B3-3a

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  電泳檢定法   3.1  3.2  3.3  3.4  3.5  3.6

B3 目錄

較常使用的電泳方法簡述如下： 不連續膠體電泳 (disc-PAGE 或 native-PAGE) 一般用於檢定純度或活性分析，SDS-膠體電泳 (SDS-PAGE) 則用於蛋白質次單元體分子量的檢定，梯度 (gradient) 膠體電泳則是以膠體濃度的連續梯度鑄膠，可以使電泳解析力大為提高。現在多以迷你平板直立式電泳，進行分析用途的電泳。

3.1

不連續膠體電泳 (native-PAGE)：

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不連續膠體電泳是最基本的聚丙烯醯胺電泳形式，在分離膠體 pH 8.8 的電泳條件下，大部分 pI 小於 8.8 的蛋白質分子均能往正極移動，因此分子的泳動率則與樣本的電荷密度 (負電荷數 / 分子量) 成正比。 因膠體不含 SDS，故酵素活性多能保持，可以在膠體上做酵素活性染色，也可用於大量樣本的純化，即製備式電泳。

儀器：

鑄膠套件 (含電泳玻片及氧化鋁片)

間隔條 (spacer, 0.75 mm)

樣本梳 (comb, 10 well)

垂直電泳槽 (Hoefer SE-250 平板式垂直迷你電泳槽)

電源供應器 (ISCO-453 或 Pharmacia Biotech EPS 200)

微量針管 (Hamilton 80465) 或電泳樣本專用吸管頭

試劑：

A 液 (T 30%, C 2.6%)：

B 液 (分離膠體緩衝液)：

C 液 (焦集膠體緩衝液)：

通用電泳緩衝液 (5×)： (在稀釋時加入 0.1 % SDS 使成為 SDS running buffer)

APS 溶液 (ammonium persulfate, 10%)：

取 0.1 g 溶於 1 mL 水，要確實溶解完全；使用前新鮮配置，過夜者不再用。

追蹤染料 (tracking dye)：

取 bromophenol blue 約 1 mg 溶於 5 mL 通用電泳緩衝液，加 5 mL 甘油混勻。

高分子量標準蛋白質組合 (Pharmacia HMW electrophoresis calibration kit)：

注意： 以 native-PAGE 測定的分子量，只能做為參考，不能做為唯一證據。

方法：

鑄膠：

(1) 將電泳玻片及氧化鋁片清洗淨後擦乾，再以玻璃清潔劑擦拭乾淨，選擇所需厚度的間隔條 (spacer) 將其組裝於鑄膠套件中。

(2) 依照表 3.1 所列的各溶液比例，選擇所需的分離膠體濃度；配置膠體溶液時，其中 APS 溶液必須最後加入，小心混合均勻，以避免氣泡產生，然後緩緩倒入裝置好的鑄膠套件中。若你不知要用多少濃度的膠體，先試 7.5% 者。

表 3.1  常用 native-PAGE 膠體溶液 (單位 mL)

(3) 膠體高度約佔玻片的 2/3 至 3/4 高，加完後儘快在各膠體液面上方小心加入 100 mL 異丙醇，以壓平膠體液面。

(4) 約 30 min 至 1 h 後 (天冷須更久)，凝膠完成，倒出上層的異丙醇。

(5) 配置焦集膠體溶液，先準備好所需之樣本梳 (comb)，加入溶液後立刻插入，整個過程必須在 5 min 完成，約 30 min 可完成凝膠。

(6) 拆卸鑄膠套件，將多餘的凝膠去除，鑄好的膠片置於封口袋中放在 4℃保存，並加入少量蒸餾水防止膠片乾裂，使用期限約為一週。

電泳：

(1) 先取出膠片回溫，將稀釋成一倍的通用電泳緩衝液，倒入電泳槽的底部。接著把膠片以 45 度架到電泳槽上，避免氣泡產生；當電泳夾夾妥後，在電泳玻片組合的上方，加入電泳緩衝液。電泳前，先以微量針管清洗各樣本槽，避免有凝膠不完全的殘餘物留在樣本槽內。

◆ 膠片一定要等回復室溫後才能架到電泳槽，否則玻片會因熱漲而撐破。

(2) 取適量的樣本 (約 10~15 mL)，加入 1/4 體積之追蹤染料，混合均勻後以微量針管小心的注入膠體中的樣本槽，並避免氣泡的產生。

◆ 加入的樣本要事先定量，以便算出加入若干量的蛋白質。

(3) 高分子量的標準蛋白質約需 4~8 mL，作為蛋白質分子量的參考；但在 disc-PAGE 中，分子量的測定並不可靠，因此應避免用來決定分子量。

(4) 將電泳槽上部蓋子蓋上，確認正負極裝置正確 (蛋白質由負極往正極跑)，連接上電源供應器，定電壓以 100~150 V 進行電泳，若膠片需做活性染色，則必須在 4℃冷房中進行電泳。

(5) 待追蹤染料跑出膠片後，關掉電源，取出膠片中的膠體，以解剖刀截角做記號，準備進行染色。

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3.2

SDS 膠體電泳：

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B3 目錄

SDS-PAGE 是在電泳系統中，利用界面活性劑 SDS (sodium dodecyl sulfate) 附在蛋白質疏水區表面，由 SDS 本身所帶之負電荷引導泳動。 由於蛋白本身所帶電荷遠小於附著之 SDS 分子，因此蛋白質本身的電荷對泳動率沒有影響，泳動率只決定於蛋白質分子量，故 SDS 電泳適合測定蛋白質的分子量。 在樣本處理過程中，利用加熱破壞蛋白質的三級及四級結構，使其分子內部的疏水區暴露而與 SDS 結合；加入還原劑可破壞蛋白質分子內的雙硫鍵，常用還原劑有  b-mercaptoethanol 或 dithiothreitol。 因此 SDS-PAGE 廣泛地應用於蛋白質次單元體分子量的決定。

