E301

目錄 第 3 節 酵素動力學

酵素 的主要作用是催化基質的轉換，因此若我們改變基質的濃度，再來觀察酵素活性的變化情形，則可得知酵素與基質間的一些關係，此即酵素動力學 (第三節)。 此種觀察也可以加入抑制劑，看抑制劑如何影響酵素與基質間的作用關係 (第四節)。接著，我們解釋酵素對基質的催化機制是如何進行的，可以完全以有機化學的反應機制來說明之 (第五節)。

若把酵素看成一部汽車，我們先以命名法稱呼汽車的名字 (酵素的命名)，再大體看這部車子的組成 (酵素的構成)，然後知道其馬力等動力學性質 (酵素動力學)，並且要檢查煞車情形 (酵素的抑制)，更仔細檢查其引擎的運作機制 (酵素的催化機制)，以及駕駛或控制此汽車的方法 (酵素活性調節)。一切都完備之後，汽車就要上路，在代謝的大馬路上馳騁 (細胞代謝與酵素調控)，並且發現此汽車可以帶我們完成很多應用 (最後一節)。

第三節 酵素動力學

3.1 小節先介紹酵素催化反應的一些基本觀念，最重要的是酵素 [E] 如何與其基質 [S] 結合，結合之後 [ES] 如何被催化而反應，這將是以下所有的酵素性質與行為的基礎與根本。 3.2 小節緊接著圍繞著 [ES] 推導出酵素動力學，以 Michaelis-Menten 公式說明酵素的催化特性與行為，並求得該酵素最重要的兩個性質參數：V_max 及 K_m。 接著 3.3 小節簡要說明多基質、多生成物的催化形式，發現與單基質、單生成物反應的機制差不多。

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E302

何為動力學？

既然叫做動力學，我們就用火箭升空做為例子。若火箭的升空高度是與所加的火藥包成正比，則火藥包加越多，火箭升得越高 (如加 1~3 包)。但是到某一高度後，再加火藥包也只能提高一點點高度 (如 4 包以上)，火箭已經到達其升空能力的飽和。

同樣的，酵素的活性是其工作的效率表現，但此效率的高低是與所外加的基質濃度成正比 (如 1~3)；但基質高到某一程度後 (4 以上)，活性也無法再大幅提升。這種以加入基質濃度的多寡，來看酵素活性大小及表現的研究方法，稱之為酵素動力學。

酵素動力學所得到的結果，其實不僅僅是要看火箭升空的最高高度有多少 (V_max)，還可以看火藥包的品質如何，即酵素與基質之間的親和力 (K_m)。

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E303

3.1 酵素的催化反應

一般催化劑的主要功能是提供一個表面空間，讓反應物在上面進行反應，而此表面可以提供一空間上的便利，使得反應物更容易轉變成生成物。在反應物轉變成生成物的過程中，會有一介於兩者之間的中間過渡狀態，是整個催化反應最難達致的步驟，通常此一催化空間可以使得此過渡狀態更為穩定，更容易形成。

酵素也是一樣，酵素的活性區是提供一個催化口袋，此口袋可以穩定中間過渡狀態的形成。也就是說，酵素可以使此過渡狀態比較容易形成，所需要的能量 (活化能) 比較低。

但請注意，單是有一個催化表面是不夠的，以下催化性抗體 (abzyme) 的例子可以說明此一問題所在。

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E304

Abzyme 催化性抗體

抗體可以專一性的與其抗原結合，這種方式很像酵素與其基質的結合：那麼酵素可以催化生成物的生成，抗體可否也用來模擬酵素的催化作用？ 如此一來，我們就可以設計自己所要的反應，誘生 催化性抗體 abzyme 來進行指定的酵素反應；這是酵素學者的美麗夢想。

