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3

酵素動力學：

以動力學說明酵素對基質分子的催化行為。

■ 目錄 第 3 節 酵素動力學  (討論汽車的速度與汽油的效率) 

■ 何為動力學？  (酵素的效率決定於基質的濃度) 

◆ An Introduction to Enzyme Kinetics (英國 Paisley 大學的教學講義)

3.1

酵素催化反應：

酵素提供基質一個穩定的空間，有利於穩定其過渡狀態，並快速轉變成為生成物。

■ 3.1 酵素的催化反應  (提供一催化表面 - 輔助桌面)

　a.

反應物 (A, B) 轉變成生成物 (A-B) 途中，有 過渡狀態 [A...B] 生成：

 A + B  →  [A...B]  →  A-B 

b.

過渡狀態 (transition state) 的位能較高，其生成需要能量，稱為 活化能 (activation energy, E_act)；經由酵素的催化，可降低反應活化能，使反應速率加快，但 不影響反應的平衡方向。

c.

一些過渡狀態的類似物 (analog) 會卡住酵素活性區，但無法完成反應，即成為抑制劑。 這種過渡狀態的類似物可做為抗原，免疫動物後所產生的抗體，可能有類似酵素的催化作用，但催化速率較低，稱為 abzyme。

■ Abzyme 催化性抗體  ([sp³]* 過度狀態)

　d.

酵素降低活化能的機制有以下幾點，都是因為 活性區 的特殊立體構造：

(1) 酵素活性區專一性地與基質結合，提供最適的空間排列，以便穩定過渡狀態。

(2) 活性區通常為一凹陷口袋，隔開外界的水環境，減低水分子的干擾。

(3) 活性區附近的某些胺基酸可提供 活性官能基 (通常帶有電荷) 直接參與反應。

(4) 很多酵素含有 輔脢 或 輔因子，輔助反應 (見上節)。

■ 3.1 酵素活性區 (魔術口袋)  (穩定, 隔離, 基團, 輔脢)

◆ 圖 1 酵素動力學大綱 是以流程方式，列出酵素動力學的主要探討項目。當研讀動力學部分時，請隨時依章節號碼參閱本圖。 (圖中酵素的漫畫造型取自 Gonick, L. & Wheelis, M. 所著 The Cartoon Guide to Genetics, 有中譯版)

F1

圖 1 酵素動力學公式的推演及其應用

▲  

3.2

酵素動力學：

動力學是如何進行的？ 改變基質濃度，再看酵素如何活動。

■ 3 酵素動力學  (考試評鑑：給予基質→看成效)

3.2.1

基本概念：

酵素動力學的形成，是根基於『過渡狀態濃度恆定』的概念。 早在 1913 年，Michaelis [發音 mi-ka-ei-lis] 及 Menten 就以 轉化脢 (invertase) 系統為研究對象，發現有關酵素與基質反應的一些行為模式，他們提出：

a.

Steady state 理論： 

酵素催化時，基質先與酵素結合，生成過渡狀態，再轉變成產物； 而酵素與基質的結合是 可逆的 (E + S → ES)； 而當反應達 穩定狀態 (steady state) 時，其中的 [ES] 濃度不變 (因為 ES 生成量等於其消失量)。

■ Invertase Reaction 轉化脢  (還原糖的測定法︰利用還原力)

■ Steady State Theory 最重要基本假設  (有一 [ES] 濃度穩定狀態)

b.

酵素行為的數學描述： 

反應速率 (v) 與 酵素 或 基質 的關係，可以數學式表示； 在固定的酵素量下，反應速率 v 與基質濃度 [S] 成 雙曲線 關係 (但只有雙曲線一股)，可用公式表之，即 Michaelis-Menten (M-M) 動力學公式。

◆ Stryer Biochemistry: Pre-Steady State Enzyme Kinetics (一套相當詳細的說明圖片)

3.2.2

Michaelis-Menten 公式的推演：

由四個基本設定開始，可一步一步推得 M-M 動力學公式。

a.

酵素 E 與基質 S 反應如下，各步驟反應速率由常數 k₁, k₂, k₃ 表示：  基本式

b.

