B3-3b

     

  酵素化學實驗  B3 酵素操作方法   1 分析  2 純化  3 電泳  4 轉印  

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 3

  電泳檢定法   3.1  3.2  3.3  3.4  3.5  3.6

 

B3 目錄

 

3.4

等電焦集法:

 
 

等電焦集法 是根據蛋白質的 pI 進行分離。當樣本蛋白質在含有 ampholyte 的聚丙烯醯胺中泳動時,ampholyte 會自動形成一 pH 梯度;當蛋白質的 pI 低於環境 pH 時,其淨電荷為負,因此會往正極泳動;而當環境 pH 與此蛋白質 pI 相同時,淨電荷變為零而不泳動,且焦集在膠體中。 與已知 pI 的標準蛋白質樣本比較,即可得知此樣本蛋白質的 pI。 以下所述方法,是在直立式平板電泳系統 (Novex) 進行的,若要進行 二次元電泳,則須使用柱狀膠體,Hoefer SE-250 另配備有此種套組。Pharmacia 最新開發的 IPGphor 也是等電焦集,可以進一步用在二次元電泳。

 
 

儀器:

 

預鑄膠體套組 (Novex IEF gel pH 3~10)

 

電泳槽 (Novex Xcell II 平板式垂直迷你電泳槽)

 

電源供應器

 
 

試劑:

 

負極緩衝液 (cathode buffer, 10×):

 

Arginine (free base)  (Sigma A-5006) 3.5 g
Lysine (free base)  (Sigma L-5501) 2.9 g

用 80 mL 水溶解後,以 HCl 調 pH 至 10.2 後加水至 100 mL,儲存於 4℃。

 

 

正極緩衝液 (anode buffer, 50×):

 

Phosphoric acid (85%) 4.7 g

用 80 mL 水溶解後,以 HCl 調 pH 至 2.4 後加水至 100 mL,儲存於 4℃。

 

 

樣本緩衝液 (2×):

 
負極緩衝液 (10×) mL
Glycerol   (Wako) 3 mL

加入少量 bromophenol blue,加水至 10 mL。

 

 

固定液 (5×):

 
Sulphosalicylic acid (Wako) 3.46 g
Trichloricacetic acid (Wako) 11.46 g

加水至 100 mL 溶解。

 
 

標準 pI 蛋白質組合 (Pharmacia broad pI calibration kit):

 
Protein: pI
Trypsinogen 9.30
Lentil lectin-basic band 8.65
Lentil lectin-middle band 8.45
Lentil lectin-acidic band 8.15
Myoglobin-basic band  7.35
Myoglobin-acidic band 6.85
Human carbonic anhydrase B 6.55
Bovine carbonic anhydrase B 5.85
b-Lactoglobulin A 5.20
Soybean trypsin inhibitor 4.55
Amyloglucosidase 3.50
   
 
 

方法:

 

(1) 將樣本與樣本緩衝液以 1:1 混合,通常樣本中的鹽濃度在 10~20 mM 間最適合,若鹽濃度太高則會影響電泳的結果。

 

(2) 將 10× 的負極緩衝液稀釋至 1×,並確定正確的 pH 值。利用超音波震盪抽氣以去除氣泡,以減少在電泳過程中出現的二氧化碳,在電泳槽的上槽加入適當量的緩衝液。

 

(3) 將 50× 的正極緩衝液稀釋至 1×,確定 pH 值正確後加入電泳槽的下槽。

 

(4) 小心注入已混合均勻的樣本。

 

(5) 依照下面的條件,進行電泳:

 

100 V (1 h) → 200 V (1 h) → 500 V (30 min)

 

(6) 電泳完畢後,打開膠體卡匣,將膠體浸入固定液中 30 min 固定蛋白質,並洗去 ampholyte,若 ampholyte 未洗淨會造成膠體染色背景過深。

 

(7) 以所要的染色方法對膠體進行染色。

 
       

 

 

     

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3.5

膠體染色法

B3 目錄

 