又因為酵素是穩定催化反應中的過渡狀態，因此若要誘導催化性抗體的產生，就應該使用該反應的過渡狀態為抗原，來進行免疫反應。以水解胜肽鍵的反應為例，peptide bond 平面上的 -C-N- 碳原子，本來是以 sp² 電子軌道與氮原子鍵結的；當 peptide bond 水解時，此 sp² 碳先受到水分子的攻擊，多了一個 C-OH 新鍵，變成 sp³ 的中間過渡狀態，因此就以類似此 sp³ 過渡狀態的磷酸類似物做為免疫抗原。 [Sci Am March: 43, 1988]

很不幸的，這樣得到的催化性抗體，其催化能力都不是很高，其催化只能提高一千倍的水解能力，不太像是酵素的催化動作。有一個實驗，利用白蛋白 albumin 的表面，即可模擬上述催化性抗體的水解作用，可知道事實上這種催化性抗體的作用並不太大。 [Nature 383: 23, 1996]

原因在哪裡？ 主要是因為抗原-抗體間的結合，是相當表淺的接觸；雖然這樣已經足夠作為免疫的確認之用，但在酵素催化上卻有所不足。酵素的催化反應，事實上比單純的抗原-抗體結合要複雜得多，牽涉到許多電子的轉移與空間的扭動。因此，酵素活性區多深埋在分子裡面，多數是形成一個口袋式的結合區，以避開環境中水分子的干擾，並且使得基質或過渡狀態能與活性區有更密切的結合，而不只是表淺的接觸而已。

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E305

3.1 酵素活性區 (魔術口袋)

酵素活性區像一個魔術口袋，把反應物放進去後，就可以變成生成物出來。當然我們已經知道，這個口袋可以降低反應中間物的活化能，但它是如何做到的呢？ 本圖解提出四個可能的機制。

(1) 過渡狀態分子的構造中，經常都有相當高的局部電荷，而催化口袋內的適當位置上，剛好佈置有可以中和掉此局部高電荷的基團，因而得以穩定過渡狀態。

(2) 在水溶液中，許多離子間的鍵結或反應都會被水分子干擾，因此凹陷的催化口袋可以隔離大多數水分子，使得離子間的反應順利進行。

(3) 在活性區內的胺基酸基團，有些可以因為特別的空間排列，而使得原本反應性低的基團 (例如 Ser-OH)，因為附近其他基團的影響 (如 His 可奪取其 H⁺)，而變成具有高反應性的基團 (如 Ser-O^-)。

(4) 活性區通常也是輔脢的結合區，輔脢分子都帶有強大的電荷基團，可以直接參與反應或者輔助反應進行。

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E306

3 酵素動力學

其實學生很像是酵素，賣命讀書以得到好的考試成果，但每一個學生的讀書或考試表現都不很一樣 (如上圖甲乙丙生)。通常考試章數 (基質濃度) 越多，學生準備考試的效率會好一點 (考 1~3 章)，但若考試範圍太多 (考 4 章以上)，通常考生會應付不來，只能達到一個飽和點。

同時，若以不同章數來考學生，不同的學生就會有不同的表現，如上面每個學生的表現曲線不同；考試章數少的時候 (考 1~2 章)，乙生的表現甚至高過甲生。酵素也是如此，有些酵素的表現較佳，有些則較懶散，也各有不同的表現曲線。

講義中 把整個動力學的假設、公式推演與結論應用，以圖解的方式整理出來，以便讓同學有整體且完整的概念。

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E307

Invertase reaction 轉化脢

Michaelis 及 Menten 兩位以早期一個相當普遍的酵素 invertase (轉化脢) 作為研究對象，其催化反應如上圖所示，可以把非還原糖的蔗糖，轉化成為兩個具有還原力的單糖 (葡萄糖及果糖)。因此做實驗時，只要把蔗糖加入轉化脢後，測量所生成還原力的增高，即可得知此酵素的活性。

他們在進行實驗時，觀察到一件事實： 當酵素的量固定時，若增加基質的量，則反應速率會跟著上升；但此種上升並非沒有限制，當基質增加到某一濃度後，反應速率即不會再增加了，反應速率似乎是受限於其中的酵素分子數量。 因此，推論酵素可能要先與基質結合，才能進行催化反應。

