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細胞代謝與酵素調控：

酵素與細胞代謝極為密切，因為所有的代謝路徑，全是由酵素與其基質所組成的；此外，還要加上對酵素活性的調節控制，以便使得細胞正常運作。

■ 酵化講義目錄 第 7 節  (開車上路注意紅綠燈與號誌)

7.1

細胞代謝途徑：

細胞經同化作用合成所需分子，由異化代謝消耗分子、取得能量，全由酵素所控制。

7.1.1

代謝調控原則：

控制酵素即可控制代謝路徑，控制代謝的大原則如下各點。

a.

一個基因一個酵素： 細胞的代謝途徑極為複雜，但並非細胞所有的代謝路徑都在進行；進行中的每一步代謝，都由某一種酵素負責催化反應，而每一個酵素分子都是由一個對應基因所轉錄。因此某基因的開啟或關閉，到最後可能會影響代謝途徑的進行。

b.

速率決定步驟： 因此控制該酵素的 活性 或 生合成量，即可控制該步驟反應的快慢；若此反應為某一系列代謝路徑的 速率決定步驟 (rate-limiting step)，則可控制這整條代謝途徑。

c.

可逆或不可逆： 大部份酵素反應是 可逆 的，有時為了使反應保持在某一方向，則成為不可逆反應；不可逆反應大多與消耗 ATP 的反應耦合。

d.

代謝路徑可互通： 許多代謝路徑間若有共同的中間物，則可互通，也可能有旁支或小路相連；因此若某條重要路徑失效，細胞通常不會立刻死亡，而會互補保持一種動態的穩定狀況。

◆ Metabolic Pathways (網路版代謝路徑，可以找到部分主要代謝反應)

7.1.2

異化代謝途徑鳥瞰：

以生物分子而言，異化代謝路徑可分成三個層次，有計畫地把巨分子逐步分解，最後得到能量；其中最主要的是一條 糖解作用 (glycolysis)。

a.

Stage 1:  巨分子 (蛋白質, 多糖, 脂質) 消化成單元小分子 (胺基酸、單糖、脂肪酸)，可說就是消化作用。

b.

Stage 2:  單元小分子再分解成更小的 acetyl CoA，初步得到一部份的能量。

c.

Stage 3:  Acetyl CoA 經過氧化磷酸化反應得到大量能量，分解成 CO₂ 及水。

■ 7.1 先瞭解主要代謝路徑 (切牛排)  (六碳糖的分解: 6 3 3 2 1 碳數減少)

7.1.3

糖類中心代謝途徑：

由糖解作用到氧化磷酸化反應，是細胞最主要的一條代謝大道；學習細胞的代謝途徑，可以此為中心，其它各類大小分子的代謝都可匯入此中心。

a.

糖解作用： 把葡萄糖分解成 pyruvate → acetyl CoA (所有代謝分子的焦點)。

b.

檸檬酸循環：在粒線體中把 acetyl CoA 再分解成 CO₂，產生 NADH。

c.

氧化磷酸化反應： NADH 轉換成 ATP 並生成水。

■ 主要代謝路徑整理 (Glycolysis)  (如何獲得能量？ 分解 → 氧化)

7.2

代謝途徑中酵素的調控：

細胞如何控制代謝途徑上的各種酵素？ 可以針對酵素本身進行修飾，或者控制其基因的表現。而荷爾蒙或細胞激素，是在細胞間傳遞長短程控制指令的信息分子。

■ 細胞如何控制酵素  (各層次的調控方式不同)

7.2.1

基因表現的調控：

酵素在不同細胞內的表現量可能不同，同一細胞內的各種酵素量也不同。

a.

酵素的 生合成 受到其基因的控制 (DNA→mRNA→protein)，因此基因的開或關，或其表現程度，會影響該酵素在細胞內的量，進而影響該酵素所控制的代謝反應，是為 基因表現 (gene expression)。 一個表現中的基因，應該有大量 mRNA 轉錄出來，但有大量 mRNA 卻不一定產生大量酵素。

b.

一條代謝路徑的起始基質，可能誘導關鍵酵素基因的表現，稱為 induction；此代謝的最終產物，也可能抑制酵素表現，稱為 repression。 基因操縱子 (operon) 即是一例，乳糖能夠去除 repressor 與 lac operon 之結合，而使基因開動。

■ 7.2 基因的表現  (有許多個控制點)

7.2.2

酵素活性調節：

已在上一節詳述，再整理成共價及非共價修飾兩大類。是針對酵素分子所進行蛋白質層次的修飾調控，與上述之基因調控方式不同。

a.

非共價修飾：

使用 cAMP 或正負迴饋的 效應物 等方式，以非共價方式修飾酵素活性，此多為可逆性的調控。勿把異位脢與上述操縱子的調控方式混為一談，兩者都可被基質活化，但前者是修飾酵素本身，而後者是影響基因的表現。

b.

