5  純化策略︰

正確的純化策略極為重要，往往可以使純化達事半功倍之效，因此事前要有極為充分的準備與規劃過程。 但有時對目標酵素所知甚少，就要一步一步去試，可說是摸著石頭過河；此時，要小心追蹤每一個步驟到底回收多少酵素活性？

 5.1  純化步驟設計：

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5.1.1

影響純化的因素

設計純化步驟時，需考慮下列各項要求；右圖則是 Pharmacia 操作手冊所建議的四種考慮因素。

a. 高活性

酵素的 比活性 要能顯著提高，純化成品與原始粗抽液二者間，其比活性之比值稱為 純化倍率 (purification fold)；各種酵素因材料來源及含量多寡不一，純化倍率也有高低；不過就同一樣本而言，當然越高越好。

b. 高回收率

一般指總活性的回收，最終回收率低於 30% 就得檢討過程是否有大問題。

c. 高純度

純度 與 活性 是酵素純化的兩大目的，以達到均質酵素為最終目標；相對而言，在電泳上看不到其它雜質，即可視為均質，但也只能說是 elctrophoretically pure；但絕對均質的酵素幾乎是不可能得到，我們只能達到相對純度者。

d. 方便與快速

方法要儘量簡便，步驟勿拖太久，因為酵素活性可能隨著時間而急速降低；對較不穩定的酵素，時間是最重要因素，有時不得不犧牲其它要求。

e. 經濟

許多試劑相當昂貴 (尤其是活性分析用藥)，大量使用時要考慮經濟問題。

5.1.2

組合純化步驟

a. 組合標準

(1) 已知的酵素，可依照已發表的步驟進行，有問題再作改進。 通常都是以 硫酸銨分劃 - 膠体過濾 - 離子交換 為骨幹，再加上其它方法，組成全部流程。

(2) 對完全未知的酵素，可循此骨幹先試行純化，看其結果如何再加改進。

(3) 不要忘記利用該酵素的特殊性質來純化，如在其 pI 沉澱性、特別的疏水性、有專一的抑制劑或熱穩定性等。

◇ 當然可以組合自己的純化骨幹。

■ 自行組合各種純化方法

b. 純化方法分類

(1) 每種純化方法都是利用蛋白質分子的某種特性來分離的，圖 5.1 把所有的純化方法，依其運用特性分類歸納，以作為設計流程時的參考。

(2) 通常同一個純化方法不會重複使用，最好是交叉使用各種蛋白質的不同性質，來設計一連串的純化步驟。

■ 如何分離這些大小物件？

圖 5.1  各種純化及分析方法及所根據的蛋白質性質 

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 5.2  純化結果：

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a. 純化表

純化結果以 純化表 (purification table) 摘要列出整個過程及結果，例如：

表 5.1  蔗糖合成酵素之純化表： 抽取 100 g 水稻乳熟期穀粒。

b. 檢討純化表

回收率超過 100%  時，表示粗抽取液中可能含有酵素之 抑制因子，或含有干擾活性分析的物質，經去除後酵素活性大增。 若回收顯著偏低，表示此一純化步驟並不理想，應探討緩衝液、溶離液成分有無問題，或者是純化流程設計是否不良。

c. 純度的要求

如上表所純化得到的酵素，以電泳檢定已達相當純度，應可供大多數實驗需要；若有必要，可再經 製備式電泳 或其它方法純化。 請注意並非所有的實驗都必要使用均質酵素，有很多實驗 (如酵素動力學、分子量測定) 都不需完全均質的蛋白質。

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