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E308

Steady state theory 最重要基本假設

由 Michaelis 與 Menten 的觀察得到了一個想法，就是酵素 [E] 與基質 [S] 一定要先結合在一起成為 [ES]，然後才能得到生成物 [P]。因此 [ES] 的生成速度與消失速度一樣，則反應液中的 [ES] 濃度為恆定，此稱為 Steady state theory。我們的確可以在實驗中，觀察到反應溶液中有穩定濃度的 [ES]。由此引發了整個酵素動力學的基本研究。

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E309

3.2.2 四個基本觀察式

由 Steady state theory 可知催化反應進行中的 [ES] 量恆定，也就是說 [ES] 的生成量等於其消失量；而 [ES] 的生成當然是由 [E] 及 [S] 所得來的，而此反應受到常數 k₁ 的控制，因此 [ES] 的生成量等於 k₁ [E][S]。 [ES] 的消失量則有兩個方向，其一當然是變成了 [E] + [P]，受到 k₃ 的控制；因此其消失量為 k₃ [ES]。而另一個消失方式為退回去成為 [E] + [S]，即為 k₂ [ES]。若 [ES] 消失量等於生成量，則可以得到上圖 (I) 式。

另外，我們定義總酵素量 [Et] 游離的酵素 [Ef] 加上已經與基質結合的酵素 [ES]，因此可以得到 (II) 式。有時總酵素量會模糊地以 [E] 表示。

此反應整體表現出來的速率 v_o 是決定於後半段的反應，也就是說只要看 [ES] → [E] + [P]；因此 v_o 可以說是 k₃ [ES]，得到 (III) 式。

若誇張一點，把所有的酵素 [Et] 都變成 [ES] 時，將會達到想像中的最高速率 V_max，則可寫成 (IV) 式 V_max = k₃ [Et]。

我們由 [ES] 濃度恆定的假設開始，定義或推衍出上面四個基本式子，由其中的 (I) 式開始，接著可以再推導出 Michaelis-Menten 公式。請見講義中詳細的 推演過程。

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E310

動力學實驗的操作例子

上圖是進行酵素動力學的實際操作過程，所需要的設備通常相當簡單，操作方法一般也並不很困難，要看該酵素的活性分析方法而定。但由動力學實驗所得到的資料都很重要，可以得知一個酵素與其基質之間的關係，以及該酵素的最大活性，甚至可能推得酵素的作用機制。

台大生化科技系所開的 生化實驗 中，是以 trypsin 作為實驗範例，進行 Michaelis-Menten 動力學觀察。

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E311

3.2.3 M-M 公式意義 → K_m; V_max

M-M 公式的首要意義，是求得該酵素的 V_max 及 K_m，另外由 M-M 公式及其作圖，可以推出一些酵素的行為模式。

左圖說明當基質濃度的高低變化時，會影響酵素反應速率的表現行為；在低基質濃度時，催化速率會隨著基質濃度上升而增高 (一級反應)。在基質濃度極高時，基質濃度就不會影響速率了 (零級反應)。因此，若把基質濃度固定在相當高的濃度，則所表現出來的反應速率，就與反應液中所含的酵素量成正比 (右圖)。 通常我們進行酵素的活性分析時，都是在高基質濃度下進行的。

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E312

3.2.4.2 K_m: 基質親和力 (前半段)

由上面公式推導，可知我們所設定出來的 K_m 常數，居然正是要達到一半最高速率 Vmax 時的基質濃度。因此 K_m 越高，若要達到最高速率時，所添加基質的濃度也要越高，表示該基質與酵素的親和力並不是很好 (上面左下圖)。

一般酵素不可能在細胞內以最高速率進行催化反應，所以若以二分之一的最高速率進行，則此基質濃度剛好是 K_m，因此推測細胞內酵素的基質濃度可能是其 K_m。

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E313

Km: hexokinase 的三種 substrates

Hexokinase 可以催化數種六碳糖 (如 glucose, allose, mannose 等)，但三者的 K_m 相差甚大。 Hexokinase 對 glucose 及 mannose 有較大的親和力 (因 K_m 低)，而對 allose 親和力很差 (K_m 為 8,000)。檢查比對三種單糖的分子構造，發現三號碳上面 -OH 基的立體構造有很大的影響；hexokinase 偏好類似 glucose 的構形。