共價修飾：

以磷酸化或蛋白質水解的方式，來增強或降低酵素活性。 多為 cascade (梯瀑) 式的連鎖代謝反應，cascade 連鎖反應會放大 (amplify) 某條代謝路徑的活性。除了正向的以生合成增加酵素量之外，蛋白質的降解也是一項重要的調控方式，並以蛋白脢或 ubiquitin 配合 proteasome 進行降解，以除去此酵素。

7.2.3

激素調控：

細胞與細胞之間如何傳遞信息？ 這是一個極有趣而且重要的問題。

a.

荷爾蒙 (如 insulin) 傳遞 長程 生理指令，經由血液傳送並與目標細胞接觸，結合到細胞膜上的接受器 (receptor)，可引發一系列的信息傳導反應，把『啟動』的指令傳入細胞內，藉著蛋白質激脢或磷酸脢等，活化某些關鍵酵素，開始進行該細胞所預設的功能 (如分解肝糖)，以應身體所需。

b.

細胞激素 (cytokine) 則多在免疫細胞之間傳遞 短程 的信息，可刺激局部的細胞增生；也是利用信息傳導路徑，來啟動細胞內的各種生理功能。

7.2.4

細胞空間的效用：

利用酵素或基質在空間上的隔離或聚集，是一有效控制方法。

a.

胞器隔離： 真核細胞內有許多 隔間 (compartmentation)，形成其胞器的隔離空間；在胞器內可聚集較濃的特定酵素及基質，以便有效進行催化反應，或避免有害的副作用。 例如葡萄糖中心代謝途徑中，檸檬酸循環及氧化磷酸化反應是在粒線體中進行的。

b.

酵素複合體： 幾個連續反應的酵素，可組合在一起成為複合體；則某酵素的生成物，可馬上被下一個酵素用為反應物，降低擴散碰撞所需時間。 例如葡萄糖中心代謝途徑中的 pyruvate dehydrogenase (催化 pyruvate → acetyl CoA) 是由三種酵素組成的複合體。

c.

膜上酵素群： 一群連續反應的酵素，也可以一起附在細胞膜上，除了可加速反應速率外，其作用也可能與細胞膜有關。 例如 葡萄糖中心代謝途徑 中，氧化磷酸化反應酵素群 是附在粒線體的內層膜上，並利用膜內外的質子濃度差異來產生 ATP。

7.3

研究酵素及代謝的材料：

酵素材料的來源或取得，依其不同目的可有數個層次。

a.

通常我們必需純化出 均質酵素 (homogeneous enzyme)，以針對某一特定酵素進行研究，因此蛋白質純化技術在生化研究上極為重要，請複習這些純化及檢定方法。

b.

但複雜的生化反應，並非單一的純質酵素所能達成，因此可分離出某種特定細胞，或者將細胞打破所得到的 溶胞液 (cell-free lysate)，以作為研究酵素或代謝反應的材料。 動物細胞大多可以建立 細胞培養株，某些植物也可以 癒創組織 (callus) 培養細胞。 若研究需要利用特定的 胞器 (organelle)，則可由細胞的溶胞液經 超高速離心法 取得。

c.

有時需要以整個生物體 (whole organism)，或其部份器官 (organ) 來進行實驗，以便觀察巨觀的反應。 反應可能相當複雜，因此以放射線物質或用專一性抗體來追蹤是較清楚的方法。

d.

不論何種層次的研究，都要注意目標酵素是在那一個 生長時期，或是那一種 器官 內表現的。 例如：抽取檸檬酸循環的某些酵素，可以先分離出粒線體來。

e.

生物化學研究大多是以分離純化的酵素來進行研究，要小心求證所獲得的結果，是否確實為自然的生理現象，而非僅是試管中的假象。 一切觀察均得回歸整體性的細胞生理，否則難有重大意義。

◆有關酵素純化與分析方法，在生物化學實驗課程中，應該已有部分的基本操作；若要有更詳盡的技術引導，請參考研究所課程的『酵素化學實驗』。

■ 酵素純化方法的原理  (利用不同蛋白質性質間的差異)

■ 如何分離這些大大小小積木？  (以假想的例子說明純化方法)

■ 酵素純化方法整理  (各種純化方法所根據的原理)

■ 到幻燈片集成

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8

酵素在生物技術上的應用：

酵素在現代生物技術的研究或應用上，是一個非常重要的範疇。雖然基因群殖等分子生物的研究蓬勃，但基因表現的產物仍是蛋白質或酵素；另外，在基因操作所應用到的核酸剪接工具，幾乎全部是酵素。 以下列舉部份目前生物技術研究常見的一些應用，以及最近的重要發展。

8.1

酵素免疫分析法 (ELISA)︰

抗體可用來偵測其專一性抗原，而將抗體連接以酵素，可做為追蹤或定量的標幟； 通常把免疫試劑之一的抗體固定在 固定相 (solid phase)，以利沖洗分離，稱為 ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)。其應用的方式很多，下面是稱為 三明治法 的反應方式，是最直接的方法，可用來偵測樣本中的抗原量；其中抗原 (★) 為待檢樣品，須為多價抗原。

F10

圖 10   ELISA 三明治法

8.2

固定化酵素及酵素電極：

酵素經固定後有許多好處。

a.

