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5

酵素的催化機制：

酵素的催化機制可以化學反應逐步推得，與分子的構造也有相當大的關係。

■ 目錄 第 5 節 酵素催化機制  (剖析汽車的引擎如何運作)

5.1

酵素活性區 (active site)︰

酵素提供基質一個穩定的空間，有利於穩定其過渡狀態，並快速轉變成為生成物。

a.

活性區： 是酵素與其基質 (或輔脢) 的結合區域，並在此進行催化反應。 活性區通常是一凹陷的袋狀構造，水分子不易進入袋中。 活性區內的胺基酸，只有那些具 反應性基團 (reactive group) 者，才直接參與催化反應；但各種胺基酸都有可能參與結合基質。

b.

酵素催化的 化學機制，通常是以下面三種基本方式進行反應：

(1) Bond strain：基質結合到酵素後，酵素的構形扭曲使基質分子內某共價鍵受力斷裂。

(2) Acid-base：利用活性區內胺基酸基團或輔脢，可以放出或接受質子 (或電子) 的特性，對基質進行質子或電子的轉送。

(3) Orientation：活性區可提供基質適當的排列空間，使有利於反應進行。

以上三種方式或可同時發生，為 協同式 (concerted set)；亦可先後依序發生，稱 順序式 (sequential mechanism)。 以下兩個重要例子都是蛋白脢。

■ 5.1 酵素基本反應機制  (有三個基本動作)

▲ 

5.2

協同式催化機制︰

以 carboxypeptidase A (CPA, 羧肽脢) 為模型酵素說明之 (圖 3)。

a.

CPA 的分子量 34 kD，含 307 個胺基酸，有一雙硫鍵，及一個鋅離子，是一種 金屬蛋白。 CPA 可由胜汰的 C-端，依序切下外側胺基酸 (外切脢)，當胺基酸的 R 基團為非極性者，較有利反應進行；而 carboxypeptidase B (CPB) 只切 C-端為 Lys 或 Arg 者，二者專一性不同。

b.

CPA 的詳細催化機制如 圖 3 所示，並加說明於下：

(1) Zn²⁺ 離子乃重要輔助因子，可吸住基質胜肽鍵上的 carbonyl 基，增強其極性，使 (2) 碳帶正電。

(3) Glu 270 吸住水分子，放出 OH^- 攻擊 C⁺ (2)，產生新的 C-OH 鍵。

(4) Tyr 248-OH 上的質子，與氮 lone pair 電子產生新鍵，原來的胜鍵斷裂。

(5) 附近的胺基酸與基質 C-端的 R 基團，有專一性的結合，以辨別基質的極性；同時 Arg 145 與基質 C-端的 -COOH 結合，確定基質蛋白質是以 C-端進入活性區。

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圖 3  Carboxypeptidase A 的催化機制  (動畫)

■ Carboxypeptidase A 機制  (五個步驟一起發生：協同式)

▲ 

5.3

順序式催化機制︰

以 chymotrypsin (CT, 胰凝乳蛋白脢) 為代表，請找出課本的相關圖片。

a.

分子構造： CT 的分子量為 25 kD，含三條胜肽，由兩個雙硫鍵連接，是 轉譯後修飾 的產物；剛轉譯出來的完整胜肽鏈沒有活性，要在接近 N-端的 Arg 15 與 Ile 16 之間先斷開後，CT 才能活化。

b.

催化活性： CT 可水解胜肽鏈上面的芳香族胺基酸 (Tyr, Phe, Trp) 或 Met (具較大非極性基團者)，切開這些胺基酸 C-側的胜鍵，是一種 內切脢。

c.