導 M-M 公式前的四個基本關係及假設：  公設

(1) 因 [ES] 不變，故 ES 的消耗量等於生成量：

 k₂  [ES] + k₃  [ES] = k₁ [E][S]                           

(2) 總酵素濃度 [E_t] ＝ 單獨存在者 [E_f] + 酵素基質複合體 [ES]   [E_t] ＝ [E_f] + [ES]    

(3) 反應初速 (v_o) 是由後半分解反應 (k₃) 所決定： v_o  =  k₃  [ES]    

(4) 最大反應速率 (V_max) 是假設所有酵素均轉變成 [ES]，

故上式可改寫為︰         V_max = k₃  [E_t] 

■ 3.2.2 四個基本觀察式  (由基本式推 ES, Et, v_o, V_max)

c.

基於上述條件，可推 M-M 公式如下： 

3.2.3

Michaelis-Menten 公式的意義：

M-M 公式可以求得 V_max 及 K_m，求得 V_max 及 K_m 有何意義？

a.

M-M 公式是 雙曲線 公式。若固定酵素量，改變其基質量 [S]，則可得到不同的反應初速 v_o，再以 [S] 為 x 軸，v_o 為 y 軸作圖，可得到一股雙曲線，其漸近點為 V_max。

b.

低濃度 [S] 時反應速率 v_o 與 [S] 成正比，即 v_o∼[S] ¹，是為 一級反應 (first order reaction)； 當 [S] 增大，v_o 接近漸近線時，v_o 的改變很小，不受 [S] 變化的影響，即 v_o∼[S] ⁰，稱為 零級反應 (zero order)。

c.

若基質量 [S] 也固定，則 M-M 公式變為：   

              V_max (常數 [S])

v_o ＝ ────────── ∼ V_max (常數)

            (常數 K_m) + (常數 [S])

由 (IV) V_max = k₃ [E_t]，故 v_o∼[E_t]，即 反應速率 與 酵素量 成正比。

d.

事實上 ES → E + P 的反應為可逆，但此逆反應可忽略，因 M-M 公式的測定，是反應初期所測的反應初速 (v_o)，此時生成物 [P] 的濃度很低，逆反應幾乎無從發生。

   ◆ 練習以紙筆自行推演 M-M 公式及上述各種情況下的變化。

■ 動力學實驗的操作例子  (實驗也是如此操作)

3.2.4

V_max 及 K_m 的測定與意義：

V_max 及 K_m 是每一個酵素極重要的性質指標，可以顯示其催化特性。

■ 3.2.3 M-M 公式意義 → K_m; V_max  (1st, 0 order 兩區；[S] 固定)

3.2.4.1

V_max 及 K_m 測定法：

步驟相當單純，但隨著各種酵素活性測定方法的難易有別。動力學實驗的基本資料，為在一系列 [S] 濃度下所測得的反應初速 (v_o)，依法作圖即可求出 V_max 及 K_m。 有以下數種作圖求法：

a.

直接作圖法： 

是最基本的數據作圖。 以 [S] 為橫軸 v_o 為縱軸，所得漸近線的最高處為 V_max，K_m 為 50% V_max 時的 [S]。

b.

Lineweaver-Burk 雙倒數作圖法：

是最常用的作圖方式；因直接作圖法只能以漸近估計求得 V_max，若 x 及 y 軸分別改為 1/[S] 及 1/v_o，則可作出一條直線來，由 x 軸上的交點求出 1/K_m，由 y 軸交點求出 1/V_max。

◆ 循一實例練習畫出動力學測定的直接作圖及其雙倒數作圖。並請注意 V_max 及 K_m 的單位是什麼，為何會得到此種單位？

c.

Eadie-Hofstee 作圖法：

雙倒數圖的直線，在接近 y 軸處，打點太密，求得直線稍有困難。 若分別以 v_o /[S] 及 v_o 為 x, y 軸，亦可畫出直線，且各點的分佈較平均。

◆ The Use of the Eadie-Hofstee Plot for Determining Kinetic Parameters 

3.2.4.2

K_m 的意義：

K_m 是酵素與基質間親和力的指標，K_m 越大親和力越小。

■ 3.2.4.2 K_m: 基質親和力 (前半段)  (1/2 V_max → K_m = [S]； K_m 大小)

a.