用物理或化學方法把酵素固定到固相擔體上，比一般使用的溶態酵素有以下優點：

(1) 酵素 可回收 重複使用，較為經濟。

(2) 酵素的 穩定性 提高，可能較耐熱或極端的 pH。

(3) 固相與液相的 分離方便，使用上速度快而分離完全，有助於自動化。

(4) 許多酵素是附在細胞膜上，固定化酵素可 模擬 細胞內酵素的實際環境。

b.

利用上述酵素的固定化，把酵素固定在半透性薄膜上，連接到電極，偵測反應進行的結果 (例如 pH 的改變)，可作為酵素反應的自動化偵測工具。

8.3

蛋白質工程及人造酵素︰

以基因重組或其它方法，可以大量生產某種酵素，也能改變酵素的催化特性。

a.

分子群殖 molecular cloning：

cDNA 包含完整的蛋白質轉譯訊息，若把某蛋白的 cDNA 插在表現載体中 (如某質體)，則宿主可能表現此段轉殖基因，而生合成此蛋白質。若在此 DNA 接上另一種已知的酵素基因 (如 luciferase 或 GUS)，則表現出來的蛋白質是二者的連結體，稱為 融合蛋白質 (fusion protein)；而此酵素的活性可做為追蹤之用，稱為 reporter。

b.

蛋白質工程：

若能改變酵素活性區的胺基酸，則可能改變酵素的活性，或是其專一性。 通常先研究並預測改變其活性區某胺基酸後，可能引起的變化；再以 人工定點突變 (site-directed mutagenesis) 改變某核苷酸，然後以分子群殖操作表現該突變蛋白質。

c.

人造酵素：

酵素的活性區通常包含數個極性胺基酸，若在人造的分子骨架上，模仿活性區的幾何位置，接上這些胺基酸，則可能得到具有催化作用的人造分子。

d.

Abzyme (催化性抗體)：

若能得知酵素催化反應過程中，其基質轉換為產物的 過渡狀態 物質，以此物質或其類似物作為抗原進行免疫，則所得到的抗體，可能具有催化能力。 但其催化效率，遠不及自然酵素，通常只有千分之一的效果。 最主要原因在於酵素的催化區是一凹陷口袋，可隔離外界干擾，提供最佳環境穩定過渡狀態；而 abzyme 的結合區較淺，無法十分有效地隔離並穩定過渡狀態 (Nature 1996, 383: 23-24)。

8.4

Proteome 蛋白質體：

分子生物學革新了整個生物學的觀念，也將會改變生物化學中酵素的研究方法。

8.4.1

Genome project 基因體計畫：

二十一世紀的大事之一，是人類將可解讀出自身染色體內所有 DNA 的序列，此一大計畫即稱為 Human Genome Project，由發現 DNA double helix 之一的 J.D. Watson 所主持。 其他重要的植物或細菌，有很多也已經開始進行，甚至已經解讀完成。

◆ Genome Gateway  (Nature 人類基因體網路專欄)

8.4.2

Proteome 蛋白質體：

a.

一旦解出某種生物的染色體 DNA 序列，接著有許多工作可以進行，其中最有趣的是可以馬上把這些序列翻成將表現出來的蛋白質，如此我們就可以得知某生物細胞內可能含有的全體蛋白質，稱之為  proteome 蛋白質體。

■ Genome → Proteome  (基因座的整體蛋白質表現)

b.

生物細胞內的蛋白質體中，當然只有一部份是酵素，但由細胞內所含有的酵素種類，即可拼出該細胞可能的代謝途徑；由這些代謝途徑，就可以推出某細胞是如何運作。

c.

這種研究方式，與傳統的生物化學或生理學實在相當不同，要靠完整的資料庫與功能強大的電腦軟體，是 生物資訊學 (bioinformatics) 的主要範疇。

■ 2D 電泳 →→→ Mass 定序分析  (快速分析表現蛋白質)

◆ Functional Genomics  (Science 蛋白質體相關消息的網路專欄)

◆ 生物技術簡介  (以網路連結介紹生物技術)；也有文字說明：生物技術的發展與未來

■ 到幻燈片集成