活性區： CT 大部分的極性胺基酸都露在分子外表，只有三個在活性區內，對催化反應扮重要角色 (Ser 195, His 57, Asp 102)。三者以『電荷接力』形成 高反應性 Ser：其 Ser 195-OH 基上的 H⁺ 被鄰近的 His 57 吸收，生成具有高反應性的 -O^-。

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圖 4  Ser 蛋白脢催化區上由三個胺基酸所構成的電荷接力 (動畫)

■ Cymotrypsin 活性區  (催化鐵三角)

■ pI 與環境 pH 的關係  (pH 會影響分子的帶電性質)

◆ Bonding and Protein Structure (以 chymotrypsin 說明分子的鍵結力量，需 Chime)

d.

催化機制： Ser 上的高反應性 -O ^- 會攻擊基質胜肽上的 carbonyl 碳 (帶微正電)，形成新的 C-O 鍵 (acylation 步驟)，同時斷開基質的胜鍵，先釋出一段 C-側的胜肽；然後加水分解，破壞此 C-O 鍵 (deacylation 步驟)，釋出另一段 N-側胜肽。以上兩個步驟，依次順序發生。

■ Chymotrypsin 的催化機制  (以動畫圖解上述的催化機制)

e.

穩定過渡狀態： 除了 catalytic triad 可以有效催化之外，活性區也可以穩定催化反應的中間過渡狀態；過渡狀態有相當高的負電荷，因此以活性區附近的 Gly 193 及 Ser 195 本身的 -N-H 與之產生氫鍵而中和之。

f.

Ser 蛋白脢家族： 這種以 Ser 為催化主力的蛋白脢很多，統稱為 Serine 型蛋白脢；除了 chymotrypsin 外，尚有許多如 trypsin (胰蛋白脢)、elastase (彈性蛋白脢)。它們的催化機制相似，立體構形相當類似，且都有 [Ser-His-Asp] 接力形式的催化機構。 但對基質的專一性不同，trypsin 的基質為鹼性胺基酸 (Lys, Arg)，elastase  則只切 R 基團較小且不帶電荷者。

◆ Chymotrypsin  (Stryer Biochemistry 試用網路版 Fig 9.6，僅供 Netscape + Chime)

▲  

5.4

酵素的專一性：

酵素只與特定的基質結合，有很高的專一性，這是酵素重要特性之一。

5.4.1

專一性結合區：

大部份酵素的活性區即有專一性辨識與結合基質能力，但 CT 另有一基質的辨識區位在其活性區附近。

a.

上述各 Ser 型蛋白脢的活性區除了有 [Ser-His-Asp] 催化中心外，附近還有一個袋狀的基質結合區，可以辨別基質的種類 (驗明正身)，以便與正確的基質胺基酸結合。

b.

這種專一性結合是靠結合區上胺基酸 R 基團的 形狀、大小、極性 或 電荷 等性質的契合，以 二級鍵 結合。 例如 chymotrypsin 的結合區中多含非極性的胺基酸，故只能與非極性的芳香族胺基酸結合，催化這類胺基酸的水解。改變結合區的重要胺基酸，即可改變專一性 (Science, 1992, 255: 1249)。

■ 專一性的形成  (Trypsin 一族 Ser protease)

5.4.2

專一性結合力量：

有兩大類構成因素，一種是形狀的互補，另一種是吸引力量。

a.

分子間的 構形互補： 有如『鎖頭與鑰匙 lock & key』在形狀上的契合；但蛋白質分子較有彈性，與基質結合後可誘導生成更契合的構形，稱為 induced fit。造成這種構形互補的主要力量是 凡得瓦爾力，如 圖 5 中 A 與 B 兩分子間的契合。

F5

圖 5  構形互補

■ van der Waal force  (由點成面：兩個互補的面 A, B)

b.

酵素與基質間會產生 吸引力量，是由兩者間的若干二級鍵所共同組成。

■ 專一性結合力量：有兩大類  (如何造成？ 演化的力量)

■ 親和層析法的作用機理  (如釣魚般地進行實驗)

5.4.3

立體專一性：

酵素分子如何辨認立體異構物？ 碳原子的原子軌道 是根本原因。

a.

酵素可辨認基質的 立體不對稱性，只能對某一種立體異構物有催化反應 (如 L 或 D 型胺基酸之一)，而生成物也只有對應立體異構物之一。

b.