由此結果反推回去想像 hexokinase 的構造，可以推測 hexokinase 與基質結合的活性區，一定有相當專一的空間排列，其空間排列形狀可以與葡萄糖的形狀互補；而且對葡萄糖分子上的三號碳特別挑剔，但對二號碳則較為寬容。

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E314

3.2.4.3 Turnover number k₃ (後半段)

回來 看 M-M 公式，當基質量 [S] 極大時，K_m 可以忽略，則 v_o = V_max；代入四條基本觀察中的 (III) v_o = k₃ [ES] 以及 (IV) V_max = k₃ [Et]，可推得 [ES] = [Et]。表示當基質很大時，所有的酵素全部轉成 [ES]，在此種狀況下，酵素的反應事實上只要看後半段，即 ES → E + P，而此段反應是受到 k₃ 的控制；此時可以表現出一個酵素的最大催化能力，就特別把 k₃ 稱為 k_cat，即為 turn over number (t.o.n.)。 Turn over number 或稱為 molecular acitivity，是表示一個酵素活性的絕對指標。

若基質量遠小於 K_m 時，則可如上圖推演，得到 v_o = (k₃ /K_m) [E][S]；此時的反應速率受到 [E] 及 [S] 兩者的控制，是一種二級反應；而其常數為 k₃ /K_m，是酵素對某基質催化能力的指標 (k₃ 以及代表親和力的 K_m)，多寫為  k_cat /K_m，是描述酵素催化能力比較正確的表示方式。

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E315

3.2.4.4 酵素活性單位 (IU)

一般測定酵素活性時，是在單位時間內測定所得到生成物的量，如上圖所示。若生成物以 mmole 表示，則酵素每分鐘催化產生得到 1 mmole，稱為一個活性單位。 若活性單位再除以蛋白質的 mg 數目，即得比活性。

在一定時間內測量生成物時，要注意生成物的生成量與反應時間要成正比；要取用如上面右圖所示的直線關係部份，反應時間在 30 min 之內都可以，但反應在 40 min 以後，生成物已不成線性關係，測出來的活性將會不準 (會低估或高估？)。

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E316

3.3 雙基質反應

雙基質 反應以 hexokinase 為例，可把葡萄糖及 ATP 兩個基質催化產生 Glc-6-P 及 ADP 兩個生成物；因為有兩個基質，因此通常活性區上分別有兩個基質結合區。

所附的漫畫非常生動，而且正確地描繪出 hexokinase 的催化動作。

(酵素的漫畫造型取自 Gonick, L. & Wheelis, M. 所著 The Cartoon Guide to Genetics, 有中譯版)

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E401

酵素的抑制：可逆 vs 不可逆

蛋白質一旦被轉譯出來，若要終止其作用，可以用蛋白脢水解之；但有些酵素的活性，可以用另一個蛋白質或化合物來抑制，而不需要以水解的方式破壞掉。一般細胞內的抑制劑，都是屬於可逆性的；也就是說當抑制劑去除後，酵素得以恢復原來的活性。可逆性的抑制方式可依其抑制方式分成三類，相關的機制請見講義。

但有些外來的抑制劑，或者是人工合成的化學抑制劑，都是對酵素分子造成共價性的永久抑制，是為不可逆性的抑制。某些不可逆性的抑制劑是救人的抗生素 (如青黴素)，有些則是殺人的毒藥 (如沙林毒氣)。

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E402

酵素抑制劑在醫藥上的功用

抑制劑 在生理或醫藥上，有極重大的作用。例如我們常用的磺胺藥，即所謂的消炎粉，就是一種競爭性抑制劑；磺胺藥分子構造類似細菌的一種重要代謝物 (PABA)，因而可與催化 PABA 的酵素結合，造成其抑制。