當反應速率為 50% V_max 時，v_o = 1/2 V_max，代入 M-M 公式，則得：

  V_max       V_max [S]

  ── = ────，整理得 K_m ＝ [S]  (只在 v_o＝ 1/2 V_max 條件下)

     2         K_m＋[S]  

因此 K_m 的意義表示，要達到一半最高催化速率時 [S] 所需濃度。 

b.

若酵素的 K_m 越低，則表示它要接近 V_max 所需的基質濃度越低。若某一酵素有數種基質，各有不同的 K_m，則 K_m 越低的基質，表示它與酵素的親和力越大，催化反應愈容易進行。 K_m 與 [S] 一樣是濃度單位 (mM 或 mM)。

■ K_m hexokinase 的三種 substrates  (基質立體構造的影響甚大)

c.

某酵素的 K_m 值可看成在一般細胞內，該酵素基質的大約濃度。

3.2.4.3

V_max 的意義：

請確實瞭解 V_max = k₃ [Et] 的意義 (公式 IV)。

a.

在足夠的基質濃度下，一定量的酵素所能催化的最高反應速率，即為其 V_max；要讓一個酵素達致其 V_max，就要把基質量調至最高濃度。在比較不同酵素的 V_max 活性時，注意要以同樣莫耳數的酵素分子為基準。

b.

單位時間內每莫耳酵素所能催化的基質數 (莫耳數)，稱為 turn over number 或 molecular activity，一般酵素約在 0.1~10,000 間 (每秒)，有大有小不等。 這是當基質量極大於 K_m 時 ([S] >> K_m)，反應推向右邊，E + S → ES → E + P，其 k₃ 成為決定因素，即為 turn over number，特標記為 k_cat。

■ 3.2.4.3 Turnover number k₃ (後半段)  (基質極大 (k_cat)；基質極小 2nd order)

c.

當基質量遠小於 K_m 時 (K_m >> [S] 則 [E_t] = [E] 而 K_m + [S] = K_m)，則可以由 M-M 公式導得：

V_max [S]         k₃ [E_t][S]        k₃ [E][S]        k_cat 

v_o ＝ ──── ＝ ──── ＝ ──── ＝ ── [E][S] 

K_m + [S]         K_m + [S]             K_m             K_m 

反應速率成為 second order，由 [E] 及 [S] 兩項因素決定之。

而 k_cat / K_m 常數的大小則為重要指標，同時顯示酵素的催化效率及專一性。

d.

瞭解上述的 K_m 與 V_max 後，重新回顧最早的酵素與基質反應式：

若把此式分成兩半，前半是 E + S → ES 由 k₁ 與 k₂ 主導；後半 ES → E + P 由 k₃ 主導。 則顯然 V_max 是後半反應決定 (記得 V_max = k₃ [E_t])，而 K_m 則大體上由前半反應所定。 因此整個酵素反應，是由這兩半反應所共同組成，前半以 K_m 來決定酵素與基質的親和度，後半反應以生成物的產生來決定最高反應速率。注意 K_m 的定義是 (k₂ + k₃) ÷ k₁，故後半反應還是對 K_m 有影響。

3.2.4.4

酵素活性定義：

有兩種表示酵素活性的方式，請注意其定義不同，不要混淆。

a.

活性單位：

酵素活性的表示方法通常使用 活性單位 (unit)︰ 即酵素 每分鐘 若催化 1 mmole 基質 的活性，即定義為一單位活性：注意同一酵素可能會有不同定義方式的活性單位。

b.

比活性： 

每單位重量蛋白質 (mg) 中所含的酵素活性 (unit)，稱為 比活性 (specific activity, unit/mg)；因酵素為活性分子，有時會失去活性，雖然蛋白質仍在，但比活性會下降。

■ 3.2.4.4 酵素活性單位 (IU)  (有不同定義的活性單位)

◆ 酵素純化與分析；酵素活性測定法  (詳細說明如何測定酵素活性)

▲  

3.3

雙基質反應：

■ 3.3 雙基質反應  (Hexokinase 也是雙基質反應)

a.