如圖 6 把基質分子中 不對稱碳 (sp³) 四個鍵結中的一點 (A) 固定，再以酵素的專一性結合面接觸並確認 B-C-D 三點，就能分辨另一異構物的差異 (可能是 B-D-C) 而排斥之 (如 圖 7，從 A 點向下看即可分出差異)。

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圖 6  碳原子四面體

圖 7  不對稱碳鍵結排列的差異

■ 立體專一性  (碳原子的 sp³ 軌道是立體關鍵)

■ 到幻燈片集成

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6

酵素活性的調節：

酵素活性的調節，對細胞生理是極為重要的，因為細胞並不一定期望某酵素一直保持在活性狀態。對酵素分子的共價或非共價性修飾，其調節活性的效果最為直接而迅速；有些是可逆反應，也有部分是不可逆。以下面四種方式，加上抑制劑的使用，細胞就可以自由控制酵素活性的高低。

■ 目錄 第 6 節 酵素的調節  (教你如何開車及控制方向盤)

F8

圖 8  酵素活性的調節控制方式 (上面的數字代表各說明章節) 

■ 五種酵素活性的調節機制  (抑制 裂解 磷酸化 小分子調控 迴饋控制) 

▲ 

6.1

蛋白質裂解：

不只是酵素，很多蛋白質都是利用降解來調節其活性或功能。

6.1.1

脢原或前驅體：

以蛋白質的裂解來調節酵素活性，該酵素在裂解後得以活化；也可以把完成任務後的蛋白質分解掉，以免繼續進行著生理作用。

a.

許多酵素 (或蛋白質) 剛由 mRNA 轉譯成蛋白質時，分子量較大而不具活性，稱為 脢原 (zymogen)；在蛋白質則稱 前驅體 (precursor)。 脢原或前驅體再經蛋白脢切開，或除去部分胜肽，才能成為具有活性的分子。 請研究下面數例，注意 胰島素及腦啡是荷爾蒙而非酵素，而打有 * 號者乃表示具有活性者。

cascade

(1) 凝血脢： Prothrombin → Thrombin* → (凝血反應)

凝血機制 凝血對生物體是一件很嚴重的事，因為血液不能在血管內任意凝固。因此細胞對誘發凝血的過程，控制得非常嚴格，是以一種叫做『梯瀑 cascade』的方式，把一個信息慢慢放大；而在放大過程中，有許多管制點，可避免因假警報誤導致凝血。上面的凝血脢生成是最後一步，凝血脢可以馬上誘發凝血。

(2) 胰島素： Preproinsulin → Proinsulin → Insulin*

轉譯後的 preproinsulin 先摺疊好以後，切除 N-端的一段胜肽成為 proinsulin，然後再切除中央一段 C 胜肽後，才會有活性。

(3) 腦啡： 

先合成一長條八元體的前驅體，再以一種類似 trypsin 的蛋白脢裂解成單位腦啡，因此其產生也受到蛋白脢的控制。

b.

許多破壞性酵素 (如蛋白脢) 先以脢原形式合成出來，以免在到達作用目標前破壞其它蛋白質；也有以胞器或細胞膜隔離者，稱 區隔化 (compartmentation)。

 Chymotrypsinogen → π-Chymotrypsin* → α-Chymotrypsin* 

Chymotrypsinogen 分子的斷裂會使其構形改變，露出新的 N-端 Ile 16，這個新的 -NH₃⁺ 會吸引 Asp 194 的酸基，進而固定隔壁的 Ser 195，使其就定位，並因此打開專一性結合區，轉變成為活性型。

■ Protein degradation 例子  (不可逆的共價性修飾)

c.

這種脢原裂解的活化方式是不可逆的，因為被切掉的片段無法接回；因此細胞以 抑制劑 (inhibitor) 來控制此類酵素。Trypsin 及其抑制劑為一範例，trypsin 被切開活化之後，只能用其專一性抑制劑去控制。

■ Protein degradation  (很複雜的調控機制)

6.1.2

蛋白脢：

越來越多的研究發現，蛋白脢在細胞內具有重要的生理功能。

a.