儀器：

同上節之不連續膠體電泳

試劑：

除了上節所使用的藥品外，還需配置以下的藥品：

SDS 膠體電泳樣本溶液 (SDS-PAGE sample buffer, 2×)：

10% SDS 溶液：

取 1 g SDS 溶於 10 mL 二次水；SDS 極易揚起，注意勿吸入，以免造成傷害。

SDS 電泳緩衝液 (1×)：

配置同通用電泳緩衝液，但在稀釋時加入 SDS 使成為 0.1 % SDS。

低分子量標準蛋白質組合 (Pharmacia LMW electrophoresis calibration kit)：

或可用 Novex SeeBlue Pre-stained standards (見 p. 217)，其蛋白質色帶呈藍色。

方法：

鑄膠：

(1) 方法同上節不連續膠體電泳，只是在膠體溶液中多加了 1% 的 SDS；膠體的濃度配方如下表 3.2，10 mL 約足夠鑄造兩片膠片。

表 3.2  常用 SDS-PAGE 膠體溶液 (單位 mL)

電泳：

(1) 先取出膠片回溫，將稀釋成一倍的 SDS 電泳緩衝液，倒入電泳槽的底部。接著把膠片以 45 度角放入，可避免氣泡的產生，當電泳夾夾妥後，在電泳玻片的上方，加入電泳緩衝液。同樣也要清洗每個樣本槽。

(2) 取適量的樣本 (約 5~10 mL)，加入同體積之樣本緩衝液 (sample buffer) 再加入 2 mL 追蹤染料，混合均勻後於 100℃ 中煮 5 min，待冷卻後離心 30 sec，以微量針管小心的注入膠體中的樣本槽，並避免氣泡的產生。

(3) 低分子量標準蛋白質約需 4~8 mL，作為蛋白質分子量參考的依據。

(4) 將電泳槽上部的蓋子蓋上，確認正負極裝置正確，連接上電源供應器，定電壓以 100~150 V 進行電泳。

(5) 待追蹤染料跑出膠片外，關掉電源，取出膠片中的膠體，以解剖刀截角做記號，準備進行染色。

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3.3

梯度膠體電泳：

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B3 目錄

梯度電泳的分離膠體濃度成為一連續梯度，由低至高 (由上而下)，可使電泳的解析力增強。在 disc-PAGE 中，蛋白質分子的泳動率除了受到分子量影響外，分子本身的電荷也有影響，因此無法單用 disc-PAGE 來決定原態蛋白質的分子量；但若以梯度膠體進行電泳，則分子帶電性對泳動率的影響減小，就可做為檢定蛋白質原態分子量的參考。 在 SDS-PAGE 中製造梯度，則其解析力亦大幅提高，分子量差異極小 (< 1,000 Da) 的次單元體亦有可能分離，故梯度膠體亦為決定蛋白質分子量之利器。但因其製備過程較為麻煩，因此並不被用來作為一般分析。

儀器：

電泳器具同上節之不連續膠體電泳，另須以下儀器用具：

五片裝鑄膠套件 (Hoefer SE-275 含電泳玻片、氧化鋁片、樣本梳、間隔條各四套)

迷你梯度製造器 (ISCO, 高低限各 30 mL)

蠕動幫浦 (Pharmacia P-1) 及止血鉗

試劑：

同上節鑄膠所需樣本，另準備：

50% glycerol (其中含少量 bromophenol blue)

方法：

(1) 將電泳玻片及氧化鋁片清洗淨後擦乾，以矽化液或玻璃清潔劑擦是乾淨，選擇所需厚度的間隔條 (spacer) 將其組裝於鑄膠套件中。電泳玻片表面的清潔於否對鑄膠結果有決定性的影響，而鑄膠套件中的三角形填塞橡皮必須移走。

(2) 將梯度製造器與幫浦連線，而幫浦再與鑄膠套件連線，梯度製造器的兩槽中的連通管以止血箝夾住，準備開始鑄膠。

(3) 先決定梯度的範圍，選擇所需的分離膠體濃度，配置高限及低限膠體溶液，其中 APS 溶液必須最後加入，小心混合均勻，避免氣泡產生，徐徐倒入梯度製造器的兩槽中。通常在高限濃度的膠體溶液中，加入少量 bromophenol blue，則形成的藍色梯度有助辨識梯度製造是否良好。

(4) 打開梯度製造器前槽的攪拌器，將止血箝移開，同時打開幫浦，使膠體溶液流往鑄膠套組，整個過程在 3 min 完成。

(5) 在膠體被抽乾的同時，加入 50% 甘油，以便將鑄膠套組中的膠體溶液推到正確高度，當甘油到達玻片時立即停止幫浦；藍色的 bromophenol blue 可幫助辨識。此步驟需注意不可有氣泡跑入整個管路中，否則會破壞梯度形成。

(6) 膠體高度約玻片的 2/3 至 3/4 高，加完後在各膠片組合中加入 100 mL 異丙醇，壓平膠體液面。

(7) 焦集膠體的鑄造過程同前節所述；或可省去焦集膠體，直接在分離膠體灌好後，把樣本梳插上，但分離膠體就要灌高一點。

接 3.4 節