上述 S→P 催化反應，只有一種基質及一種生成物，稱為 Uni-Uni 反應。 但事實上大多數酵素反應，有一個以上的基質，也可能有數個生成物，為多基質反應。例如：

S1 ＋ S2    

S    

S1 ＋ S2     

b.

雙基質反應仍可適用於 M-M 公式，但 兩種基質的 K_m 要分別測定；測 S1 的時候，反應中的 S2 濃度要飽和 (使 S2 成為非主導因子)，反之亦然。

c.

Bi-Bi 反應中基質 (S1, S2) 及生成物 (P1, P2) 的進出次序有數種情形：

(1) Random：基質進入活性區並沒有一定次序，但兩個基質都要結合到酵素後，才會開始進行反應。

(2) Ordered sequential： 基質依固定次序進入，然後生成物再依序出來。

(3) Ordered ping-pong： 依 [S1進, P1 出; S2 進, P2 出] 次序，像是兩個 Uni-Uni 組成的；也像是打乒乓球一樣地一來一往。

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4

酵素的抑制：

酵素活性的抑制，也是一個重要的調控方式。

■ 酵素的抑制：可逆 vs 不可逆  (好像汽車的煞車系統)

▲  

4.1

酵素的抑制方式：

a.

以抑制劑與酵素結合而導致抑制作用，這種結合是 可逆 或 不可逆 反應都有。

b.

很多生理或藥理上的作用，都是源自於抑制劑對酵素的作用，而使酵素的活性降低，或者完全失去活性。如消炎的 磺胺藥，即是一種細菌酵素基質 (PABA) 的類似物，可抑制細菌葉酸的合成。

c.

抑制劑與酵素產生非共價性結合，然後可以阻礙基質進入酵素活性區，或者改變酵素構形而使其失活。

　d.

抑制酵素的機制，依 抑制劑 [I] 與  酵素 [E] 的結合方式，可以分成三種：

Competitive, non-competitive 及 uncompetitive (請見 圖 2 整理)； 由抑制劑對酵素動力學曲線所造成的影響，即可得知是何種抑制方式。

F2

圖 2 各種酵素抑制反應的機制及其動力學行為

▲  

4.2

不可逆的抑制：

不可逆性抑制劑會對酵素活性區上的主要胺基酸做 共價性修飾，因此酵素活性通常被嚴重破壞，便無上述三種動力學抑制方式。

a.

青黴素 (penicillin) 喬裝成基質，可與細菌的一種酵素發生不可逆的結合，此酵素乃細菌細胞壁生合成的重要酵素，細菌無法正常生成細胞壁而死亡。 有點像是分子版的『木馬屠城記』。

■ 不可逆的抑制  (抗生素 penicillin 例子)

b.

重金屬：Hg²⁺, Pb²⁺, Cd²⁺ 及砷化物等重金屬，非專一性地與 [E] 或 [ES] 結合，取代原來酵素所需的金屬，而使酵素失去活性。

c.

化學修飾劑： 某些化合物可以 專一性 地修飾特定胺基酸，除了可做為專一性抑制劑外，也可用來檢定酵素活性區中，具有催化反應的胺基酸為何者 (表 1)。

表 1  若干蛋白脢的抑制劑及其作用機制：

◆ 日本真理教所用的沙林毒氣 (Sarin) 是一類似 DIFP 的抑制劑。

d.

蛋白脢及其抑制劑： 蛋白脢廣泛存在於細胞中，有其專一性抑制劑可控制其生理活性，二者互相抗拮形成一調節控制網。 目前極被重視的 HIV 蛋白脢及其人工抑制劑，在醫藥研究上有很大的作用及影響。

◆ 有關蛋白脢的分類，請見 6.1.2 一節。

◆ A Protease and Protease Inhibitor Web Server  (法國 Tours 大學的蛋白脢網站)

■ 酵素抑制劑在醫藥上的功用  (一些重要實例)

■ HIV Protease vs Acid Protease 比較  (利用構形對稱性的差別)

◆ HIV Protease  (HIV protease 立體模型，需要 Chime)

◆ An Accurate Look into HIV  (如何有效抑制 HIV protease)

◆ HIV Protease  (OMM 分子模型館，需要 Chime)

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