3.5.1  Coomassie Brilliant Blue R (CBR) 染色法:

 
 

CBR 染色法 是利用藍色 CBR 分子上的芳香苯環,與蛋白質的疏水區結合;同時其亞硫酸基團 (-SO32-) 與蛋白質的正電荷結合,可使蛋白質染出藍色色帶。是非常方便的蛋白質染色法,但其靈敏度不高,每個色帶至少要有數十 mg 以上的蛋白質才染得清楚。

 
 

儀器:

 

平台震盪器

 

染色缸: 最好用玻璃製品,Corning 廚具的長方形玻璃缸極為合用。

 
 

試劑:

 

CBR 染色液

 
Coomassie Brilliant Blue R-250 (Sigma B-0630) 0.75 g

用 250 mL 甲醇溶解後,再加入 250 mL 二次水及 50 mL 醋酸。

 
 

CBR 脫色液

 

10% 醋酸與 20% 甲醇的水溶液。

 

 

方法:

 

(1) 將電泳完畢的膠體浸入 CBR 染色液中,染色液用量只要蓋過膠片即可;置於平台震盪器上搖盪 30 min。

 

(2) 倒出染色液,用自來水沖洗後倒入脫色液,脫色液蓋過膠片即可。 於染色缸中放入一塊吸水紙,可加速脫色過程。

 

(3) 若蛋白質濃度較低,則染色時間可加長 (1 h) 以增加色帶深度。

 

(4) 若膠體表面有不溶的 CBR 染料沈積,可以用 50% 甲醇洗去。

 
 

3.5.2  硝酸銀染色法:

 
 

硝酸銀染色 是一種靈敏度極高的蛋白質染色法,靈敏度可達 CBR 染色的百倍以上。 蛋白質分子上的酸基 (COO-) 會與銀銨錯離子結合,而銀離子在酸性環境中被還原為金屬銀,可使蛋白質色帶呈現深棕至黑色。本染色法增加了還原液甲,藉由其中的戊二醛 (glutaraldehyde) 與蛋白質分子上的胺基 (Lys 或 Arg) 耦合,而增加銀離子的結合基團,使得靈敏度更增。硝酸銀染色的成敗決定於所使用的藥品品質,試劑的製備必須使用 Milli-Q 或同等級的水。

 

 

儀器:

 

平台震盪器、玻璃染色缸

 
 

試劑

 

還原液甲

 
Glutaraldehyde (25%)  (Merck) 4.0 mL
Sodium thiosulfate (Sigma S-7143) 0.8 g

用二次水定量至 100 mL。

 
 

還原液乙

 
Citric acid (0.5% 水溶液)  (Wako 特級) 1.0 mL
甲醛 (Wako 特級)  0.1 mL
甲醇 (Wako 特級)  15.0 mL

用二次水定量至 100 mL。

 
 

硝酸銀液

 
NaOH (0.36% 水溶液) (Merck) 21.0 mL
氨水 (Merck GR) 1.4 mL
H2O (Milli-Q) 73.6 mL
硝酸銀 (Wako 特級) 0.8 g

將硝酸銀溶於 4 mL 二次水,緩慢滴入 NaOH、氨水與二次水的混合液中,邊滴入邊搖盪,確定沒有混濁生成,全量滴入完成後應呈現澄清,若有混濁現象則在以氨水滴定至澄清。

 
 

反應中止液

 
Citric acid (0.5% 水溶液) (Wako)  10.0 mL
Ethylenediamine (Wako)  0.1 mL

用二次水定量至 100 mL。

 
 

矽化液

 

Dichlorodimethylsilane 5% (Fluka) 的氯仿溶液。

 

◆ 注意矽化液揮發性強且具毒性,要帶手套在排煙櫃中操作。

 

 

方法:

 

(1) 先將玻璃染缸表面做矽化,目的是防止硝酸銀液反應後,膠片黏在缸上,造成取出時膠片破裂。

 

◆ 矽化需戴雙層手套,因矽化物及氯仿具有毒性且會溶解手套。

 