依催化機制可分成四類： (1) 金屬蛋白脢 (2) Serine 蛋白脢 (3) Cysteine (或 Thio) 蛋白脢 (4) Aspartyl (或 Acid) 蛋白脢。

■ 蛋白脢種類 (以活性中心分類)  (Metal, Ser, Cys, Asp 四大類)

b.

同一族的蛋白脢序列都具有類似的胺基酸序列及構形，尤其在活性區的保守性胺基酸幾乎絕對不會改變 (如 Ser 蛋白脢的 catalytic triad)；其它序列則因 趨異演化 而衍生出許多具有不同專一性的蛋白脢。 與蛋白脢構造完全無關的 acetylcholinesterase，則因 趨同演化 而具有類似 catalytic triad 的 ester 水解能力。

■ Genetically engineered subtilsins  (Triad 各胺基酸的重要性)

■ Molecular evolution 分子演化  (AchE vs Ser protease)

c.

類似核酸的 intron 與 exon，蛋白質也有自我剪接的現象，稱 intein 與 extein，是轉譯後的修飾作用；但此現象並不是很普遍。

■ Intein & extein  (Intein 被切除後再把 extein 相連接)

6.1.3

Ubiquitin-Proteasome 降解路徑：

細胞內蛋白質的降解，可能是一種調節性的生理作用；最近發現很多蛋白質，都要先標上 ubiquitin後，才以 proteasome 來進行降解。

a.

Ubiquitin (泛素)：

廣泛分布在動植物細胞中，同質性高而分子量小，可以連到目標蛋白質分子的 Lys 胺基，作為被降解的標記 (ubiquitination)。目標蛋白質的胺基酸序列上，通常在近 N-端有一定 信號序列 (destruction box)。

b.

Proteasome (蛋白脢體)：

是由很多較小單位分子所組成的巨大分子，主體看來像是四個甜甜圈疊在一起，中央的孔洞可以容納目標蛋白質，並將其分解成胜肽片段；目標蛋白質都要先標有 ubiquitin，水解後 ubiquitin 可以回收再次使用。

◆ Ubiquitin and the Biology of the Cell  (1998 年出版的大全集)

◆ Goldberg AL et al (2001) The Cellular Chamber of Doom. Scientific American 284(1): 56-61

▲ 

6.2

磷酸化 (phosphorylation)：

磷酸化是非常廣泛且多樣的蛋白質修飾方式，在信息傳導上極為重要；越來越多的重要生理現象，被發現是與蛋白質的磷酸化有關。而 肝糖磷解脢 (glycogen phosphorylase, GP) 是磷酸化調控的典型例子，請仔細研究之。

■ 血糖濃度的調節  (小心維持一穩定血糖濃度)

a.

蛋白質分子上某些胺基酸 (如 Ser, Thr, Tyr) 的 -OH 基團會被 蛋白質激脢 (protein kinase) 修飾，在其分子加上磷酸而致活化，此磷酸可再被 蛋白質磷酸脢 (protein phosphatase) 去掉而失活；但亦有相反的例子。

■ 磷酸化為可逆性共價修飾  (三種胺基酸可磷酸化 Ser, Thr, Tyr)

■ 肝醣磷解脢 GP (共價部份)  (GP 自身也被磷酸化)

b.

蛋白質經磷酸化加上一個強負電基團，影響附近胜肽鏈的排列，造成蛋白質構形改變，而使活性升高或降低。 除了磷酸化之外，蛋白質也可以接上 核苷酸 達到活化。

c.

