎

3 其他純化方法

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3.1 製備式電泳：

製備式電泳通常以不含 SDS 的原態 disc-PAGE 進行，可回收具有活性的蛋白質；蛋白質樣本要先經部分純化，否則效果不佳，事先多以分析式電泳確定所要色帶的位置。詳細說明可參考酵素分析的電泳部分。

a. 電泳用具：

商品的製備式電泳器具很多，都相當複雜且昂貴，但使用一般 8 × 16 cm 大小的垂直平板電泳，再利用 3 mm 厚的間隔條即可進行，量小時用迷你電泳亦足夠使用。

b. 操作方式：

(1) 鑄膠：分離膠体只佔全高度一半，焦集膠体佔四分之一，則樣本可佔其餘的四分之一 (以上述大小的膠体而言約有 15 mL)，不必用樣本齒模，因此只跑一種樣本。

(2) 預跑：最好在樣本加入前，先預跑約 20 min，以除去 APS 的影響。

(3) 電泳：可在冷房進行，條件大略同一般電泳，勿使膠体過熱，也不要跑太快。

(4) 定位蛋白質：方法很多，蛋白質量多時可以 300 nm 波長紫外光照射直接觀察，切出所呈現的色帶；否則要先切一小條膠体染色，再比對位置切出色帶。

(5) 電泳溶離：以電泳收集膠体內的蛋白質，這一步會損失不少蛋白質，要特別小心。

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[Gel electrophoresis]

3.2 超高速離心法：

a. 沉降係數：

蛋白質分子在離心時，其分子量、分子密度、組成、形狀等，均會影響其沉降速率，沉降係數即用來描述此沉降性質，其單位為 S (Svedberg unit)，每一種蛋白質的沉降係數與其分子密度或分子量成正比。不同沉降係數的蛋白質，可利用超高速離心法，在密度梯度中進行分離。

b. 密度梯度作法：

一般有三種製作梯度的方式：

(1) 在樣本溶液中直接溶入 CsCl，經離心後可自動形成 CsCl 的濃度梯度。

(2) 使用梯度製造器，在離心管內預先拉好甘油或蔗糖的梯度，加樣本後離心。

(3) 若對蛋白質性質與離心條件極為熟悉，以上亦可以階段式 (stepwise) 梯度進行。

c. 兩種離心方式：

上述 b (1) 及 (2) 二者，分屬兩類不同的離心形式，列表並以圖解說明如下︰

(每張圖表均連結有 960 x 720 清晰版本)

d. 離心陀種類：

使用不同離心陀，有不同離心方式及效果。

(1) 角型 (angle rotor)：典型的離心方式，多用在大量製備時，離心管與地面成一角度。

(2) 懸籃式 (swing bucket rotor)：傳統用在密度梯度離心，離心管與地面平行。

(3) 垂直 (vertical rotor)：取代懸籃式，離心管垂直地面，可大大縮短離心時間。

(4) 區帶 (zonal rotor)：較特殊的離心陀，整個陀內分成幾個區帶，注入梯度與樣本。

(5) 連續式 (continuous rotor)：可一邊離心，一邊加入或取出樣本，多為工業使用。

e. 操作注意：

超高速離心因為轉速極高，離心陀構造也較複雜，操作上要非常小心，完全純熟後才能進行實驗，新手要有熟練者在旁指導。操作時特別注意下列各點：

(1) 離心管的平衡要絕對準確，封管要確實，否則液体可能在真空中抽乾。

(2) 使用懸籃式離心陀，在懸掛離心管時，要注意有沒有掛妥，前後方向是否正確。

(3) 轉速切勿超過所使用離心陀的最高限，老舊離心陀的最高限還要打折。

(4) 離心後要清理離心陀，可用水沖乾淨後晾乾，尤其使用 CsCl 者非清洗不可。

(5) 時常檢查離心艙及離心陀，注意有無腐蝕及傷痕，有問題者立刻請廠商檢修。

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[Ultracentrifuge]

3.3 超微薄膜過濾法：

離子交換法乃是利用分子帶電性質的差異來進行分離，解析力好且具多樣性，是常見且應用極廣的純化方法。

a. 超微薄膜過濾技術 (ultrafiltration, UF)：

(1) 使用具有極細孔徑的薄膜，可以分離分子量不同的分子。薄膜上細孔的大小固定，只能讓某分子量以下的分子通過，此分子量稱為該薄膜的 cut-off。

(2) 其基本原理類似透析，但 UF 薄膜的孔徑則更細，而且可選擇孔徑大小。應用這種薄膜技術的方式很多，主要用在濃縮、脫鹽及無菌過濾。

(3) 另外在純水的製造上，以薄膜配合逆滲透 (reverse osmosis, RO) 所製成的管柱，可除去水中 90% 以上的離子。

b. 超微膜濃縮裝置：

因樣本体積的大小不同，微膜有各種不同型態的設計，常用者如下：

(1) 空心管 (hollow fiber)：微膜薄層鋪在堅固空心小管的內側，當樣本通過空心管時，小分子則由側面擠出，比較不會有局部濃度太高的問題。

(2) 多層側流板 (tangential-flow)：多層微膜疊在一起，樣本溶液的流動方向與微膜平面成平行，小分子由側向微膜擠出，也較無局部過濃的問題。

(3) 攪拌加壓過濾 (stirred cell)：加壓迫使小分子擠過微膜，大分子留在原處，並在薄膜表面攪動，以防止局部過濃而阻塞微膜細孔。

(4) 振動濃縮子 (Immersible-CX)：濃縮子直接浸入含有樣本的試管中進行，微膜平敷在濃縮子表面，並以振動方式去除局部過濃現象，沒有無效体積，故樣本損失量較低。

(5) 微膜離心管 (Centricon)：離心管中央安置一微膜隔離，利用離心力把小分子擠過，大分子留在原處，樣本數目多而体積少時，多採用此法。

c. 其它濃縮方法：

除了上述之超微薄膜系統之外，另有其他常用的濃縮方法︰硫酸銨沉澱、冷凍乾燥、透析袋濃縮、電泳溶離濃縮、真空冷凍離心、氮氣吹乾等。這些方法都很實用，但注意其中有部分在濃縮後溶液中的鹽濃度提高，可能會影響後續實驗，使用超微薄膜則無此缺點。圖 3.2 比較各種濃縮方法的適用体積範圍，一般實驗室常用的有：冷凍乾燥、stirred cell, Centricon (Centriprep) 及 SpeedVac。