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目錄 第 5 節 酵素催化機制

酵素動力學是以實驗加上數學演算的方式，來說明酵素的作用與性質；至於酵素的催化機制，則以各種實驗觀察來推想酵素是如何催化的。可以說是把酵素的催化動作，以慢動作一步一步分解，說明它的化學反應機制。

我們先把酵素的催化機制，整理成為數種基本形式 (5.1)；並且舉出兩大類研究得最清楚的蛋白脢，仔細說明其反應機制 (5.2)。 尤其對屬於 Ser protease 的 chymotrypsin (5.3)，更是極重要的實例，請一定要反覆研究清楚。另外，經由探討比較 Ser protease 家族的各個蛋白脢成員，也把我們引入催化反應的專一性 (5.4)，以及分子演化的領域 (6.1)。

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5.1 酵素基本反應機制

通常酵素的催化反應是要經過數個步驟來完成的，歸納酵素的各種反應，可以整理出以上三種基本動作；由這三個基本動作，可以組合成各種不同酵素的反應來。而這些選取的動作，可以是同時發生的 (協同式)，也可以是一個一個接續發生的 (順序式)。

協同式催化的代表酵素是 carboxypeptidase (CP) 家族，而順序式的代表是 chymotrypsin (或 trypsin) 家族；全都是蛋白脢。 因為是協同發生的，因此 CP 的催化機制只要用一張圖片就可以完全說明 (下圖)，但 chymotrypsin 則像連環圖畫一樣，要用六張圖片說明它的連續性反應方式 (請見任何一本課本)。 我們也可以說協同式乃反應較為單純的外切脢，只要由蛋白質的一端開始，一個一個切下胺基酸；而順序式則屬較為複雜的內切脢，才能把蛋白質從中間切開來。

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Carboxypeptidase A 機制

請看本文中的說明。

(1) Zn²⁺ 離子乃重要輔助因子，可吸住基質胜肽鍵上的 carbonyl 基，增強其極性，使 (2) 碳帶正電。

(3) Glu 270 吸住水分子，放出 OH^- 攻擊 C⁺ (2)，產生新的 C-OH 鍵。

(4) Tyr 248-OH 上的質子，與氮 lone pair 電子產生新鍵，原來的胜鍵斷裂。

(5) 附近的胺基酸與基質 C-端的 R 基團，有專一性的結合，以辨別基質的極性；同時 Arg 145 與基質 C-端的 -COOH 結合，確定基質蛋白質是以 C-端進入活性區。

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E504

Cymotrypsin 活性區

Chymotrypsin 屬於 Ser protease，是一類極為特殊的酵素，也是演化上極為成功的催化例子；其特點在於利用很平常的一般胺基酸基團，即可以組合出相當強的反應基團，這全靠它的催化鐵三角 (catalytic triad)。

Catalytic triad 因為相鄰三個胺基酸基團的互相吸引，使 Ser 195 上的 -OH 質子被 His 57 搶走，而成為具有超強反應性的 -O ^-。此 -O ^- 攻擊目標蛋白質胜肽鍵上的碳 (carbonyl C⁺)，開始了順序式的胜肽鍵水解催化機制。

在課堂上我們將循著上面這張整理大綱，一一說明 chymotrypsin 的性質：

(1) 如何佈置催化鐵三角，以及環境 pH 及修飾劑對活性區的影響

(2) 詳細的催化機制，可分成兩大步驟，依序進行切開胜肽鍵的反應

(3) 如何穩定中間過渡產物，還是與活性區附近的胺基酸有關

(4) 如何辨別其基質上的胺基酸基團，以便專一性地水解之

有關 chymotrypsin 酵素催化機制方面的研究，在早期的生物化學上，是一段精彩而極有趣的故事，可以給我們在酵素化學的研究工作很多啟示；有一本由 Scientific American Library 出版的通俗科學書籍 Discovering enzymes (by D. Dressler & H. Potter, 1991)，給了極詳細且有趣的解說。

■ Chymotrypsin 的催化機制  (以動畫圖解上述的催化機制)

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E505

pI 與環境 pH 的關係

請看『細胞與分子』圖 3 之說明。

這張圖說明 chymotrypsin 的活性會受到環境 pH 的強烈影響，主要是因為其催化區的鐵三角中， His 可因 pH 的改變而改變帶電性質，使得 His 無法搶奪 Ser 上的質子，造成高反應活性的 -O^- 無法生成。

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專一性的形成 (1)

Ser 一族的蛋白脢很多，都是利用 catalytic triad 的活化型 Ser195 來進行催化反應的，因此其催化機制都相同，但它們在蛋白質上所辨別的胺基酸種類不同；這是因為每種 Ser protease 分子上，除了 catalytic triad 外，都還有一個基質辨認區，可以專一性地與所嗜好的胺基酸基團結合。

