酵素純化  Enzyme Analysis

5  蛋白質定量  Protein Determination

基 本：科學研究 - 酵素實驗室 - 酵 素

純 化：蛋白質抽取 - 層析法 - 其他方法 - 純化策略

分 析：蛋白質定量 - 活性測定 - 電泳法 - 蛋白質科技

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參考資源

目 錄

5.1  Biuret Method

5.2  Lowry Method

5.3  UV Absorbance

5.4  Coomassie Blue Method

5.5  Other Methods

問題集 

以 CBG 定量蛋白質

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 Wikipedia  

 [Protein]

{BCbasic}

連結生物化學基礎

5  蛋白質定量

參考資源

請注意以下三點酵素與蛋白質定量的基本問題：

a. 蛋白質量與酵素活性不必定成正比： 酵素是一種蛋白質，因此測定純質酵素樣本中的蛋白質量，大致可說是該酵素的含量。但須注意酵素是具有活性的分子，蛋白質含量很高的，不見得活性就高。

b. 慎選標準品： 蛋白質定量需要一已知的標準品，以求得標準曲線，一般採用 白蛋白 (albumin) 或 免疫球蛋白 (immunoglobulin)，使用不同的標準品所得到的結果，會有極大的差異。

c. 注意干擾因子： 樣本中的雜質或緩衝液都可能影響定量，因此檢測時濃度較高的樣本，所得結果可能會低估，而稀釋倍數較大的樣本，因所含干擾物質被稀釋，測定值比較可靠。

5.1 Biuret 法：

銅離子在鹼性溶液中，可與蛋白質胜鏈上的 carbonyl 基結合，生成紫色複合物，兩個 carbonyl 與一個銅離子結合成類似 雙縮脲 (biuret) 複合体，因此若蛋白質濃度越濃，其呈色就越高。然而其 精確度 較差 (數 mg)，且受到樣本中硫酸銨及 Tris 干擾，但 準確度 較高且不受蛋白質的種類或成分之影響。後來由 biuret 法發展出更靈敏的 BCA 呈色法，利用兩分子 bicinchoninic acid 與結合在蛋白質上的銅離子反應，進一步的呈色使精確度大大提升。

5.2 Lowry 法：

也是上述 biuret 呈色法的延伸，當銅離子與胜鏈形成複合物後，可再與 Folin-Ciocalteau 試劑的 phosphomolybdic-phosphotungstate 作用產生藍色物質，蛋白質中的芳香族胺基酸也會與 Folin-Ciocalteau 試劑結合呈色，因此比 Biuret 更靈敏 (約 0.1 mg) 但反應步驟較多，也受到硫酸銨及硫醇化合物的干擾。步驟中各項試劑的混合，要特別注意均勻澈底，否則可能有大誤差。 

5.3 UV 吸光法：

a. 芳香基團：

胺基酸的芳香基團在 280 nm 有吸光，蛋白質胜鏈骨架上的 carbonyl 基團在 206 nm 附近有吸光，蛋白質濃度越濃則吸光度就高。由於各種蛋白質所含芳香族胺基酸組成不一，在 280 nm 的吸光能力亦不同，可以 分子消光係數 (molar extinction coefficient) 表示。

b. 分子消光係數：

一般以 E (1%, 280 nm) 來表示，大部分蛋白質在 4~15 間 (平均為 10)。若某蛋白質 E 值為 10，其溶液在 280 nm 吸光值為 1，則此蛋白質的濃度為 1 mg/mL。可以下式計算︰

吸光值 ＝ E × b × c 

(c 為蛋白質 % 濃度，即每 100 mL 所含蛋白質的克數；b 為光徑 1 cm)

c. 略估蛋白質濃度：

此法只有在蛋白質純度很高時，才能精確測定，但若將普通蛋白質的 E 值平均定為 10，則對粗抽取液的略估相當方便：在 280 nm 的吸光值為 1 時，濃度約為 1 mg/mL。