最近發現有些磷酸化蛋白質也會進入上述 ubiquitin-proteasome 路徑，引發該蛋白質的降解，以達調節目的。

▲ 

6.3

非共價結合之信息傳導分子：

主要代表分子是 cAMP 及 calmodulin，都是信息傳導途徑的重要媒介，與上述的磷酸化反應共同合作，組成有效的細胞調節網路。

6.3.1

cAMP：

蛋白質激脢 之活性受到 cAMP 調節，原不具活性的激脢與 cAMP 結合後，會釋出活化型的蛋白質激脢。下圖說明蛋白質激脢的活化方式。

 (◎ catalytic subunit; ☉ regulatory subunit; ♁ = ☉ + cAMP) 

                       + 4 cAMP

        [☉☉◎◎] ────→  ♁♁  +  ◎◎^*  ← 具有活性的蛋白質激脢

         沒有活性                            ↓

☉☉  +  4 cAMP

6.3.2

Calmodulin (攜鈣素)：

當細胞內的鈣離子濃度改變時，會誘導許多生理反應，而 calmodulin 即為細胞內鈣濃度的感應與作用分子； 它的分子 (17 kD) 上有四個鈣離子結合位置，與鈣結合後會誘導其分子構形的改變，可與目標蛋白質結合，調節後者的活性。

6.3.3

信息傳導路徑：

當荷爾蒙或細胞激素等胞外信息分子到達目標細胞，與胞膜上的專一性受體結合後，就會引發該細胞的一連串反應，把胞外信息帶入細胞內，以啟動所要的生理反應。細胞內的這些反應，相當複雜而有效，統稱為 信息傳導；由上面所述的磷酸化及 cAMP 等小分子為主軸，加上目標酵素的活化，可分成幾個層次，各層次由許多模組所構成。

下面整理出這幾個層次，並且舉出一個對應例。

 Signal → Receptor → Transducer → Effector enzyme → Effector → Effect 

對應的分子如下例：

 Glucagon → Receptor → G-protein → Adenylate cyclase → cAMP → Kinase

■ 信息傳導的上中下游整理  (1) 放大效果 (2) 彈性組合;  梯瀑

◆ Signal Pathways: Response and Recovery  (Stryer 生化課本 的動畫教材)

◆ Signal Transduction Knowledge Environment  (Science 的信息傳導網路專欄)

這種傳導途徑有兩個特點，是細胞生理極為重要的手段：

a.

放大作用 (amplification)：

上述一層一層的傳導過程中，有些是酵素 (如 cyclase, kinase)；而一個酵素分子若經活化，代表著將有大量的基質會被催化成生成物，而生成物會再傳導給下一步反應，信息因此而被放大。這種方式，非常像真空管的電流放大作用，也是上述 cascade 梯瀑式放大的一種。

b.

彈性模組 (flexibility)：

信息傳導的每一步代表一個層次，而每個層次可由各種模組所組成，因此可以有不同彈性組合，以因應不同細胞的種種需要。

▲ 

6.4

異位脢 (allosteric enzyme)：

有些酵素的活性，會被它下游的產物所調節，是為 迴饋控制 (feedback) 現象；這類酵素的分子上，除了有活性區可與其基質結合外，還有可與其下游產物結合的位置，稱為 調節區 (regulatory site)，這種酵素則稱為 異位脢。

6.4.1

Aspartate transcarbamoylase (ATCase)：

ATCase 是典型的異位脢。

■ 異位脢 ATCase  (催化次體 C 的構形變動) 

a.

迴饋控制： ATCase 催化 aspartate 與 carbamoyl-P 連結成 carbamoyl aspartate 的反應，後者經代謝後生成 CTP； CTP 則回頭與 ATCase 上的 調節區 結合，反而抑制 ATCase 的活性 (負迴饋)。 由於 ATCase 是這個反應鏈的起始酵素，控制 ATCase 即可控制整條代謝路徑。

b.