因為有如此的異同點 (催化機制相同，基質辨別區不同)，因此有人改變了一個蛋白脢的專一性結合區 (chymotrypsin)，而得到具有另一種專一性的蛋白脢 (trypsin)。

蛋白脢有很多屬於蛋白質類的抑制劑，此種抑制劑也會與蛋白脢結合，而蛋白脢雖然可以水解此抑制劑，但被切開的抑制劑會留在蛋白脢上，形成極強的鍵結，因此抑制了蛋白脢的催化活性。 例如 trypsin 有很多來源不同的抑制劑，在卵白中有一種稱為 CHOM 的蛋白質，對 trypsin 具有專一性的抑制與結合作用。

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專一性結合力量：有兩大類

有 兩大類的力量造就了兩個蛋白質之間的專一性親和力：(a) 其一為兩個蛋白質之間構形上的互補，可以像積木一樣互相契合；(b) 另一為兩個分子接面之間，所配對成的一些微弱二級鍵吸引力。 兩者的結合力量大小，可以用解離常數來表示，一般解離常數至少在 10^-6 以上才算有足夠的親和力 (也就是說一百萬對結合分子中，只有一對會解離開來)。

為何兩個蛋白質之間的互補構形，可以生成許多凡得瓦爾鍵而互相吸引 (a)，請見後面的圖解。

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E508

Van der Waal force

凡得瓦爾力是分子間微弱且短暫的吸引力，多發生在非極性的分子間；雖然極性分子之間也有凡得瓦爾吸引力，但其重要性不若其它二級鍵。

繞在原子最外圍的電子依一定的軌道運轉，而此電子在軌道球體上的分佈通常是均勻的。當兩個原子漸漸接近時，這兩個原子上的電子會相互影響其分佈情形；若其中一個原子的電子分佈非常短暫地發生不均勻現象，則會導致短暫的偶極性產生 (d⁺．d^-)，而這短暫的偶極性馬上誘導另一個原子上的電子，也產生電子分佈不均的現象，但接觸面的偶極剛好相反 (d⁺．d^-)_a ...(d⁺．d^-)_b。這兩個相反的偶極，便可以產生極微弱且短暫的吸引力，即稱為凡得瓦爾力。

凡得瓦爾力的存在太短暫，因此很容易散掉；為達致最大的凡得瓦爾力，兩個原子核之間，要保持在最適距離；太近則因電子相斥而減弱，太遠則電子間的吸引力又不夠。這個最適距離，即為該原子的凡得瓦爾半徑。

因為凡得瓦爾力實在很弱，因此要集合數十個凡得瓦爾力才能發揮作用。兩個巨分子間的接面，若其上的對應原子們，每一對都能保持在凡得瓦爾半徑上，則此二巨分子便可產生相當強的親和力量；這只有當兩個巨分子間的接觸面，剛好成為積木般的互補形狀時，才能達成。這種巨分子間的親和力，造就了非常多的細胞生理特性與功能，極為重要。

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E509

親和層析法的作用機理

親和層析法是利用兩個分子 (A, B) 之間的專一性吸引力，把其中之一 (A) 先固定到一固相擔體上 (solid support)；當含有目標 (B) 的樣本通過此一親和性吸著劑時，A 會吸附 B 而洗掉雜質 (圓圈狀)，然後再把純的 B 由固相擔體上流洗下來，即可得純質 B。

親和層析法有點像釣魚，其中的 A 是餌而 B 是魚；若 A 與 B 之間的親和力夠強，就可以保證釣得到。

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立體專一性

碳原子有四個外層電子，因此可以 sp³ 軌道與四個原子鍵結，例如上左圖中央 sp³ 軌道的碳原子可與 A, B, C, D 四個原子結合。這種電子軌域至少造就了兩件事實： (1) 碳原子可以與另外四個原子鍵結，其中最常見的是與另一個碳結合，這是有機化學的根本；(2) 碳原子不但鍵結的原子數目多，而且當周圍的原子或基團都不一樣時，中心的碳原子就會成為不對稱碳，便會產生立體異構物。

立體異構物是兩個或多個分子間，其分子式完全相同，但立體排列不同的分子。 如上右圖的兩個分子，由上面的 A 看下去，雖然都是 B, C, D，但是可能有兩種不同的排法 (順時鐘或逆時鐘)，這兩種分子在立體空間上的排列不同，兩者無法重疊在一起。這兩個立體異構物事實上互為鏡像，特稱為鏡像異構物。

最常見具有立體異構物的分子是胺基酸，其分子上的 a 碳就是一個不對稱碳；因此除了甘胺酸外，所有的胺基酸都可有 D-, L- 兩種異構物，自然界大多只用 L-胺基酸。酵素也會辨別此二種分子的不同，而大多只利用其中之一。

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