(2) 電泳後,膠片放至玻璃染缸中,以 50% 甲醇洗三次,每次至少 10 min。

 

◆ 經 CBR 染色過的膠片,若有些色帶無法出現,可在脫色完畢後,接到此一步驟進行硝酸銀染色,以利進一步觀察。

 

(3) 倒去甲醇,用水洗三次,每次 10 min。

 

(4) 加入還原液甲,反應 1 h。

 

(5) 倒去還原液甲,用水洗 3~5 次,每次 10 min。

 

(6) 加入硝酸銀溶液,反應 10 min。

 

(7) 倒去硝酸銀液,用水洗 3~5 次,每次 10 min。

 

(8) 加入還原液乙,開始呈色,在背景顏色未加深前倒去還原液乙。

 

(9) 用水洗過膠片後,馬上加入反應中止液,約 1 h 後,可進行膠片乾燥。

 

(10) 若染色後背景顏色過深,可以利用硫代硫酸鈉溶液或者定影液洗過夜,則可重新染色。

 
 

3.5.3  醣蛋白質染色法 (過碘酸-硝酸銀法):

 
 

硝酸銀染色是一種靈敏度極高的蛋白質染色法,而且也可以用來染蛋白質分子上的醣類。 醣類的雙醇基 (diol) 可用過碘酸氧化為醛基 (-CHO),因而可與銀銨錯離子結合;此染色法可以檢定蛋白質是否為醣蛋白,靈敏度比 Schiff 法要高。但由於蛋白質本身也會呈色,因此在染色過程中必須在同一片膠體上加有 positive control (使用 glycoprotein, IgG) 與 negative control (如 BSA),在 negative control 尚未呈色前,所染得的色帶才是醣蛋白。

 

 

儀器及試劑:

 

儀器及硝酸銀等試劑同上節,另需下列各藥品:

 

固定液 A

 

10% 醋酸 (Wako) 及 25% 異丙醇 (Merck) 的混合溶液。

 
 

固定液 B

 

7.5% 醋酸 (Wako) 溶液。

 
 

過碘酸溶液

 
Periodic acid (Sigma P-7875) 0.2 g

用二次水定量至 100 mL。

 
 

還原液乙

 
Citric acid (0.5%) (Wako) 1.0 mL
甲醛 (Wako) 0.1 mL
甲醇 (Wako) 15 mL

用二次水定量至 100 mL。

 

 

方法:

 

(1) 先將染缸表面做矽化處理,目的是防止硝酸銀液反應後,膠片黏在缸上,容易造成取出時膠片破裂。

 

(2) 電泳後,膠片放至玻璃缸中,以固定液 A 固定過夜。

 

(3) 隔日改以固定液 B 浸泡 30 min。

 

(4) 倒去固定液 B,加入過碘酸溶液於 4℃反應 1 h。

 

(5) 倒去過碘酸溶液,用水洗 3~5 次,整個過程共 3 h。

 

(6) 加入硝酸銀溶液,反應 10 min。

 

(7) 倒去硝酸銀液,用水洗 3~5 次,每次 10 min。

 

(8) 加入還原液乙開始呈色,觀察 negative control 的蛋白質是否呈色,在其未呈色前倒去還原液乙。

 

(9) 用水洗過膠片後,馬上加入反應中止液,約 1 h 後,可進行膠片乾燥。

 

(10) 若染色後背景顏色過深,可以利用硫代硫酸鈉溶液或者定影液洗過夜,則可重新染色。

 
 

3.5.4  澱粉磷解脢活性染色法

 
 

原態電泳後的膠片若浸入含有酵素基質的反應液中,則待酵素反應呈色後,可得知酵素泳動率以及其活性強弱;但酵素所生成的產物必須是水不溶性,才能在膠片中聚集呈色。 澱粉磷解脢在含有 Glc-1-P 的環境下,可進行葡聚醣的延長反應,產生不可溶的直鏈澱粉,然後以碘液使澱粉染上紅棕至深紫色。此法偵測磷解脢的活性極為靈敏,但會受雜夾在樣本中 b-amylase 的干擾。