四級構造： ATCase 是由兩組 催化次體 (catalytic subunit, CCC) 以及三組 調節次體 (regulatory subunits, RR) 組成；每組催化次體由三條蛋白質組成 (C, 34 kD)，每組調節次體由兩條蛋白質組成 (R, 17 kD)：

  2 × (CCC) ＋ 3 × (RR) ＝ C₆R₆ 

每調節次體有一 效應物結合區，每催化次體有一 基質結合區。

■ 異位脢的迴饋控制  (ATCase 異位調控的性質整理) 

c.

S 型曲線： ATCase 的動力學結果顯示，以 v_o 對基質 [Asp] 濃度直接作圖，可得到一 S 型曲線 (sigmoidal curve)，而非典型的 M-M 單股雙曲線 (見 圖 9)。 這是 合作式 (cooperative) 的 協力現象，表示基質與酵素之任何一個次體結合後，可誘導改變酵素的分子構形，促進其它次體與基質間的結合能力 (positive homotropic effect)。

■ 基質控制酵素活性 (分子開關)  (察覺環境的基質濃度 → On/Off) 

d.

分子開關： 此 S 曲線有一轉折點，基質在達到這個基質濃度後，酵素反應速率急速上升。 可以將此轉折點看做酵素對其環境基質濃度的 感應點，當基質濃度低於轉折點時酵素不太活動；而達到轉折點時，酵素便很快起動達到 V_max (圖 9 下圖誇張為虛線，以突顯此轉折點)。

e.

協力現象： 若反應加入 CTP，則 圖 9 上圖的 S 型曲線下移 (但 V_max 不變)，表示 CTP 會降低 ATCase 的活性 (negative heterotropic)； 而 ATP 則反可增強 ATCase 活性 (positive heterotropic)，但原 S 型曲線則變成一般的 M-M 雙曲線，協力現象消失。

F9

圖 9  異位脢的動力學表現

f.

效應物： ATP 與 CTP 均可影響此異位脢的活性，二者都是其代謝上的相關產物，稱為 效應物 (effector)； 兩者在構造上與基質 Asp 均不相像，故並非活性區的競爭者，而是結合在分子的其他位置 (異位調節區)，結合後會影響酵素的分子構形，使酵素與基質的親和力下降，因而降低活性；而 ATP 與 CTP 乃互相競爭此一調節區。

■ 定義各種異位調節的名詞  (勿混淆 inhibitor) 

■ 血液中氧分子的運送 (四元體 Hb 具有辨別能力的分子) 

◆ Lehninger Biochemistry in 3D 請點選 Oxygen Binding Proteins (非常精彩的說明，要 Chime)  

6.4.2

異位脢的作用模型：

當異位脢受到效應物的影響時，其分子可能會有不同的反應行為。

a.

異位作用： 基質 (或效應物) 與異位脢的一個次體結合後，會使原來的 T (tense) 型次體，變成較易接受基質的 R (relaxed) 型，然後繼續影響其他次體的結合能力，有兩種方式︰

(1) Concerted 協同式： 酵素分子的每個次體，在結合前後一起呈現 T 或 R 型，保持著對稱性；若酵素為二元體，則為 RR 或 TT，而無 RT 型。 效應物的結合也是同樣情形，抑制劑會使酵素固定在 TT 型，活化劑使成為 RR 型；此二者同時都失去協力現象。

(2) Sequential 順序式： 酵素的每個次體各自與基質 (或效應物) 結合後，個別由 T 型轉成 R 型，並不影響其他次體的構形 (仍為 T 型)，但對其他次體與基質的親和力，可能有正或負影響。 依基質加入順序，分子構形變化為 TT → RT → RR。

b.

兩種效應方式： 基質與異位脢的結合，通常是協同式；一個次體與基質結合後，誘導所有次體都轉成 R型，使其他次體的活性區更易接受基質。如此影響其他次體上同種結合區者 (活性區→活性區) 稱 homotropic (同質效應)。 而效應物與異位脢的結合多為順序式，且會影響其他次體與基質的結合能力；此種不同種結合區之間相互影響 (調節區→活性區) 則稱為 heterotropic (異質效應)。

■ 異位脢的各種作用模式  (整理 homotropic, activator 等) 

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