細胞內有一大群蛋白脢，也在細胞內負責重要的生理功能；而自然界中存在著這些蛋白脢的種種抑制劑，有的是生理上有用的，有些是病理上的致病因子，有些是治療疾病的妙藥；我們將各舉一例，其中可以治療 AIDS 的蛋白脢抑制劑，是近年來醫學上的大主角。

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E403

HIV protease vs acid protease 比較

愛滋病毒 HIV (human immune deficiency virus) 侵入人體細胞之後，先把它所含的 RNA 反轉錄成為 DNA，此 DNA 可鑲到人體細胞的染色體上，或是馬上開始進行 RNA 轉錄，並轉譯成蛋白質，以便複製新病毒。

因 HIV 所轉譯成的蛋白質長鏈，是由很多病毒的酵素或外殼蛋白質所連接成的一長條原始蛋白質，要再以蛋白脢分別切出各個酵素或蛋白質，才能供病毒使用。因此，蛋白脢在病毒的生活史上非常重要，若此蛋白脢被抑制，則病毒個體就無法順利複製。使用病毒蛋白脢的抑制劑來治療愛滋病，是目前的主要療法之一。

因為 HIV 的蛋白脢是屬於一種 aspartyl protease，在其分子中含有兩個 Asp (如上圖所示)，因此要使用這類蛋白脢的抑制劑來對付 HIV。問題是人體內也有 aspartyl protease，對付 HIV 的抑制劑也會對人體有害；因此要如何找到一種只對 HIV protease 有抑制作用的藥物？ 藥物設計在目前的生物技術產業上，是一支非常重要的研究發展單位；我們可以從人類以及 HIV protease 在分子構造上的差異來下手。

雖然兩者的構造功能都很相似，但是 HIV protease 是由兩個相同的單元體所組合成的對稱性分子；而此兩個單元體，在人體細胞中則演化成一長條完整的分子，而且兩段胜肽並不完全一樣，因此是一個不對稱的分子。我們若能設計一種在分子構造上比較對稱的抑制劑，可以專一性地攻擊 HIV protease 的活性區，而人類細胞的 aspartyl protease 比較不對稱，可以避免此抑制劑的攻擊，則可用來抑制人體細胞內的愛滋病毒。

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E404

不可逆的抑制 (1)

蛋白脢不可逆性的抑制，所造成的生理影響通常都很嚴重；同時，這種抑制方式多針對蛋白脢活性區進行共價性修飾。我們將介紹第一號抗生素青黴素的抑制機制，以及化學試劑所造成的抑制作用。

通常天然抑制劑的外型多類似蛋白脢的基質；青黴素的分子構形是一條短鏈，會被細菌的一種重要酵素 (glycopeptide transpeptidase, GT) 誤以為是基質而結合，但是結合之後青黴素就利用其分子上的一個活性四元環，對 GT 產生共價性修飾，並且卡在其活性區而達成抑制。細菌的 GT 若失去活性，就無法進行細胞壁的生合成，也就無法繼續生長。

很多蛋白脢的活性區上有其重要的催化性胺基酸，例如 cysteine protease 有 Cys，serine protease 上有一個 Ser。化學性抑制劑多是屬於某種特定基團的修飾劑，可以專一性地對蛋白脢活性區上面的重要胺基酸 (如 Cys, Ser) 進行化學修飾，因此破壞蛋白脢的水解活性。抑制劑與蛋白脢之間有很好的專一性，可用來鑑定蛋白脢的種類；例如被 cysteine protease 抑制劑 PCMB 所抑制的酵素，其活性區上可能就有 Cys 胺基酸。

這些化學性抑制劑在醫療或研究上應用極多，甚至可用來做殺人毒氣；例如 acetylcholinesterase 的抑制劑 Sarin，可以抑制神經傳導，即為第一次世界大戰廣用的神經毒氣，且被日本真理教用做為恐怖活動之工具。

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F2

F2b 

三種酵素抑制機制

本圖與本文中的 圖 2 相同。

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