 
 

儀器:

 

平台震盪器、恆溫箱 (37℃)

 
 

試劑:

 

MES 緩衝液 (0.04 M, pH 5.9):

 
MES (2[N-morpholino] ethanesulfonic acid) (Sigma M-8250) 1.56 g

以 KOH 調整 pH 至 5.9 後,加水至 200 mL 置於 4℃ 保存。

 
 

Glc-1-P (32 mM):

 
Glucose-1-phosphate (Sigma G-6895) 0.98 g

加水至 100 mL,置於 4℃ 保存,Glc-1-P 會因儲存過久而裂解出磷酸,使用期限為三週左右。 

 
 

可溶性澱粉 (1.2%):

 
可溶性澱粉 (Sigma S-2630 或 Nakalai 321-22) 1.2 g

取 1.2 g 可溶性澱粉先以少量熱水溶解,再加水至 100 mL,置室溫儲存。使用前若有不溶物則再加熱溶解之,放冷後才能加入 Glc-1-P。 

 
 

碘液呈色劑

 
Iodine  (Wako) 0.45 g
KI (Nakalai 296-25) 2.83 g

加水至 200 mL。

 

 

方法:

 

(1) 將原態電泳完畢的膠體置於基質液中,其中 MES : Glc-1-P : soluble starch = 2:1:1 (體積比);基質液用量只要蓋過膠片即可。

 

(2) 於 37℃ 中反應適當的時間,1~2 mg 的 SP 在含有醣引子下,反應 2 h 可染出清楚色帶,不含醣引子則約需 18~24 h。

 

(3) 反應完成後,可以看到白色的澱粉色帶出現。倒去基質液,以蒸餾水清洗膠片數次,加入碘液蓋過膠片以呈色,並且震盪使呈色均勻。

 

(4) 此時可看見碘呈色色帶:含有澱粉引子的膠片,其背景顏色較深;可在蒸餾水中清洗,以洗去多餘的可溶性澱粉基質;若色帶因碘昇華而消失,可以再加入碘液重染一次。

 

(5) 若樣本中含有澱粉脢 (如 b-amylase),則在含澱粉的膠片上出現反白色帶,會影響磷解脢的呈色。為了避免這種影響,在電泳完畢後,可將膠片先浸於 100 mM HgCl2 溶液中 3~5 min 後洗去,以抑制澱粉脢的活性。

 
        

 

 

     

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3.6

膠片乾燥法:

B3 目錄

 

利用玻璃紙 (賽路芬 cellophane) 的半透膜特性,電泳膠片中的水分及甲醇在三明治組合中會滲透而蒸發,使得膠片被壓乾且壓平於兩張玻璃紙中,可以長久保存。膠片乾燥後亦可做同位素放射顯像,或者色帶濃度掃描。

 
 

用具:

 

玻璃板、玻璃紙、文書夾

 

 

方法: (如 下圖)

 

(1) 在玻璃板上鋪平第一張溼潤的玻璃紙 (A),玻璃紙的四邊要略大於玻璃板,四邊折下,避免玻璃紙與玻璃板中有任何的氣泡產生

 

(2) 將染色完畢之膠片置於上述步驟之玻璃紙上 (B)。

 

(3) 將另外一張玻璃紙浸溼,小心鋪蓋於膠片上,避免任何氣泡產生 (C),玻璃紙的四邊要略大於玻璃板約 1~2 cm,將第二層的玻璃紙四邊反摺到玻璃板背面 (D)。

 

(4) 以文書夾夾住四角,置於室溫或 37℃ 烘箱中乾燥 (E),也可以電扇吹風。

 

(5) 檢查膠片是否完全乾燥,可以利用指甲在膠片上輕敲,乾燥完全的膠片不會留下任何指甲痕跡;可將膠片剪下,以護貝膠膜護貝後保存。

Drying

 

 
       

 

建立日期:2001/4/21   更新日期:2002/07/27  © 版權所有