B3-3b

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  電泳檢定法   3.1  3.2  3.3  3.4  3.5  3.6

B3 目錄

3.4

等電焦集法：

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等電焦集法 是根據蛋白質的 pI 進行分離。當樣本蛋白質在含有 ampholyte 的聚丙烯醯胺中泳動時，ampholyte 會自動形成一 pH 梯度；當蛋白質的 pI 低於環境 pH 時，其淨電荷為負，因此會往正極泳動；而當環境 pH 與此蛋白質 pI 相同時，淨電荷變為零而不泳動，且焦集在膠體中。 與已知 pI 的標準蛋白質樣本比較，即可得知此樣本蛋白質的 pI。 以下所述方法，是在直立式平板電泳系統 (Novex) 進行的，若要進行 二次元電泳，則須使用柱狀膠體，Hoefer SE-250 另配備有此種套組。Pharmacia 最新開發的 IPGphor 也是等電焦集，可以進一步用在二次元電泳。

儀器：

預鑄膠體套組 (Novex IEF gel pH 3~10)

電泳槽 (Novex Xcell II 平板式垂直迷你電泳槽)

電源供應器

試劑：

負極緩衝液 (cathode buffer, 10×)：

正極緩衝液 (anode buffer, 50×)：

樣本緩衝液 (2×)：

固定液 (5×)：

標準 pI 蛋白質組合 (Pharmacia broad pI calibration kit)：

方法：

(1) 將樣本與樣本緩衝液以 1:1 混合，通常樣本中的鹽濃度在 10~20 mM 間最適合，若鹽濃度太高則會影響電泳的結果。

(2) 將 10× 的負極緩衝液稀釋至 1×，並確定正確的 pH 值。利用超音波震盪抽氣以去除氣泡，以減少在電泳過程中出現的二氧化碳，在電泳槽的上槽加入適當量的緩衝液。

(3) 將 50× 的正極緩衝液稀釋至 1×，確定 pH 值正確後加入電泳槽的下槽。

(4) 小心注入已混合均勻的樣本。

(5) 依照下面的條件，進行電泳：

100 V (1 h) → 200 V (1 h) → 500 V (30 min)

(6) 電泳完畢後，打開膠體卡匣，將膠體浸入固定液中 30 min 固定蛋白質，並洗去 ampholyte，若 ampholyte 未洗淨會造成膠體染色背景過深。

(7) 以所要的染色方法對膠體進行染色。

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3.5

膠體染色法：

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B3 目錄

3.5.1  Coomassie Brilliant Blue R (CBR) 染色法：

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CBR 染色法 是利用藍色 CBR 分子上的芳香苯環，與蛋白質的疏水區結合；同時其亞硫酸基團 (-SO₃^2-) 與蛋白質的正電荷結合，可使蛋白質染出藍色色帶。是非常方便的蛋白質染色法，但其靈敏度不高，每個色帶至少要有數十 mg 以上的蛋白質才染得清楚。

儀器：

平台震盪器

染色缸： 最好用玻璃製品，Corning 廚具的長方形玻璃缸極為合用。

試劑：

CBR 染色液：

CBR 脫色液：

10% 醋酸與 20% 甲醇的水溶液。

方法：

(1) 將電泳完畢的膠體浸入 CBR 染色液中，染色液用量只要蓋過膠片即可；置於平台震盪器上搖盪 30 min。

(2) 倒出染色液，用自來水沖洗後倒入脫色液，脫色液蓋過膠片即可。 於染色缸中放入一塊吸水紙，可加速脫色過程。

(3) 若蛋白質濃度較低，則染色時間可加長 (1 h) 以增加色帶深度。

(4) 若膠體表面有不溶的 CBR 染料沈積，可以用 50% 甲醇洗去。

3.5.2  硝酸銀染色法：

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硝酸銀染色 是一種靈敏度極高的蛋白質染色法，靈敏度可達 CBR 染色的百倍以上。 蛋白質分子上的酸基 (COO^-) 會與銀銨錯離子結合，而銀離子在酸性環境中被還原為金屬銀，可使蛋白質色帶呈現深棕至黑色。本染色法增加了還原液甲，藉由其中的戊二醛 (glutaraldehyde) 與蛋白質分子上的胺基 (Lys 或 Arg) 耦合，而增加銀離子的結合基團，使得靈敏度更增。硝酸銀染色的成敗決定於所使用的藥品品質，試劑的製備必須使用 Milli-Q 或同等級的水。