5.4 Coomassie Blue (dye binding) 法：Bradford Method

Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBG) 在過氯酸溶液中呈紅棕色，但與蛋白質結合後則變成藍色，呈色可測 595 nm 波長的吸光。此法方便靈敏 (達 0.01 mg)，且可使用微量滴定盤進行分析，降低試劑用量，方便大量樣本的操作。請注意電泳膠片染色所用的 Coomassie Brilliant Blue 是同系列的另一種 R 產物 (CBR)，顏色稍偏紅，與 CBG 用途不同。

5.5 其它方法：

有些蛋白質含有特殊的 非蛋白質基團，如 peroxidase 含有 heme 基團，可測 403 nm 波長的吸光來定量之。含有特殊金屬的酵素 (如鎘)，則可追蹤該金屬。

(本圖連結有 960 x 720 清晰版本)

圖 5.1 說明各種蛋白質定量方法所根據的原理，目標蛋白質在中央以捲繞的綠色粗線表示，其上並標出蛋白質的脊骨 (-N-C-C-N-C-C-)，胺基酸上的幾種官能基團 (Lys, Arg, Tyr等)，都可被用來作為定量的根據。

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[Biuret test]

[BCA test]

[Lowry test]

[Absorbance]

[Bradford test]

問題集   (每個問題不一定都有標準答案，甚至會引起很大的爭議，但這就是問題集之主要目的)

1. 請寫出下面一小段胜肽的分子構造，請指出所含有的特殊化學基團，並以此說明對其立體構形所造成的影響。 [5]

Glu-Cys-Ala-Trp-Lys-Phe-Cys-Asn-Leu-Tyr-Tyr-Gly

2. 請查出各種蛋白質定量方法，並做表註明以下各項特徵或性質：[1]

定量反應的原理、靈敏度範圍、專一性、所測的波長、反應所受的干擾、優缺點

3. 某蛋白質的 ^{206 nm} E_{1 mg/mL} ＝ 31，當測得 206 nm 的吸光為 1.0 時，此蛋白質濃度多少？ [3]

4. 某蛋白質 X 的分子量為 10 kD，已知其分子消光係數 (^{280 nm} E_{1 mM}) 為 20，若你測得該蛋白質溶液在 280 nm 的吸光值為 1，則此溶液的蛋白質濃度應為若干 mg/mL？ [4]

5. 以 UV 吸光度定量蛋白質時，樣本的純度要很高才有意義；但另一方面來說，對於一個粗抽取液的蛋白質樣本，也可以用吸光度來測定其濃度，且通常不會偏差太多，請討論其意義如何？ [3*]

6. 請詳細說明 Coomassie Brilliant Blue 蛋白質定量的呈色原理。 [1]

7. Biuret 反應的原理如何？為何稱為 Biuret reaction？ [1]

8. 某蛋白質並無方便的活性或定量方法，但其分子含有鎘，可如何追蹤此蛋白質？ [2]

9. UV 280 nm 與 206 nm 都可用來定量蛋白質，但其所根據機理不同，請說明其優劣點。[2]

10. 那幾種蛋白質定量法最準確，不會受到所含胺基酸組成的不同所影響？ [2]

11. 常用的 Coomassie Brilliant Blue 蛋白質定量法要以標準蛋白質做比對，定量結果會因所用標準品不同而有偏差，請問為何？如何避免之？ [3*]

12. 某非極性蛋白質需要界面活性劑 (0.1% Triton X-100) 做為溶入劑，因此所有的緩衝液都含有 Triton。在進行 Coomassie Brilliant Blue 定量蛋白質時，發現不管樣本中有無蛋白質，都呈現很高的呈色反應，請問是發生了何種問題？如何改善之？ [2*]

[題目後面方括號內的數字代表該題的難易程度，3 為中等而 5 最難回答，標有 * 為實際問題]

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