儀器：

平台震盪器、玻璃染色缸

試劑：

還原液甲：

還原液乙：

硝酸銀液：

反應中止液：

矽化液：

Dichlorodimethylsilane 5% (Fluka) 的氯仿溶液。

◆ 注意矽化液揮發性強且具毒性，要帶手套在排煙櫃中操作。

方法：

(1) 先將玻璃染缸表面做矽化，目的是防止硝酸銀液反應後，膠片黏在缸上，造成取出時膠片破裂。

◆ 矽化需戴雙層手套，因矽化物及氯仿具有毒性且會溶解手套。

(2) 電泳後，膠片放至玻璃染缸中，以 50% 甲醇洗三次，每次至少 10 min。

◆ 經 CBR 染色過的膠片，若有些色帶無法出現，可在脫色完畢後，接到此一步驟進行硝酸銀染色，以利進一步觀察。

(3) 倒去甲醇，用水洗三次，每次 10 min。

(4) 加入還原液甲，反應 1 h。

(5) 倒去還原液甲，用水洗 3~5 次，每次 10 min。

(6) 加入硝酸銀溶液，反應 10 min。

(7) 倒去硝酸銀液，用水洗 3~5 次，每次 10 min。

(8) 加入還原液乙，開始呈色，在背景顏色未加深前倒去還原液乙。

(9) 用水洗過膠片後，馬上加入反應中止液，約 1 h 後，可進行膠片乾燥。

(10) 若染色後背景顏色過深，可以利用硫代硫酸鈉溶液或者定影液洗過夜，則可重新染色。

3.5.3  醣蛋白質染色法 (過碘酸-硝酸銀法)：

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硝酸銀染色是一種靈敏度極高的蛋白質染色法，而且也可以用來染蛋白質分子上的醣類。 醣類的雙醇基 (diol) 可用過碘酸氧化為醛基 (-CHO)，因而可與銀銨錯離子結合；此染色法可以檢定蛋白質是否為醣蛋白，靈敏度比 Schiff 法要高。但由於蛋白質本身也會呈色，因此在染色過程中必須在同一片膠體上加有 positive control (使用 glycoprotein, IgG) 與 negative control (如 BSA)，在 negative control 尚未呈色前，所染得的色帶才是醣蛋白。

儀器及試劑：

儀器及硝酸銀等試劑同上節，另需下列各藥品：

固定液 A：

10% 醋酸 (Wako) 及 25% 異丙醇 (Merck) 的混合溶液。

固定液 B：

7.5% 醋酸 (Wako) 溶液。

過碘酸溶液：

還原液乙：

方法：

(1) 先將染缸表面做矽化處理，目的是防止硝酸銀液反應後，膠片黏在缸上，容易造成取出時膠片破裂。

(2) 電泳後，膠片放至玻璃缸中，以固定液 A 固定過夜。

(3) 隔日改以固定液 B 浸泡 30 min。

(4) 倒去固定液 B，加入過碘酸溶液於 4℃反應 1 h。

(5) 倒去過碘酸溶液，用水洗 3~5 次，整個過程共 3 h。

(6) 加入硝酸銀溶液，反應 10 min。

(7) 倒去硝酸銀液，用水洗 3~5 次，每次 10 min。

(8) 加入還原液乙開始呈色，觀察 negative control 的蛋白質是否呈色，在其未呈色前倒去還原液乙。

(9) 用水洗過膠片後，馬上加入反應中止液，約 1 h 後，可進行膠片乾燥。

(10) 若染色後背景顏色過深，可以利用硫代硫酸鈉溶液或者定影液洗過夜，則可重新染色。

3.5.4  澱粉磷解脢活性染色法：

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原態電泳後的膠片若浸入含有酵素基質的反應液中，則待酵素反應呈色後，可得知酵素泳動率以及其活性強弱；但酵素所生成的產物必須是水不溶性，才能在膠片中聚集呈色。 澱粉磷解脢在含有 Glc-1-P 的環境下，可進行葡聚醣的延長反應，產生不可溶的直鏈澱粉，然後以碘液使澱粉染上紅棕至深紫色。此法偵測磷解脢的活性極為靈敏，但會受雜夾在樣本中 b-amylase 的干擾。

儀器：

平台震盪器、恆溫箱 (37℃)

試劑：

MES 緩衝液 (0.04 M, pH 5.9)：

Glc-1-P (32 mM)：

可溶性澱粉 (1.2%)：

碘液呈色劑：

方法：

(1) 將原態電泳完畢的膠體置於基質液中，其中 MES : Glc-1-P : soluble starch = 2:1:1 (體積比)；基質液用量只要蓋過膠片即可。

(2) 於 37℃ 中反應適當的時間，1~2 mg 的 SP 在含有醣引子下，反應 2 h 可染出清楚色帶，不含醣引子則約需 18~24 h。

(3) 反應完成後，可以看到白色的澱粉色帶出現。倒去基質液，以蒸餾水清洗膠片數次，加入碘液蓋過膠片以呈色，並且震盪使呈色均勻。

(4) 此時可看見碘呈色色帶：含有澱粉引子的膠片，其背景顏色較深；可在蒸餾水中清洗，以洗去多餘的可溶性澱粉基質；若色帶因碘昇華而消失，可以再加入碘液重染一次。

(5) 若樣本中含有澱粉脢 (如 b-amylase)，則在含澱粉的膠片上出現反白色帶，會影響磷解脢的呈色。為了避免這種影響，在電泳完畢後，可將膠片先浸於 100 mM HgCl₂ 溶液中 3~5 min 後洗去，以抑制澱粉脢的活性。

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3.6

膠片乾燥法：

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B3 目錄

利用玻璃紙 (賽路芬 cellophane) 的半透膜特性，電泳膠片中的水分及甲醇在三明治組合中會滲透而蒸發，使得膠片被壓乾且壓平於兩張玻璃紙中，可以長久保存。膠片乾燥後亦可做同位素放射顯像，或者色帶濃度掃描。

用具：

玻璃板、玻璃紙、文書夾

方法： (如 下圖)

(1) 在玻璃板上鋪平第一張溼潤的玻璃紙 (A)，玻璃紙的四邊要略大於玻璃板，四邊折下，避免玻璃紙與玻璃板中有任何的氣泡產生。

(2) 將染色完畢之膠片置於上述步驟之玻璃紙上 (B)。

(3) 將另外一張玻璃紙浸溼，小心鋪蓋於膠片上，避免任何氣泡產生 (C)，玻璃紙的四邊要略大於玻璃板約 1~2 cm，將第二層的玻璃紙四邊反摺到玻璃板背面 (D)。

(4) 以文書夾夾住四角，置於室溫或 37℃ 烘箱中乾燥 (E)，也可以電扇吹風。

(5) 檢查膠片是否完全乾燥，可以利用指甲在膠片上輕敲，乾燥完全的膠片不會留下任何指甲痕跡；可將膠片剪下，以護貝膠膜護貝後保存。

Drying